趙 靜，郭小利，金盛宇，王 宇，劉中華

(南京師范大學，生命科學學院，江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室，南京 210000)

0 引言

真菌細胞壁是真菌特有的細胞器，主要由幾丁質、葡聚糖和蛋白質等組分組成［1-2］。近年來，侵襲性真菌感染已經嚴重威脅人類的生命健康，通過抑制或干擾真菌細胞壁的合成過程能夠有效地抑制真菌的感染，因此以真菌細胞壁組分或以細胞壁合成相關酶為靶點的抗真菌藥物也逐漸成為研究熱點［3］。在真菌細胞壁合成的過程中，剛性的細胞壁在細胞壁重構酶的作用下獲得可塑性，并在細胞膨壓的作用下擴張［4］。本課題組圍繞真菌細胞壁的擴張機制開展研究。本課題組在研究中發(fā)現，在模式擔子菌灰蓋鬼傘中，幾丁質酶和葡聚糖酶參與細胞壁的重構［5-6］。其中，幾丁質酶CcChiE1 通過水解細胞壁中的幾丁質參與灰蓋鬼傘子實體菌柄伸長生長過程中的細胞壁擴張，在子實體發(fā)育過程中起重要作用［5］。

構巢曲霉(Aspergillus nidulans)是絲狀模式真菌，也是一種重要的人類條件致病真菌［7-8］。在構巢曲霉的生長發(fā)育過程中，幾丁質酶是否參與細胞壁重構尚不清楚。本研究分析構巢曲霉中與細胞壁擴張蛋白CcChiE1 同源的幾丁質酶，利用生物信息工具分析其結構信息，檢測其在構巢曲霉生長過程中的表達量變化規(guī)律，利用大腸桿菌(Escherichia coli)重組表達系統(tǒng)并純化該蛋白，初步分析其酶學性質，以探究其是否有可能通過水解幾丁質參與構巢曲霉生長過程中的細胞壁重構，希望能以曲霉細胞壁重構酶為靶點，為抗真菌藥物的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質粒及菌株的構建

A.nidulans FGSC A4 菌株用YMM 培養(yǎng)基(酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，尿苷1.2 g，尿嘧啶1.1 g，Ribo 1 mL，Trace element 1 mL，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g，115 ℃滅菌20 min)培養(yǎng)。E.coli DH5α 或Rosetta 菌株使用LB 培養(yǎng)基(酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂15 g，115 ℃滅菌20 min，待其冷卻至50 ℃左右時視需要加入Kanamycin 50 mg/L 或Chloromycetin 34 mg/L)。質粒pET28a(+)購自Novagen。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建

在Aspergillus Genome Database 中查找到A.nidulans 中幾丁質酶的蛋白序列，從National Center for Biotechnology Information 查找得到灰蓋鬼傘幾丁質酶ChiE1、ChiIII 的蛋白質序列，利用MEGA5 軟件通過鄰位相接法構建系統(tǒng)進化樹。構巢曲霉幾丁質酶的蛋白序列編號分別為:AN11059、AN11063、AN5454、AN0299、AN0509、AnChiB(AN4871)、An-ChiC(AN9390)、AN0221［9-13］，灰蓋鬼傘幾丁質酶蛋白序列登錄號分別為:CcChiE1(XP_001841026.2)、CcChiIII(XP_001828436.2)。

1.3 結構鑒定

使用NCBI Conserved domain search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對A.nidulans 幾丁質酶ChiB 的蛋白質結構域分析［14］，SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)對AnChiB 的信號肽序列進行預測［15］，蛋白的二級結構通過PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測，三維模型結構通過I-TASSER 分析預測，選取得分較高的預測結構并進一步通過TM-alia 進行準確地分析和鑒定。

