杭遠欣，王海英，周太梅，肖玉波

(湖南醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生與檢驗醫(yī)學院，湖南 懷化 418000)

代謝綜合征(MS)是腹型肥胖、高血壓、高血糖、高甘油三酯(TG)血癥和(或)低高密度脂蛋白水平等因素聚集在同一個體上發(fā)生的一種代謝異常癥候群，基因與環(huán)境因素均可導致該病的發(fā)生[1]。位于載脂蛋白A5(ApoA5)基因起始密碼子上游3 bp的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點rs651821，被證實與血清TG水平升高有關，并可能導致湖南侗族人群對高血壓的易感性增加[2]，而該位點基因多態(tài)性與MS的相關性研究較少見[3]。本研究探討了ApoA5基因SNP位點rs651821與侗族人群MS發(fā)生風險之間的關系，對篩選MS易感人群、降低MS發(fā)生率有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年6月在湖南省通道侗族自治縣某衛(wèi)生院就診的160例MS患者作為MS組，同時選取145例健康體檢者作為對照組。納入標準：符合2007年《中國成人血脂異常防治指南》的診斷標準[4]，即男性腰圍大于或等于85 cm，女性腰圍大于或等于80 cm；收縮壓/舒張壓大于或等于140/90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)；空腹血糖(FPG)大于或等于6.10 mmol/L；TG≥1.7 mmol/L；男性高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)<0.9 mmol/L，女性HDL-C<1.03 mmol/L，其中3項及以上異常時診斷為MS。排除標準：長期使用類固醇激素等藥物；合并結締組織疾病、繼發(fā)性高血壓、慢性肝病；未簽署知情同意書。本研究獲得湖南醫(yī)藥學院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。2組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2主要儀器及試劑 主要儀器設備：SW-CJ-1D潔凈工作臺(江蘇蘇潔凈化設備廠)；HH-4型數顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司)；TG16-Ⅱ型臺式高速離心機(湖南平凡科技有限公司)；聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀(美國ABI公司)；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司)；H6-1微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；U-3010紫外可見分光光度計(日本Hitachi公司)；微量電子天平(北京博遠祥德科學儀器有限公司)；BS-460型全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。主要試劑：DNA細胞裂解液、核糖核酸酶、蛋白酶K、苯酚、氯仿、乙酸銨、無水乙醇、75%乙醇、引物、PCR試劑盒、DNA標記物、限制性核酸內切酶、瓊脂糖等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3方法 采用調查表對所有受試者進行性別、年齡、身高、體重、腰圍、血壓等一般資料的收集，其中血壓、腰圍的測量由同一名護士連續(xù)測量3次，并記錄3次的平均值。清晨空腹采血，分裝并于—80 ℃保存。采用全自動生化分析儀檢測FPG、TG、總膽固醇(TC)、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

查詢ApoA5基因rs651821位點序列，利用Primer5.0設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中上游引物為5′-GTT GAA GTC AGG GTC GGA GA-3′，下游引物為5′-GTA ACA GGA TTT CGG GCA GT-3′。采用酚-氯仿法提取外周血白細胞中基因組DNA。采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RELP)方法檢測基因多態(tài)性。PCR反應體系：DNA模板0.5 μL、10×Taq Buffer 1.5 μL、2.5 mM三磷酸脫氧核苷0.3 μL、上游引物和下游引物(50 pmoL/μL)各0.2 μL、Taq酶(5 U/μL)0.1 μL、Mg2+1.2 μL、ddH2O補至15 μL。PCR擴增循環(huán)參數：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，68.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共20循環(huán)；然后95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共20循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。RELP反應體系15 μL，包含PCR產物10 μL，10×Buffer R 1.5 μL，Acc36Ⅰ限制性核酸內切酶(10 U/μL)0.1 μL，ddH2O 3.4 μL，在37 ℃下消化過夜。酶切產物電泳：制作1%瓊脂糖凝膠并加入溴化乙啶(0.5 μg/mL)，將8 μL酶切產物加入膠孔，以6 μL DNA標記物為參照物，電泳30 min(120 V)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果。

2 結 果

2.12組臨床及生化指標比較 MS組體重、體重指數、腰圍、FPG、收縮壓、舒張壓、TC、TG、LDL-C水平高于對照組，而身高、HDL-C水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組臨床及生化指標比較

