李 瑩，何順武，曹 平

(1.重慶理工大學 化學化工學院，重慶 400054;2.貴州大學 化學與化工學院，貴陽 550025)

0 引言

鳶尾(Iris)，又名紫蝴蝶、藍蝴蝶、烏鳶，是一種生態(tài)分布極為廣泛、種類繁多、富含酶系統(tǒng)的綠色植物［1］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》［2］指出鳶尾葉中含有抗炎消腫、鎮(zhèn)痛收斂、止血散淤、消化不良等功效的碳酸酚和抗病毒作用的黃酮，有較高的藥用價值［3-9］。正常條件下，植物細胞內(nèi)關鍵酶活性的產(chǎn)生和釋放處于動態(tài)平衡模式，關鍵酶可將有毒物質(zhì)氧化成無毒物質(zhì)，對植物體起保護作用，但隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，氯氟烴類和氯化氮等化學物質(zhì)的大量排放嚴重損壞了臭氧層結(jié)構(gòu)，平流層臭氧的減薄促使UV-B(280～320 nm)輻射增強，導致自由基不斷積累，逐漸降低了綠色植物關鍵酶的活性，對植物的正常生長、代謝和基因轉(zhuǎn)變等造成嚴重影響，已成為了備受關注的熱點問題［10-19］。

UV-B 輻射是影響植物生長的一項指標，它可能改變植物的高度和葉面積，同種植物在UV-B 輻射增強下，植株在形態(tài)方面呈現(xiàn)不同的變化，從而改變種間的相互關系，生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能也會改變。近年的一些研究表明，UV-B 輻射會影響抗壞血酸過氧化物酶(APX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性。當植物受到脅迫時，植物細胞中控制物質(zhì)代謝的關鍵酶首先做出反應。APX、PAL、GR 是植物代謝過程的3種關鍵酶，與植物的抗性密切相關［20-28］。本實驗通過對鳶尾葉片進行UV-B 輻射處理，利用紫外可見分光光度法測定3 種不同UV-B 輻射強度條件下，APX、PAL、GR 酶的活性變化情況，探究酶活性在輻射強度和輻射時間下的影響。

1 實驗部分

1.1 原料與儀器

鳶尾葉片，采自貴州大學民族學院;KH2PO4、Na2HPO4，AR，金維城鉬業(yè)股份有限公司化學分公司產(chǎn)品;硼酸，AR，上海國藥化學試劑公司產(chǎn)品;聚乙烯吡咯烷酮，AR，上海國藥化學試劑公司產(chǎn)品;酚酞指示劑，AR，天津市科密歐化學試劑公司產(chǎn)品;H2O2，AR，上海昆化精細化工有限公司產(chǎn)品;HCl，AR，武漢華翔科潔生物技術有限公司產(chǎn)品;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，AR，上海國藥化學試劑公司產(chǎn)品;研缽，ZH9167，北京中慧天誠科技有限公司;石英比色皿，石英微量，江蘇省宜興市精瑞光學元件廠;低溫離心機，TGL-16M，長沙湘儀離心機儀器有限公司;紫外分光光度計，UV2000，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;恒溫加熱磁力攪拌器，78HW-1，杭州儀表電機有限公司;恒溫水浴鍋，TCKW-D-1，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試劑的配制

緩沖溶液:取10 mL Na2HPO4溶液與90 mL KH2PO4溶液，加入10-4mol/L EDTA-2Na 和去離子水，于25 ℃水浴攪拌下混合均勻，保持酸性pH=7～8，用去離子水補至100 mL，配制0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH=7～8);取1.24 g 硼酸，1.91 g 硼砂，加去離子水混合溶解，配制0.1 mol/L 硼酸鹽緩沖液配制(pH=8.8)。置于4 ℃儲存。

反應溶液:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，抗壞血酸(ASA，現(xiàn)配現(xiàn)用)，H2O2;苯丙氨酸，HCl;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，還原型谷胱甘肽(GSSG)。