1.4 實時熒光定量PCR 檢測

將A.nidulans 的孢子接種于YMM 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間，收取培養(yǎng)的菌絲使用液氮進行快速冷凍，用柱式真菌總RNA 快速抽提純化試劑盒(上海，生工)提取總RNA，用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆轉錄試劑盒(南京，諾唯贊)去除總RNA 的DNA 并進行逆轉錄，用ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix(High ROX Premixed)定量試劑盒(南京，諾唯贊)對cDNA 進行定量擴增。以 A.nidulans 的 actin(AN6542)作為內參基因，利用2-ΔΔCT法獲得An-ChiB 在曲霉不同時間點的表達量。

定量PCR 引物為:Q-actin-F:GTATGTGCAAGGCCGGTTTC;Q-actin-R:TCATCACCGACGTAGGAG TCC。Q-ChiB-F:CAGGCCAGAGACTGGCGAAG;QChiB-R:CAAGCCCAGCTGCTTGACG。

1.5 基因的克隆與重組表達

以A.nidulans FGSC A4 的幾丁質酶ChiB(Gen-Bank 編號AN4871)的cDNA 序列為模板，委托南京思普金生物公司參照E.coli 的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化和全基因合成。將該序列連接到pET28a(+)的NdeI 和HindIII 酶切位點之間，得到重組表達質粒pET28a(+)-AnChiB。將該質粒轉染至E.coli DH5α 感受態(tài)細胞中，利用引物AnChiBF/R(AnChiB-F:GCGCGGCAGCCATATGATGAGTGGTTATAAGACCGTTGGTT;AnChiB-R:AGTGCGGCCGCAAGCTT TTAGCTGCTCGGAAAGCCG)對轉化子進行驗證。挑選陽性克隆培養(yǎng)，并用SanPrep 柱式質粒小量抽提試劑盒(上海，生工)抽提質粒送往南京生工生物公司對質粒進行測序，測序結果與AnChiB 的cDNA 序列進行比對。將測序正確的質粒pET28a(+)-AnChiB 導入原核表達系統(tǒng)的宿主菌E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，獲得重組菌株pET28a(+)-AnChiB/E.coli Rosetta。

重組菌的誘導表達采用乳糖操縱子誘導表達模型，將重組菌株pET28a(+)-AnChiB/E.coli Rosetta 接種至5 mL LB (Kana/Chl)液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm 搖床中培養(yǎng)12 h 后，取1 mL 菌液接種至100 mL LB (Kana/Chl)液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，待菌液的OD600培養(yǎng)至0.8～1.2 時，向菌液中加入終濃度為0.1 mM 的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h 以完成誘導。

離心收集誘導后的菌體用50 mM pH 6.0 的Bis-Tris 緩沖液重懸至20 mL，參照ProteinIsoTM Ni-NTA Resin(北京，TransGen Biotech 公司)的說明書破碎菌體，并利用鎳離子親和層析柱對重組的AnChiB 蛋白進行分離純化。收集純化后的酶液，與蛋白上樣緩沖液混合后于100 ℃下加熱10～15 min，待冷卻后進行充分混勻并上樣至12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳［16］。

1.6 水解酶活性測定

以幾丁質粉末(chitin powder)，膠態(tài)幾丁質(colloidal chitin)，85% 殼聚糖(85% deacetylated chitosan)，75%殼聚糖(75% deacetylated chitosan)以及乙二醇幾丁質(glycol chitin)、乙二醇殼聚糖(glycol chitosan)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物，檢測重組表達酶AnChiB 對不同底物的水解酶活性。200 μL 反應體系中含有0.5%的底物、50 mM pH 5.0 的醋酸鈉緩沖液和適量的酶液。反應體系充分混合后37 ℃反應4 h。反應結束后用DNS 法檢酶活性［17］。1 個酶活單位(U)定義為:在一定反應條件下，每分鐘釋放1.0 μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量。

測定不同pH 對AnChiB 酶活性影響時，反應體系中加入不同pH 的緩沖液進行測定，將酶活最大時的pH 條件下的酶活記為100%，計算不同pH條件下的相對酶活并以百分數表示。

