蘇珮茹，羅香雅，曾春平，周 琳

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院/廣州市加速康復(fù)腹部外科重點(diǎn)實(shí)驗室/廣州醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510700)

骨質(zhì)疏松癥是一種系統(tǒng)性代謝性骨病，其特征是骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，進(jìn)而導(dǎo)致骨脆性增加、骨折風(fēng)險增高。隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率逐年升高，因骨質(zhì)疏松產(chǎn)生的并發(fā)癥如骨折，嚴(yán)重影響患者日常生活，并給患者及家屬帶來了嚴(yán)重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此尋求有效防治骨質(zhì)疏松的方法成為目前亟待解決的問題[1]。

貓眼草黃素是一種多甲氧基黃酮，存在于多種植物中，如澤漆(俗稱貓眼草)、黃花蒿、細(xì)花線紋香茶菜、巖筋菜等植物中[2]。黃酮類化合物是一種常見植物多酚，這類化合物與雌激素結(jié)構(gòu)類似，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗感染等作用[3]。部分黃酮類化合物能通過調(diào)控成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞功能，從而保護(hù)骨組織[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，貓眼草黃素能通過Wnt/β-catenin通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，改善雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨丟失，從而對骨細(xì)胞起保護(hù)作用[5]。此外，貓眼草黃素是青蒿素代謝相關(guān)的CYP450酶亞型的抑制劑，能顯著提高青蒿素的抗瘧性[6]。研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素能顯著抑制破骨細(xì)胞的分化[7]。因此，推測貓眼草黃素除了能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，還能抑制破骨細(xì)胞分化。越來越多的研究表明，自噬參與破骨細(xì)胞的形成、分化及骨吸收作用等多個階段[8-10]。自噬與破骨細(xì)胞的關(guān)系是目前破骨細(xì)胞與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)研究的新方向。因此，本文主要探討了貓眼草黃素對破骨細(xì)胞分化的影響及自噬在其中的作用，從而為骨質(zhì)疏松癥提供潛在的臨床治療方法。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 貓眼草黃素(C19H18O8，分子量：374.34，純度98%，CAS號：603-56-5)購自云南西力生物技術(shù)股份有限公司，采用二甲基亞砜配置成10 μmol/L溶液備用，按各目標(biāo)濃度進(jìn)行稀釋。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購自美國ATCC公司；α-MEN培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子(RANK)配體(RANKL)購自美國R&D公司，抗LC3B抗體、抗ATG5抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購自成都正能生物科技公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10%小牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中?？瞻捉M給予完全培養(yǎng)基，模型組給予含50.0 ng/mL RANKL的培養(yǎng)基，A～F組給予不同水平貓眼草黃素(0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)+含50.0 ng/mL RANKL的培養(yǎng)基。

1.2.2抗酒石酸酸性磷酸酶染料(TRAP)染色 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上時，將小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7按每孔1.0×103的密度接種于96孔板中，用含10%小牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，貼壁后按分組處理，每2天換1次培養(yǎng)液，總共培養(yǎng)5 d。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，加入TRAP染色20 min，光鏡下觀察破骨細(xì)胞并計數(shù)，具有3個或更多個核的TRAP陽性多核細(xì)胞被認(rèn)為是破骨細(xì)胞樣細(xì)胞。

1.2.3采用貓眼草黃素干預(yù)破骨細(xì)胞 (1)不同水平的干預(yù)。細(xì)胞接種貼壁后，加入含0、1.0、5.0、10.0 μmol/L貓眼草黃素的完全培養(yǎng)基及50.0 ng/mL RANKL刺激24 h，提取細(xì)胞裂解液，采用免疫印跡法(Western blot)檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況：取細(xì)胞蛋白提取液，蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min；以12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后孵一抗，4 ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌；再加入相應(yīng)的HPR標(biāo)記二抗孵育1 h，PBST洗滌后顯影。(2)不同時間的干預(yù)。將RAW264.7細(xì)胞株按每孔5.0×104的密度接種于6孔板，加入含10.0 μmol/L貓眼草黃素的完全培養(yǎng)基及50.0 ng/mL RANKL，分別持續(xù)誘導(dǎo)1、3、5 d，收集細(xì)胞提取細(xì)胞裂解液，采用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料多組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1貓眼草黃素對破骨細(xì)胞分化的影響 C～F組破骨細(xì)胞數(shù)量與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。

