艾 佳，呂 楊，鐘 雄，李彥澄,2，李 江,2，楊愛江,2

(1：貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，喀斯特地質(zhì)資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025) (2：貴州喀斯特環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)教育部野外科學(xué)觀測(cè)研究站，貴陽 550025)

甲烷是僅次于二氧化碳的第二大溫室氣體，在大氣中的含量呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]. 大氣中甲烷的來源主要有兩大途徑，即自然源和人為源. 據(jù)估計(jì)，全球生態(tài)系統(tǒng)每年向大氣中釋放的甲烷總量約為500～600 Tg[2]. 濕地是一種被人們稱為“地球之腎”的生態(tài)系統(tǒng)，國(guó)際《濕地公約》(拉姆薩爾公約)將濕地定義為：天然或人工，長(zhǎng)久或暫時(shí)的沼澤地、濕原、泥炭地或水域地帶，靜止或流動(dòng)，淡水或半咸水體，包括低潮時(shí)不超過6 m的水域[3]. 而貴州草海湖泊最大水深5.0 m，平均水深2.4 m[4]，屬于天然的淡水湖泊濕地[5]，其在保護(hù)生態(tài)環(huán)境及維持生物多樣性等方面可發(fā)揮重要作用[6]. 雖然全球濕地面積僅占全球陸地總面積的 5%～8%，但濕地所釋放出的甲烷量卻約占全球甲烷排放總量的30%[7-8]，這是由于濕地中存在植物根系代謝物或植物殘?bào)w，這些物質(zhì)會(huì)變成產(chǎn)甲烷微生物的底物，從而為甲烷的產(chǎn)生創(chuàng)造有利條件.

甲烷氧化菌是目前研究得較為成熟的一類功能細(xì)菌群[9]，其可作為濕地生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物過濾器，能夠利用甲烷作為其唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)[10]. Hornibrook等[11]研究了濕地有氧土層中甲烷氧化菌氧化甲烷的能力，發(fā)現(xiàn)其可以消耗掉自然濕地產(chǎn)出的90%的甲烷. 因此，甲烷氧化菌對(duì)于大氣甲烷的收支平衡及穩(wěn)定大氣中甲烷濃度具有十分重要的作用. 英國(guó)[12]、俄羅斯[13]以及歐洲大陸[14-15]的許多研究者們對(duì)濕地中甲烷氧化菌的多樣性進(jìn)行了研究. 國(guó)內(nèi)對(duì)濕地甲烷氧化菌的研究起步較晚，但近幾年來關(guān)于國(guó)內(nèi)濕地中甲烷氧化菌的研究也取得了許多進(jìn)展. 例如：Deng等[16]研究了青藏高原泥炭濕地中的甲烷氧化菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)Methylocystis是該地區(qū)甲烷氧化菌的優(yōu)勢(shì)菌種；Yun等[17]研究了東北松寧平原向海濕地沉積物中的甲烷氧化菌，并獲得了該地區(qū)甲烷氧化菌多樣性和豐度分布的第一個(gè)數(shù)據(jù)集；Liu等[18]研究了中國(guó)某富營(yíng)養(yǎng)化濕地中的挺水植物中TypeⅠ型甲烷氧化菌的特性，發(fā)現(xiàn)該類甲烷氧化菌有望在富營(yíng)養(yǎng)化濕地的碳、氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用. 由此可知，目前對(duì)濕地中甲烷氧化菌的研究主要集中在基于16S rRNA測(cè)序和qPCR等技術(shù)上的微生物群落多樣性、豐度及分布特征等方面，而對(duì)甲烷氧化菌的功能基因和代謝功能方面的研究較少，尤其是對(duì)環(huán)境樣品中的甲烷氧化菌的種類與功能的相關(guān)性方面，鮮見報(bào)道. 因此，基于宏基因組學(xué)技術(shù)，以貴州草海的淺水沼澤、莎草濕地、深水沉積物為研究對(duì)象，對(duì)不同類型濕地中甲烷氧化菌的群落特征進(jìn)行研究，并結(jié)合功能基因、代謝功能、物種與功能的相關(guān)性和關(guān)鍵環(huán)境因子進(jìn)行分析，為進(jìn)一步理解高原濕地中的物質(zhì)循環(huán)及減緩溫室效應(yīng)提供理論依據(jù)，同時(shí)為保護(hù)濕地、了解及開發(fā)濕地微生物資源提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況及樣品的采集