2 結果

2.1 AnChiB 的同源性與蛋白結構分析

本課題組前期的研究成果顯示，灰蓋鬼傘的幾丁質酶ChiE1 和ChiIII 誘導真菌細胞壁擴張，ChiE1 在子實體發(fā)育過程中起關鍵作用［5］。利用MEGA 軟件，用鄰位相接法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析構巢曲霉中的8 個幾丁質酶與灰蓋鬼傘幾丁質酶ChiE1、ChiIII 的蛋白質序列的同源關系。An-ChiB 的結構分析結果見圖1。結果顯示，AnChiB、AN5454 與灰蓋鬼傘ChiE1 處于同一分枝，An-ChiB、AN5454 與CcChiE1 親緣關系較近，見圖1(a)。蛋白序列比對分析顯示，AnChiB 與CcChiE1的同源性為43.37%(Max Score=400)，AN5454與CcChiE1 的同源性為38.22% (Max Score=363)。選擇 AnChiB 做進一步分析和研究，AN5454 的研究將另外開展。

AnChiB(AN4871)的蛋白質序列由446 個氨基酸殘基組成。使用NCBI Conserved domain search 分析顯示，AnChiB 含有一個糖基水解酶家族18 幾丁質酶結構域(氨基酸殘基55—395，GH18_chitinase domain，cd06548)，表明其屬于GH18_chitinase 二型(type II)幾丁質水解酶［18］。使用SignalP 4.1 Server 分析顯示，AnChiB 的N 端第1—18 氨基酸殘基為信號肽。由PSIPRED 預測該蛋白的二級結構后顯示，AnChiB 的信號肽由α螺旋和少部分的無規(guī)則卷曲組成，在整個蛋白結構中，α 螺旋占31.83%(粉色)，β 折疊占15.02%(黃色)，無規(guī)則卷曲占53.14%，見圖1(b)。利用I-TASSER 預測AnChiB 的三維結構，結果表明An-ChiB 的蛋白質三維結構為由8 個α-螺旋(α-helice)(藍色)和8 個β-折疊(β-strand)(紅色)組成的(β/α)8TIM 桶狀結構，催化位點D164、D166和E168 位于第4 個β-折疊上;在第7 個α-螺旋和β-折疊間存在一個插入序列(黃色)，與桶狀結構形成一條狹長的底物結合溝，底物結合位點(W43，W83，W95，W128，W238，W372，F260)延底物結合溝分布(C-score=0.23)，見圖1(c)和圖1(d)。

圖1 AnChiB 的結構分析結果

2.2 AnChiB 的SDS-PAGE 鑒定及酶活測定

按照前述方法構建得到重組表達菌株pET28a(+)-AnChiB/E.coli Rosetta，經測序驗證克隆重組的AnChiB 基因與NCBI 中報道的該基因的cDNA序列完全一致。SDS-PAGE 分析顯示，與空載對照菌株相比，誘導表達后重組表達菌株的上清中增加了一條大小約為45 kDa 的蛋白條帶。利用鎳離子親和層析柱對粗酶液進行分離純化后，得到一條大小約為45 kDa 的蛋白條帶。純化后的蛋白濃度為0.88 mg/mL，見圖2(a)。圖2(a)中:M 表示蛋白Marker;1 代表空載對照上清;2 代表AnChiB重組表達上清;3 代表純化的酶。

分析AnChiB 對不同底物的水解酶活性，其結果顯示，AnChiB 可以水解晶體幾丁質、膠態(tài)幾丁質、乙二醇幾丁質和85%脫乙?；瘹ぞ厶?，不能水解75%脫乙酰化殼聚糖、乙二醇殼聚糖和羧甲基纖維素，同時AnChiB 的最適底物是膠態(tài)幾丁質(表1)。分析AnChiB 的最適pH 值，結果顯示在pH 值為5.0 時，AnChiB 的水解酶活性達到最高，偏酸或偏堿都會導致酶活下降，在pH 值為8.0～9.0 的條件下，水解酶活性將會降低至最大酶活的40%以下，見圖2(b)。