A.空白組；B.模型組;C.A組;D.B組;E.C組;F.D組;G.E組;H.F組。

2.2不同水平干預(yù)對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組及B、D、E組中自噬相關(guān)蛋白ATG5表達(dá)未見明顯變化(P>0.05)。與空白組比較，模型組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P<0.05)。與模型組比較，B、D、E組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05)。見圖3。

2.3不同時間干預(yù)對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，貓眼草黃素干預(yù)1、3、5 d時，自噬相關(guān)蛋白ATG5表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。在干預(yù)3、5 d時，自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)較模型組明顯下降(P<0.05)。作用時效越長，貓眼草黃素抑制自噬的作用越明顯。見圖4。

與模型組比較，*P<0.05。

圖3 不同水平貓眼草黃素干預(yù)的Western blot檢測結(jié)果

圖4 不同時間干預(yù)的Western blot檢測結(jié)果

3 討 論

骨質(zhì)疏松是一種全身性代謝性骨病，在臨床上按病因主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥為臨床上常見類型，其可分為兩型：Ⅰ型為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，發(fā)生于絕經(jīng)后女性，主要由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨量的流失；Ⅱ型為老年性骨質(zhì)疏松癥，多見于老年人，主要是年齡相關(guān)的生理性退行病變。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥病因明確，是由某些藥物或疾病等引起的骨質(zhì)量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨折風(fēng)險增加的代謝性疾病，如糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松、甲狀腺功能亢進(jìn)性骨質(zhì)疏松癥、糖尿病性骨質(zhì)疏松癥、風(fēng)濕類疾病引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松等。

破骨細(xì)胞是高度分化的多核巨細(xì)胞，起源于造血干細(xì)胞，并受RANK和巨噬細(xì)胞集落刺激因子的調(diào)控，其主要功能是骨吸收[11]。在正常生理情況下，破骨與成骨的動態(tài)平衡使骨代謝保持穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)這種平衡被打破時，就可能導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡，最終發(fā)生骨質(zhì)疏松[12]。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物很多，如雌激素、雙膦酸鹽、降鈣素、RANKL抑制劑等[13]，但部分具有費(fèi)用昂貴、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)。如雙磷酸鹽長期使用會引起胃腸道反應(yīng)和腎功能損害；長時間使用雌激素替代治療會提高乳腺癌及子宮癌等腫瘤疾病的發(fā)生風(fēng)險[14]。天然化合物具有療效顯著、作用靶點(diǎn)廣泛、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，有可能成為骨質(zhì)疏松治療的最佳策略。

骨保護(hù)素(OPG)-RANKL-RANK系統(tǒng)是調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的關(guān)鍵信號通路[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在去卵巢優(yōu)勢的大鼠模型中，骨髓細(xì)胞中的RANKL表達(dá)明顯升高，促使OPG與RANKL比值下降，導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、骨吸收增強(qiáng)，提示絕經(jīng)后患者雌激素缺乏會激活OPG-RANKL-RANK軸而導(dǎo)致骨質(zhì)量下降，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[16]。目前多項研究發(fā)現(xiàn)，對于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，部分藥物或疾病可以通過OPG-RANKL-RANK信號通路促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成及骨吸收，從而導(dǎo)致骨量丟失。如糖皮質(zhì)激素能促進(jìn)RANKL分泌，促使RANKL與RANK結(jié)合并激活下游信號通路，從而提高破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟。因此，長期使用糖皮質(zhì)激素易引起骨量丟失。炎性因子、生長因子等能激活RANK/RANKL通路，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟及骨吸收功能，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[17]。因此，抑制OPG-RANKL-RANK信號通路，有利于治療骨質(zhì)疏松癥[18]。