1.3 酶液的提取

取新鮮的鳶尾葉片洗凈，切成2 cm×2 cm 的塊片，用去離子水洗滌后用濾紙拭干，將塊片平鋪在濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于同一時間(單位:d)、168、210、252 μw/cm23 種不同的UV-B 輻射及同一輻射強度(單位:μw/cm2)、3 個不同時間段(根據(jù)不同酶處理要求，選擇第3、7、14、21 d 中任3 個時間取樣)下處理24 h，以誘導關鍵酶。將誘導處理的塊片加入液氮研成粉末，按樣本粉末質(zhì)量(g):緩沖液體積(mL)=1∶5～10 加入PVP 溶液中，于恒溫水浴攪拌反應裝置下進行勻漿(注:溫度不超過25 ℃)，將所得勻漿抽氣過濾，濾液10 000 r/min，4 ℃下離心20 min，上清液為酶粗提取液。

1.4 活性的測定

1.4.1 APX 活性測定

取4 支10 mL 試管(3 支測定管A1、A2、A3，1 支對照管A0)，分別加入0.1 mL 酶液(168 μw/cm2)，1.7 mL 磷酸鹽緩沖液(pH=7)，0.1 mL 0.06 mol/L H2O2，0.1 mL 0.03×10-3mol/L ASA(對照管不加，用去離子水代替)。搖勻后置于20 ℃恒溫水浴鍋保溫30 min，利用紫外可見分光光度計在波長290 nm 下測定并記錄10、130 s 的吸光值A0、A1、A2、A3，其中ΔA空=A0-A1，ΔA測=A2-A3。同理，按照相同方法測定同一輻射時間、不同輻射強度與同一輻射強度、不同輻射時間的吸光度值，根據(jù)APX樣本質(zhì)量計算出APX 的活性，即:

式(1)中:HAPX為APX 的活性(U/g);V總為反應體系總體積(mL);V液為酶液體積(mL);n稀為樣品測試前稀釋倍數(shù);ω 為消光摩爾系數(shù);r比色為比色半徑(cm);V取樣為取樣量(mL);m 為樣本鮮重(g);t 為反應時間(min)。

1.4.2 PAL 活性測定

取4 支10 mL 試管(3 支測定管，1 支對照管)，分別加入1.0 mL 酶液(168 μw/cm2)，2.0 mL 硼酸鹽緩沖液(pH=8.8)，1.0 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸(對照管不加，用去離子水代替)，總體積4.0 mL。搖勻后置于30 ℃恒溫水浴鍋中保溫1 h，加入0.2 mL 6mol/L HCl 終止反應，將沉淀離心，用對照管調(diào)零，在290 nm 處檢測測定管與對照管反應液的吸光度，分別記為A測、A對，即ΔA=A測-A對，同理按照相同方法測定同一輻射時間、不同輻射強度與同一輻射強度、不同輻射時間的吸光度值，根據(jù)PAL 樣本鮮重計算PAL 的活性:

式(2)中:HPAL為PAL 的活性(U/g);ΔA=A測-A對;V總為反應體系總體積(mL);V液為酶液體積(mL);V取樣為取樣量(mL);m 為樣本鮮重(g);t為反應時間(min)。

1.4.3 GR 活性測定

取4 支10 mL 試管(3 支測定管，1 支對照管)，分別加入0.2 mL 酶液(168 μw/cm2)，3 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5，含10-3mol/LEDTA)，0.03 mL 3×10-3mol/L 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，0.1 mL 5×10-3mol/L 還原型谷胱甘肽(GSSG)(對照管不加，用去離子水代替，搖勻迅速倒入石英比色皿中，用對照管調(diào)零，紫外分光光度計在340 nm 處比色，30 s 時讀取吸光度值A1;將此比色皿中的比色液倒入原試管中，置37 ℃水浴2 min 后迅速倒入石英比色皿中，210 s時讀取吸光度值A2;求出2 次吸光度值差值ΔA=A1-A2。利用直接測定法測定蛋白質(zhì)濃度:①在紫外分光光度計上將未知蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色皿中，以生理鹽水為對照，測得280、260 nm 波長的吸光度(A280及A260);②為方便起見，對于混合蛋白質(zhì)溶液，可用A280乘以0.75 代替其中蛋白質(zhì)的大致含量(104mg/L)。按照相同方法測定同一輻射時間、不同輻射強度與同一輻射強度、不同輻射時間的吸光度值，根據(jù)樣本蛋白濃度計算出GR 的活性。