表1 幾丁質酶AnChiB 的底物特異性情況

圖2 AnChiB 的重組表達純化及最適pH 分析結果

2.3 AnChiB 在構巢曲霉生長不同階段的表達量水平

為了分析AnChiB 在構巢曲霉生長不同階段的表達量情況，分別收集了培養(yǎng)0、6、12、24、48、72和96 h 的菌體，提取RNA，逆轉錄獲得cDNA，利用實時熒光定量PCR 檢測AnChiB 在不同樣本中的表達量。實驗結果顯示，在培養(yǎng)6 h 后，AnChiB的表達量明顯上升，是0 h 時表達量的4.20 倍，見圖3。在第12、24 h，AnChiB 的表達量分別為0 h的2.44 倍和5.56 倍，與6 h 相比無顯著差異(圖3)。在第48 h，AnChiB 的表達量顯著增加，與0 h相比上升34.91 倍，與6 h 相比上升7.54 倍，并達到最高值(圖3)。AnChiB 的表達量在72 h和96 h下降，降低到0 h 的3.58 和2.90 倍(圖3)。圖3中，＊＊＊表示差異極顯著(p＜0.001)。

圖3 AnChiB 在構巢曲霉生長不同階段的相對表達量水平

3 討論

本課題組在前期研究中以擔子菌模式生物灰蓋鬼傘為研究對象，揭示了幾丁質酶在真菌細胞壁擴張過程中起重要作用［5-6］。但在子囊菌中哪個幾丁質酶參與細胞壁擴張尚不清楚。故而，本研究以絲狀真菌模式生物構巢曲霉為研究對象，通過序列同源性分析和比對，確定在構巢曲霉中幾丁質酶ChiB 與灰蓋鬼傘細胞壁擴張蛋白幾丁質酶ChiE1 的同源度最高。進一步結構分析顯示，AnChiB 與CcChiE1 的蛋白質結構具有較高的相似性:首先，2 個幾丁質酶都具有N 端信號肽，定位在胞外空間;第二，2 個幾丁質酶的三維結構高度相似，都具有一個狹長的底物結合溝。由于具有相似的結構，AnChiB 與灰蓋鬼傘細胞壁擴張蛋白幾丁質酶ChiE1 也具有相似的酶學性質:①2個幾丁質酶都具有水解晶體幾丁質的活性，前期研究表明，具有水解晶體幾丁質活性的幾丁質酶往往具有誘導細胞壁擴張的能力;②2 個幾丁質酶的最適pH 值均為5.0，這與真菌生長發(fā)育的最適pH 值一致［19］。有文獻報道，AnChiB 在構巢曲霉的衰亡期高表達并參與菌絲的自溶［12］。本研究的結果表明:AnChiB 在構巢曲霉的衰亡期(48 h)達到最高;但在構巢曲霉菌絲生長初期(6 h)，AnChiB 的表達量即明顯上升。AnChiB 可能參與構巢曲霉的菌絲生長，并參與細胞壁的擴張。但由于構巢曲霉的菌絲生長為頂端生長，其生長區(qū)域非常微小，需要的細胞壁擴張蛋白較微量，所以，AnChiB 在菌絲生長初期的表達量雖然顯著上升，但上升幅度不大［20-21］。

4 結論

構巢曲霉AnChiB 具有真菌細胞壁擴張蛋白的特征:①定位在胞外空間;②具有典型的底物結合溝;③具有水解晶體幾丁質的活性等。本研究提示:AnChiB 不僅參與構巢曲霉菌絲的自溶，還可能參與菌絲生長過程中的細胞壁擴張。為進一步研究AnChiB 的生理功能，以及絲狀真菌的細胞壁擴張機制提供了數據支持，希望能為以曲霉細胞壁重構酶為靶點的抗真菌藥物的研發(fā)提供新的思路。