貓眼草黃素是一種多甲氧基黃酮。研究表明，貓眼草黃素能抑制腸道病毒71型[19]和顯著提高青蒿素的抗瘧性[6]，其通過Wnt/β-catenin通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，改善雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨丟失，從而對骨細(xì)胞起保護(hù)作用[5]。目前，關(guān)于貓眼草黃素對破骨細(xì)胞作用的研究較少見。本研究組前期研究證實(shí)，低劑量的貓眼草黃素可高效抑制RANKL誘導(dǎo)的信號通路，對破骨細(xì)胞的分化和活性產(chǎn)生影響，并最終調(diào)節(jié)骨代謝失衡。本研究結(jié)果顯示，通過不同水平貓眼草黃素干預(yù)后，TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，提示貓眼草黃素對破骨細(xì)胞的分化有抑制作用，且呈劑量依賴性，與前期研究結(jié)果相符。貓眼草黃素能抑制破骨細(xì)胞分化，其作用可能是通過抑制RANKL誘導(dǎo)的各種信號通路實(shí)現(xiàn)的。而多項研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性及繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要通過調(diào)節(jié)OPG-RANKL-RANK信號通路來促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、成熟及骨吸收。貓眼草黃素屬于黃酮類化合物，與雌激素結(jié)構(gòu)類似，具有抗炎、抗氧化等作用，其自身的生物活性與其抗骨質(zhì)疏松的特性密切相關(guān)，可能具有抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、氧化應(yīng)激、雌激素缺乏等病因引起的骨質(zhì)疏松癥的作用。上述研究提示，貓眼草黃素有可能成為靶向RANKL信號通路的新型藥物，其對各種類型骨質(zhì)疏松癥的作用及分子調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

自噬是細(xì)胞在外界環(huán)境因素的影響下，利用溶酶體降解自身衰老、變性或受損的大分子物質(zhì)及細(xì)胞器的過程，在真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝中起重要作用[20-21]。研究表明，自噬功能紊亂會導(dǎo)致腫瘤[22]、心臟病[23]、神經(jīng)退行性疾病及免疫失調(diào)等重大疾病[24]。目前越來越多文獻(xiàn)表明，自噬參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞的增殖及破骨細(xì)胞的分化與活性的變化等，對于維持骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[25]。提示自噬有可能是骨代謝疾病的發(fā)病機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，部分黃酮類化合物能通過調(diào)控自噬來調(diào)控細(xì)胞分化與功能，如山柰酚通過降解p62/SQSTM1抑制破骨細(xì)胞分化[26]；葛根素能抑制破骨細(xì)胞的自噬和增殖，自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7和Beclin1的過度表達(dá)能逆轉(zhuǎn)葛根素抑制破骨細(xì)胞的自噬和增殖[27]。自噬在破骨細(xì)胞分化、成熟及骨吸收的過程中扮演重要角色，與自噬相關(guān)的蛋白(如ATG5、ATG7、ATG4B、ATG12和LC3等)[28]在破骨細(xì)胞形成與骨吸收過程中發(fā)揮重要的作用，其中LC3Ⅱ是LC3Ⅰ的脂化形式，其依賴泛素蛋白酶復(fù)合體定位于吞噬泡膜上，參與自噬溶酶體形成，常被用作自噬形成的標(biāo)志物[29]。本研究結(jié)果顯示，貓眼草黃素在干預(yù)破骨細(xì)胞過程中對自噬相關(guān)蛋白ATG5表達(dá)的影響不明顯，但能抑制破骨細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)，且破骨細(xì)胞分化時間越長，其抑制自噬的能力越明顯。提示貓眼草黃素可能通過自噬途徑抑制破骨細(xì)胞分化。

綜上所述，貓眼草黃素對破骨細(xì)胞的分化有抑制作用，且呈劑量依賴性，其可能通過自噬途徑發(fā)揮抑制作用。本研究為貓眼草黃素對骨質(zhì)疏松的治療提供了研究基礎(chǔ)及新方向，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。