式(3)中:HGR為GR 的活性(U/g);ΔA=A1-A2;n稀為樣品測試前稀釋倍數(shù);r比色為比色半徑(cm);m 為樣本鮮重(g);t 為反應時間(min);C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g/L)，C=1.45A280-0.74A260。

2 結(jié)果與分析

2.1 APX 結(jié)果分析

根據(jù)APX 酶活性計算公式對測定結(jié)果處理后，將計算結(jié)果通過Excel 繪制以酶含量(單位:μw/min)為縱坐標，輻射強度(單位:μw/cm2)為橫坐標的APX 含量變化圖1(a)與輻射時間(單位:d)為橫坐標的APX 含量變化圖1(b)。

圖1 APX 含量變化曲線

由圖1(a)可知，當輻射時間相同時，APX 活性隨著輻射強度而增加，對照葉片的APX 活性在第7 d 取樣上升，第14 d 取樣APX 含量隨輻射強度的增強逐漸下降，第21 d 取樣中APX 含量呈現(xiàn)先降低再升高，與對照相比(酶含量持平約為1.18 μw/min)，C 時含量為零，說明低輻射對APX 酶活性產(chǎn)生了脅迫作用。隨UV-B 輻射增加，APX 含量在H 時超過對照，第14、21 d 時，增加UV-B 輻射處理的酶活性均低于對照，活性約0.09 μw/min。圖1(b)中，當輻射強度相同時，隨著輻射時間的增長，APX 活性先略微降低后持平，與對照相比(APX 含量為0.8～1 μw/min)延長輻射時間處理逐漸降低，輻射強度為C 和L 時，APX 含量先升高再下降趨勢，第7 d 取樣C 處理時，APX 含量為零，可能原因是輻射強度與輻射時間對酶活性產(chǎn)生了脅迫作用。輻射強度到達H 時，APX 含量先下降，然后保持平穩(wěn)，APX 含量基本保持在0.1 μw/min。

2.2 PAL 結(jié)果分析

根據(jù)PAL 酶活性計算公式對測定結(jié)果處理后，將計算結(jié)果通過Excel 繪制以酶含量(單位:μw/min)為縱坐標，輻射強度(單位:μw/cm2)為橫坐標的PAL 含量變化圖2(a)與輻射時間(單位:d)為橫坐標的PAL 含量變化圖2(b)。

圖2 PAL 含量變化曲線

由圖2(a)可知:同一輻射時間，PAL 含量隨著輻射強度呈現(xiàn)上升或先升高后降低的趨勢，前期積累PAL，中后期含量下降，后期趨于平衡。第7 d PAL 含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，而第3、21 d取樣PAL 含量一直上升，與對照相比(PAL 含量為0.04～0.05 μw/min)，UV-B 輻射處理有明顯差異(P＜0.05)，證明UV-B 輻射對酶活性有顯著影響;而圖2(b)中，當輻射強度相同時，隨著輻射時間的延長，UV-B 輻射強度為C 時，酶含量先下降再升高，而UV-B 輻射強度為L 和H 時，酶含量均升高，在7 d 取樣時，PAL 酶含量較高且輻射強度為H 時的酶含量高于UV-B 輻射強度C 和L 時的酶含量，第21 d 時，輻射強度為L 時的PAL 含量大于輻射強度為C 和H 的PAL 含量，與對照相比(PAL 含量約為0.007 μw/min)略微上升，最高可達0.12 μw/min。

2.3 GR 結(jié)果分析

根據(jù)GR 酶活性計算公式對測定結(jié)果處理后，將計算結(jié)果通過Excel 繪制以酶含量(單位:μw/min)為縱坐標，輻射強度(單位:μw/cm2)為橫坐標的GR 含量變化圖3(a)與輻射時間(單位:d)為橫坐標的GR 含量變化圖3(b)。