草海(26°47′32″～26°52′52″N，104°10′16″～104°20′40″E)是由喀斯特盆地積水發(fā)育而形成的一個(gè)完整的、典型的喀斯特高原濕地生態(tài)系統(tǒng)，也是地球上同緯度地區(qū)中為數(shù)不多的高原天然淡水湖泊. 地處云貴高原中部烏蒙山脈腹地，位于中國(guó)貴州省西北邊緣，威寧彝族回族苗族自治縣縣城西南側(cè)，面積96 km2，其中水域面積25 km2，湖面海拔2171.7 m. 草海因水草豐茂而得名，是貴州省最大的天然高原淡水湖泊，同時(shí)也是中國(guó)面積最大的巖溶構(gòu)造湖，素有“高原明珠”之稱.

于2020年10月下旬，在草海濕地中的淺水沼澤、莎草濕地及深水域進(jìn)行采樣(圖1)，每個(gè)樣點(diǎn)選取0.3 m×0.3 m作為1個(gè)樣方，每個(gè)樣方內(nèi)隨機(jī)采集2～3個(gè)點(diǎn)樣品，采集0～10 cm的表層沉積物，然后將其進(jìn)行混合，共7個(gè)樣品，其中，淺水沼澤樣品3個(gè)，莎草濕地樣品2個(gè)、深水域沉積物2個(gè). 每個(gè)樣品分為2份，一份裝入50 mL滅菌離心管后立即放入干冰桶(-80℃)中，用于宏基因組分析；另一份裝入自封袋中，冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，用于理化指標(biāo)分析.

圖1 草海采樣點(diǎn)分布Fig.1 Distribution of sampling sites in Lake Caohai

1.2 理化指標(biāo)分析

上覆水pH、氧化還原電位(ORP)采用便攜式多參數(shù)測(cè)定儀進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量. 沉積物根據(jù)賀蓓等[19]的方法分析pH值和電導(dǎo)率(EC)，將沉積物與水按5∶1的比例混合后，采用HACH多參數(shù)數(shù)字化分析儀(HQ40d)進(jìn)行測(cè)量；總氮(TN)采用《土壤質(zhì)量全氮的測(cè)定凱氏法(HJ717-2014)》進(jìn)行分析；總磷(TP)采用《土壤總磷的測(cè)定堿熔-鉬銻抗分光光度法(HJ 632-2011)》進(jìn)行分析；有機(jī)質(zhì)(SOM)參考鮑士旦《土壤農(nóng)化分析(第三版)》重鉻酸鉀法進(jìn)行分析；根據(jù)楊葉琴等[20]的方法利用離子色譜(ICS-1100)分析陰離子種類和濃度.

1.3 宏基因組分析

將采集的沉積物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒(MP bio, CA, USA)對(duì)DNA進(jìn)行抽提，利用NanoDrop2000法和Quantus Fluorometer法分別檢驗(yàn)DNA的純度和濃度，利用1%的瓊脂糖膠對(duì)DNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)，然后將檢測(cè)合格并純化后的片段進(jìn)行剪切(約400 bp)、接頭連接，并使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集，磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終文庫(kù). 完成文庫(kù)構(gòu)建后進(jìn)行橋式PCR，最后在IlluminaNovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序. 測(cè)序后使用fastp進(jìn)行質(zhì)量數(shù)據(jù)控制，然后將不同測(cè)序深度序列使用Megahit軟件[21]進(jìn)行拼接組裝，使用MetaGene[22]對(duì)拼接結(jié)果中的contigs進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)，并將其翻譯為氨基酸序列. 使用CD-HIT軟件[23]將所有樣品中預(yù)測(cè)出來的基因序列進(jìn)行聚類(默認(rèn)參數(shù)為：90% identity, 90% coverage)，構(gòu)建非冗余基因集. 使用BLASTP[24]將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫(kù)(BLAST比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值(e-value)為1×10-5)，以獲得各個(gè)分類學(xué)水平上物種在各個(gè)樣本中的豐度；使用KOBAS2.0[25]進(jìn)行KEGG功能注釋，然后基于KO、Pathway、EC(酶通路)、Module對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該功能類別的豐度.