2.2PCR-RFLP檢測和測序情況 ApoA5基因rs651821位點經Acc36Ⅰ酶切后，根據片段長度的不同對基因型進行判斷，共檢測到3種基因型，具體如下：TT基因型(119、38 bp)，TC基因型(157、119、38 bp)，CC基因型(157 bp)。見圖1。為保證準確性，通過直接測序進一步確定基因型，各基因型測序峰圖(正向測序)與酶切產物電泳結果一致。見圖2。因為38 bp的核苷酸序列分子量小，電泳后無法在凝膠上顯示，但不影響基因型的判讀。

M為500 bp DNA標記物。

圖2 ApoA5基因rs651821位點基因型測序圖

2.32組基因型和等位基因頻率分布情況 經χ2檢驗，2組基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.495，P>0.05)，說明樣本具有代表性，可反映整體基因分布情況。2組基因型和等位基因頻率分布情況比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組基因型和等位基因頻率分布情況[n(%)]

2.4各基因型攜帶者臨床及生化指標比較 3種基因型攜帶者體重指數、舒張壓、HDL-C、LDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CC基因型攜帶者腰圍、收縮壓、TC、TG水平高于TC、TT基因型攜帶者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各基因型攜帶者臨床及生化指標比較

2.5ApoA5基因rs651821多態(tài)性與MS易感性的關系 排除年齡、性別和體重指數的影響后，TC基因型攜帶者患MS的風險是TT型攜帶者的1.743倍(95%CI：0.843～3.604，P<0.05)，CC基因型攜帶者患MS的風險是TT型攜帶者的11.508倍(95%CI：3.296～40.185，P<0.05)。見表4。

表4 ApoA5基因rs651821位點基因多態(tài)性與MS易感性的關系

續(xù)表4 ApoA5基因rs651821位點基因多態(tài)性與MS易感性的關系

3 討 論

近年來，MS發(fā)生率逐年升高，已成為威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。有研究顯示，2016—2017年，20～70周歲普通居民MS發(fā)生率增長至19.58%，其中男性為26.97%，女性為16.18%[5]。有研究表明，MS患者罹患糖尿病、心血管疾病和癌癥的風險均顯著增加[6-7]。除了非遺傳因素如吸煙、飲酒和飲食等以外，遺傳因素與MS之間的關系逐漸成為研究熱點。國內外大量研究揭示了MS與多個基因的SNP存在相關性，如MG53基因[8-9]、IGF2BP2基因[10-11]、MC4R基因[8,12]等。

ApoA5基因是2001年發(fā)現的血漿載脂蛋白家族新成員，位于人類染色體11q23區(qū)域，由4個外顯子和3個內含子組成，毗鄰ApoA1/ApoC3/ApoA4基因簇，編碼一種參與調節(jié)血漿TG和HDL-C水平的載脂蛋白[13]。ApoA5基因至少含有23個SNP位點，其SNP位點對高血壓、血脂、血糖及心血管疾病影響的研究較多見[14-15]。研究已證實，ApoA5基因-1131T>C位點基因多態(tài)性與高脂血癥顯著相關，且可增加MS發(fā)生率[16-18]。rs662799(-1131T>C)和rs2266788(1259T>C)多態(tài)性與人群血脂代謝密切相關，其中rs662799(-1131T>C)被證實在匈牙利、日本、中國北方漢族人群中與MS顯著有關，是MS的獨立危險因素[19-22]。

本研究結果顯示，MS組CC基因型及C等位基因頻率分布顯著高于對照組(P<0.05)。提示C型基因突變可能導致個體MS易感性增高，但其分子機制有待進一步探討和研究。同時，本研究單獨分析了不同基因型與臨床及生化指標之間的關系，結果顯示，CC基因型與腰圍、收縮壓、TC、TG水平密切相關，易導致MS的發(fā)生。此外，logistic回歸分析顯示，TC基因型攜帶者患MS的風險是TT基因型攜帶者的1.743倍，CC基因型攜帶者患MS的風險是TT基因型攜帶者的11.508倍。提示通道侗族自治縣侗族人群ApoA5基因rs651821位點的變異會增加MS的發(fā)生風險，其中CC基因型OR值較大，其原因可能是樣本量少、數據不均勻。受樣本量及試驗方法的限制，本研究僅對侗族人群rs651821位點進行了研究，ApoA5基因的其他變異體與MS的關系尚需進一步研究。

綜上所述，在通道侗族自治縣侗族人群中，ApoA5基因rs651821位點多態(tài)性與MS密切相關，攜帶CC基因型人群發(fā)生MS的風險會升高。