圖3 GR 含量變化曲線

由圖3(a)可知，輻射時間一定，GR 含量隨著UV-B 輻射強度增強有較大的變化，第3、21 d 取樣中，GR 含量呈現(xiàn)大幅度降低的趨勢，輻射強度為L 時，第3 d 取樣中，GR 含量出現(xiàn)負值，可能是短時間的輻射時間對GR 酶活性產(chǎn)生了脅迫作用，第7 d 取樣中，GR 含量逐漸下降，與對照相比(GR 含量為0.02～0.04 μw/min)，3 個不同時間段取樣時，低輻射強度對GR 活性較為有利;圖3(b)中，當輻射強度相同，輻射時間逐漸延長時，3 種輻射強度下的GR 含量隨著取樣時間變化的幅度較大，低輻射時，3 個時間段的GR 含量較高，但趨于急速下降形勢，UV-B 輻射強度為C 時，第7 d 取樣中GR 的含量相對較好，UV-B 輻射強度為L 時，GR 活性表現(xiàn)為第7 d 取樣＞對照組＞第21 d 取樣＞第3 d 取樣，輻射強度L 處，第3 d 取樣分析時，GR 含量為零，可能是ASA 被還原，存在高輻射短時間等，造成GR 酶活性受到了脅迫，導致酶失活。第21 d 取樣時，3 種不同UV-B 輻射強度處理下，GR 含量在0.01～0.3 μw/min 范圍，與對照組(GR 含量約為0.02 μw/min)有顯著差異(P＜0.01)，第3、21 d 取樣中，GR 活性均大于第7 d，高輻射強度對GR 活性有脅迫作用。

3 結(jié)論

1)鳶尾葉中酶的活性與其逆境條件(輻射強度)和脅迫時間(輻射時間)有關。從酶活性的變化過程可以看出，低UV-B 輻射強度時，APX、PAX酶活性受到抑制，隨著時間的延長，植物形成相應的防御機制，酶活性出現(xiàn)升高趨勢，而低UV-B 輻射強度時，GR 酶活性較好，這與自身攜帶的苯丙氨酸衍生物關系密切。

2)在輻射時間不變、輻射強度變化時，不同輻射強度梯度下，在輻射強度為C(168 μw/cm2)時，鳶尾葉GR 酶的活性最好，而APX、PAL 酶在輻射強度為H(252 μw/cm2)時活性相對較好。由此發(fā)現(xiàn)鳶尾植物中不同的酶抗輻射能力不同，其中APX、PAL 酶的抗輻射能力處在較高水平，能夠接受較強的輻射;而GR 酶的抗輻射能力最弱，不能夠承受高強度的輻射脅迫。

3)在輻射強度不變、輻射時間變化時，不同輻射時間梯度下，APX 酶在第14 d 取樣時，酶含量最高，活性最好，而GR、PAL 酶在第7 d 取樣時，酶含量相對較高，活性相對較好。由此發(fā)現(xiàn)鳶尾葉中關鍵酶活性和輻射時間的關系為在中等輻射時間段酶的活性較好，生長發(fā)育過程中等階段的輻射有利于生長，而短時間或長時間的輻射下，酶的含量較低，不適于鳶尾的生長發(fā)育。

4)對試驗測定結(jié)果整理分析發(fā)現(xiàn)，APX 含量在輻射強度為C(168 μw/cm2)與輻射為L(210 μw/cm2)時為零;GR 含量在輻射時間第3 d 時為零，說明過低的輻射強度對APX 酶活性產(chǎn)生了脅迫作用，導致酶失活;同理，短時間的輻射時間對GR 酶活性產(chǎn)生了脅迫作用，導致植物中的酶在相應階段失活。

5)鳶尾植物中不同酶對輻射強度的響應機制不同，在不同的處理時間段，活性會產(chǎn)生不同的變化，與其體內(nèi)保護酶系統(tǒng)的活力及抗氧化物質(zhì)含量等有關。