1.4 數(shù)據(jù)分析

本文基于物種類型共建立兩個(gè)基因集：一是草海細(xì)菌基因集，該基因集包含本研究樣本中的所有細(xì)菌的基因，用于分析草海整體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；二是草海甲烷氧化菌基因集，該基因集僅包含本研究樣本中甲烷氧化菌的基因，且本文對(duì)甲烷氧化菌所進(jìn)行的分析均基于草海甲烷氧化菌基因集. 基于R語言對(duì)樣本進(jìn)行PCoA(principal co-ordinates analysis)分析，基于Python軟件的Networkx工具包，構(gòu)建物種與功能的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物理化指標(biāo)

表1 草海不同類型濕地上覆水及沉積物的理化性質(zhì)

2.2 草海不同濕地類型中微生物的群落組成

對(duì)7個(gè)樣品的reads進(jìn)行過濾處理，共獲得318690876條clean reads，每個(gè)樣品的reads數(shù)目范圍為41542722～50006378. 質(zhì)控后的reads占原始數(shù)據(jù)reads的平均百分比為98%. 對(duì)contigs進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)contigs長(zhǎng)度超過1000 bp的平均數(shù)目和平均N50分別為19044和523 bp，說明組裝結(jié)果及序列長(zhǎng)度可用.

基于草海細(xì)菌基因集，將草海不同濕地類型中的微生物進(jìn)行物種注釋. 結(jié)果顯示，注釋到的細(xì)菌分為82個(gè)門、136個(gè)綱、251個(gè)目、472個(gè)科、1876個(gè)屬、11661個(gè)種. 在屬水平上(圖2)，淺水沼澤中的優(yōu)勢(shì)菌屬為類諾卡氏屬(Nocardioides，4.30%)、大豆根瘤菌屬(Bradyrhizobium，3.29%)和厭氧粘細(xì)菌(Anaeromyxobacter，2.92%). 莎草濕地中的優(yōu)勢(shì)菌屬與淺水沼澤一致，只是相對(duì)豐度不同，分別為類諾卡氏屬(3.53%)、大豆根瘤菌屬(4.80%)和厭氧粘細(xì)菌(2.90%). 深水沉積物中的優(yōu)勢(shì)菌屬為硫桿菌屬(Thiobacillus，3.07%)、莢硫菌屬(Thiocapsa，1.58%)和互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter，1.35%). 這說明淺水沼澤和莎草濕地的優(yōu)勢(shì)菌屬相同，主要為參與碳循環(huán)和氮循環(huán)的微生物，而深水沉積物中的優(yōu)勢(shì)菌屬存在差異，主要為參與碳循環(huán)和硫循環(huán)的微生物.

此外，在細(xì)菌域中，草海不同類型濕地中的甲烷氧化菌在CH1～CH7中的占比分別為0.06%、0.07%、0.10%、0.05%、0.06%、0.30%和0.21%，可看出在草海濕地微生物中，甲烷氧化菌在各個(gè)樣本中的相對(duì)豐度占比較小. 對(duì)于甲烷氧化菌來說，深水域沉積物中甲烷氧化菌的相對(duì)豐度較大，而其他兩種類型濕地中甲烷氧化菌的相對(duì)豐度較小.

圖2 屬水平下草海不同濕地類型中細(xì)菌和甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)特征Fig.2 Community structure characteristics of bacteria and methanotrophs in different types of wetlands in Lake Caohai at the genus level

2.3 草海不同濕地類型中甲烷氧化菌的群落組成

基于草海甲烷氧化菌基因集，將草海不同濕地類型中的甲烷氧化菌進(jìn)行物種注釋. 結(jié)果顯示，注釋到的甲烷氧化菌分為3個(gè)門、4個(gè)綱、4個(gè)目、6個(gè)科、14個(gè)屬、56個(gè)種. 在屬水平下(圖3)，淺水沼澤中的優(yōu)勢(shì)甲烷氧化菌為甲基桿菌屬(Methylobacter，0.0112%)、反硝化型厭氧甲烷氧化菌(Candidatus_Methylomirabilis，0.0111%)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis, 0.0093%)、甲基單胞菌屬(Methylomonas，0.0087%)、甲基暖菌屬(Methylocaldum，0.0051%). 莎草濕地和深水域沉積物中的優(yōu)勢(shì)甲烷氧化菌與淺水沼澤相似，但莎草濕地中疣微門甲烷氧化菌(Methylacidiphilum，0.0003%)的相對(duì)豐度較低，深水域沉積物中的甲烷氧化菌豐度高于淺水沼澤和莎草濕地，分別為甲基桿菌屬(Methylobacter，0.0788%)、甲基單胞菌屬(Methylomonas，0.0434%)、甲基暖菌屬(Methylocaldun，0.0246%)、甲基微球菌屬(Methylomicrobium，0.0262%)、甲基球菌屬(Methylococcus，0.0181%). 雖然在草海不同類型的濕地中都檢測(cè)到了反硝化型厭氧甲烷氧化菌的存在，但其相對(duì)豐度均較小. 以上結(jié)果說明了草海濕地中的甲烷氧化菌主要屬于TypeⅠ型，且草海濕地中甲烷氧化菌氧化甲烷的過程主要為好氧氧化.

圖3 屬水平下草海不同濕地類型中甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)特征Fig.3 Community structure characteristics of methanotrophs in different types of wetlands in Lake Caohai at the genus level

2.4 草海濕地中甲烷氧化菌的碳、甲烷、氮、硫代謝功能基因

基于草海甲烷氧化菌基因集，將其與KEGG的基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，BLAST比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值為1×10-5. 結(jié)果顯示，草海甲烷氧化菌基因集中，與碳代謝相關(guān)的功能基因共9種，分別為異檸檬酸脫氫酶(NAD+)基因IDH3(K00030)、檸檬酸合成酶基因ghA(K01681)、烏頭酸水合酶基因acnA(K01681)、蘋果酸脫氫酶基因mdh(K00024)、2-氧戊二酸脫氫酶基因sucA(K00164)、琥珀酸脫氫酶基因frdA(K00239)、二氫脂胺脫氫酸酶基因pdhD(K00382)、I類富馬酸脂水合酶基因fumA(K01676)、Ⅱ類富馬酸脂水合酶基因fumC(K01679)；與甲烷代謝相關(guān)的功能基因共3種，分別為顆粒性甲烷單加氧酶基因pmoA(K10944)、可溶性甲烷單加氧酶基因mmoX(K16157)、甲醇脫氫酶基因mxaF(K14028)；與氮代謝相關(guān)的功能基因共6種，分別為固氮酶基因nifD、nifH、nifK(K02586、K02588、K02591)、亞硝酸還原酶大亞基基因nirB(K07708)、亞硝酸還原酶基因nirK(K00368)、硝酸鹽還原酶基因narG(K00370)；與硫代謝相關(guān)的功能基因共4種，分別為亞硫酸還原酶基因cysJ(K00380)、腺苷硫酸鹽合成酶基因cysC(K00860)、硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因cysD(K00957)、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白酶基因cysA(K02045). 以上結(jié)論說明草海甲烷氧化菌基因集中，碳代謝功能基因主要與三羧酸(TCA，tricarboxylic acid cycle)循環(huán)有關(guān)，甲烷代謝的功能基因主要與甲烷的氧化有關(guān)，氮代謝的功能基因與固氮和反硝化作用相關(guān)，硫代謝的功能基因與同化硫酸鹽還原、硫酸鹽運(yùn)輸和硫酸鹽異化還原有關(guān).

2.5 草海不同類型濕地中甲烷氧化菌的功能

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)草海甲烷氧化菌基因集進(jìn)行注釋(圖4)，結(jié)果顯示草海甲烷氧化菌基因集共注釋到6大類功能. 其中，豐度最大的功能是代謝(63.97%)，其次是環(huán)境信息處理(10.65%)、遺傳信息處理(8.21%)、細(xì)胞過程(7.22%)、人類疾病(6.62%)、組織系統(tǒng)(3.33%). 對(duì)代謝中的碳代謝、甲烷代謝、氮代謝和硫代謝的完整路徑進(jìn)行了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)存在11條與碳代謝相關(guān)的完整路徑，分別為：Embden-Meyerhof途徑(M00001)、涉及三碳化合物的核心模塊的糖酵解(M0002)、丙酮酸氧化(M00307)、TCA循環(huán)(M00009)、第一次碳氧化(M00010)、第二次碳氧化(M00011)、磷酸戊糖循環(huán)(M00004)、磷酸戊糖氧化相途徑(M00006)、磷酸戊糖非氧化相途徑(M00007)、5-磷酸核糖-1-焦磷酸生物合成(M00005)、Entner-Doudoroff途徑(M00008)；存在2條與甲烷代謝相關(guān)的完整路徑，分別為：甲烷氧化(M00174)和單磷酸核酮糖途徑同化甲醛(M00345)；存在4條與氮代謝相關(guān)的完整路徑，分別為：固氮(M00175)、異化硝酸鹽還原(M00530)、硝化(M00528)、完全硝化(M00804)；僅存在1條與硫代謝相關(guān)的完整路徑，即：同化硫酸鹽還原(M00176).

圖4 基于KEGG下的草海甲烷氧化菌中的各項(xiàng)功能類別及豐度Fig.4 Based on the functional categories and abundances of Lake Caohai methanotrophs under KEGG

2.6 草海不同類型濕地沉積物中物種及功能的PCoA分析

在屬水平下利用Bray Curtis算法對(duì)草海不同類型濕地沉積物中的甲烷氧化菌進(jìn)行物種(圖5a)和功能(圖5b)的PCoA(principal co-ordinates analysis)進(jìn)行分析. 采樣點(diǎn)與采樣點(diǎn)之間在PCoA圖中距離越近，說明這些采樣點(diǎn)中的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能越類似[26]. 在淺水沼澤和莎草濕地中，其物種結(jié)構(gòu)和功能的距離均最近，而深水沉積物中的物種結(jié)構(gòu)和功能與淺水沼澤和莎草濕地距離較遠(yuǎn)，說明在草海濕地系統(tǒng)中，淺水沼澤和莎草濕地中甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和功能最相似，而深水域沉積物的甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)和功能與其他兩種類型的濕地之間存在差異性.

圖5 草海不同類型濕地沉積物中物種(a)及功能(b)的PCoA分析 (QS：淺水沼澤；SC：莎草濕地；SS：深水域沉積物)Fig.5 PCoA analysis of species (a) and their functions (b) in different types of wetland sediments in Lake Caohai (QS: shallow-water marsh, SC: sedge wetland, SS: deep-water sediment)

2.7 草海濕地沉積物中甲烷氧化菌種類與功能的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

在種水平下，基于總豐度前50的甲烷氧化菌進(jìn)行種類與功能的Spearman相關(guān)性系數(shù)(P)計(jì)算，選擇 0.5 為相關(guān)系數(shù)閾值，繪制物種與功能相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖(圖6，圖中連線越粗表示節(jié)點(diǎn)間的相關(guān)性越強(qiáng)). 緊密系數(shù)表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的中心系數(shù)值，緊密系數(shù)值越大說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要. 結(jié)果顯示，草海濕地中與碳代謝相關(guān)的甲烷氧化菌共有7種，其中相關(guān)性較強(qiáng)的是Methylacidiphilum_kamchatkense(緊密系數(shù)為0.57)和Methylacidiphilum_fumariolicum(緊密系數(shù)為0.57). 與甲烷代謝相關(guān)的甲烷氧化菌共有6種，其中相關(guān)性較強(qiáng)的是Candidatus_Methylomirabilis_oxyfera(緊密系數(shù)為0.50)和Methylobacter_tundripaludum(緊密系數(shù)為0.33). 與氮代謝相關(guān)的甲烷氧化菌共有6種，其中相關(guān)性較強(qiáng)的是Methylomonas_koyamae(緊密系數(shù)為0.50)和Methylacidiphilum_kamchatkense(緊密系數(shù)為0.57). 與硫代謝相關(guān)的甲烷氧化菌共有10種，其中相關(guān)性較強(qiáng)的是Methylosarcina_fibrata(緊密系數(shù)為0.43)和Methylomonas_denitrificans(緊密系數(shù)為0.43). 總體上看，Methylacidiphilum_fumariolicum和Methylacidiphilum_kamchatkense節(jié)點(diǎn)數(shù)最多，它們是草海湖泊濕地各個(gè)代謝功能中兩種與功能相關(guān)性較大的物種.

圖6 草海濕地沉積物中甲烷氧化菌的種類與功能的相關(guān)性Fig.6 Correlation of types and functions of methanotrophs in the sediments of Lake Caohai wetland

2.8 草海濕地沉積物中甲烷氧化菌與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析

圖7 草海濕地沉積物中甲烷氧化菌種類與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析(*：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001)Fig.7 Analysis of the correlation between the types of methanotrophs in the sediments of Lake Caohai wetland and the environmental factors (*：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001)

3 討論

3.1 草海濕地中甲烷氧化菌的種類

3.2 草海濕地中甲烷氧化菌的功能

通過對(duì)草海不同類型濕地中甲烷氧化菌基因集的功能注釋，發(fā)現(xiàn)其不僅存在甲烷代謝，而且還存在參與物質(zhì)循環(huán)的功能的碳代謝、氮代謝、硫代謝. 甲烷氧化菌的某些功能在實(shí)驗(yàn)上已得到證實(shí). Vorobev等[37]的研究證實(shí)了甲烷氧化菌中存在有丙酮酸還原酶和絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶，而這些酶可以使得碳通過絲氨酸途徑和核糖酮二磷酸途徑被同化，而氮?jiǎng)t被對(duì)氧敏感的固氮酶所固定，從而證實(shí)了甲烷氧化菌具有參與氮循環(huán)功能的潛力. Caldwell等[38]的研究則證實(shí)了厭氧甲烷氧化古菌和硫酸鹽還原細(xì)菌參與的硫酸鹽型厭氧甲烷氧化過程中，不僅能進(jìn)行甲烷的厭氧氧化，而且還能在甲烷厭氧氧化的同時(shí)對(duì)硫酸鹽進(jìn)行還原. 本研究中PCoA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)深水沉積物中甲烷氧化菌的種類和功能組成與另外兩種類型濕地存在一定差異，其原因在于濕地沉積物中的甲烷氧化程度主要受到水位的影響[39]. Sun等[40]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濕地中的水位達(dá)到一定位置(地表下20～30 cm)時(shí)，濕地中的甲烷氧化菌氧化甲烷的能力則會(huì)大于產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生甲烷的能力，而夏品華等[41]研究發(fā)現(xiàn)水位梯度的變化會(huì)對(duì)好氧甲烷氧化菌的組成和結(jié)構(gòu)造成一定的影響. 本研究中甲烷氧化菌的種類與功能相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示Candidatus_Methylomirabilis_oxyfera與甲烷代謝功能具有較強(qiáng)的相關(guān)性，Zhu等[42]基于同位素示蹤法證實(shí)Candidatus_Methylomirabilis_oxyfera對(duì)氮循環(huán)和甲烷循環(huán)的貢獻(xiàn)較大. 此外，Methylacidiphilum_fumariolicum和Methylacidiphilum_kamchatkense與草海湖泊濕地各個(gè)代謝功能相關(guān)性較大.Methylacidiphilum最初從意大利[43]、新西蘭[44]和俄羅斯[45]的地?zé)岘h(huán)境中分離出來的，是一種屬于疣微門的甲烷氧化菌[46]，最近研究表明，Methylacidiphilum不僅與甲烷氧化相關(guān)，其還與乙烷和丙烷氧化相關(guān). 該類甲烷氧化菌不僅能夠利用丙烷氧化途徑中所具有的含氧C3化合物中間體進(jìn)行生長(zhǎng)[47]，而且還能夠利用各種底物(包括甲烷、甲醇和氫氣)進(jìn)行生長(zhǎng)[48]. 這些結(jié)論進(jìn)一步證實(shí)了甲烷氧化菌與各類代謝功能密切相關(guān).

3.3 影響草海濕地中甲烷氧化菌分布的環(huán)境因子

4 結(jié)論

1)草海不同類型濕地中的好氧甲烷氧化菌以屬于變形菌門TypeⅠ型的甲基桿菌屬和甲基單胞菌屬為主，氧化類型以好氧氧化為主.

2)草海淺水沼澤和莎草濕地的群落結(jié)構(gòu)和功能相似，而深水域沉積物中的群落結(jié)構(gòu)和功能存在一定差異性.

3)草海湖泊濕地甲烷氧化菌Methylacidiphilum_fumariolicum和Methylacidiphilum_kamchatkense是碳、氮、硫和甲烷代謝過程的主要參與者.

4)草海湖泊濕地中的Type Ⅱ型甲烷氧化菌僅與ORP呈正相關(guān)，而TypeⅠ型甲烷氧化菌和疣微菌門甲烷氧化菌(Methylacidiphilum)與ORP呈負(fù)相關(guān)，說明了草海湖泊濕地生態(tài)系統(tǒng)中的Type Ⅰ型甲烷氧化菌與Type Ⅱ型甲烷氧化菌對(duì)O2的適應(yīng)性存在差異.