王珺， 張廣超， 陳丹， 孫曉敏

支氣管哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，可能伴有肺炎、呼吸衰竭等并發(fā)癥[1]。目前，隨著環(huán)境問題日益嚴(yán)峻，小兒支氣管哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。而支氣管哮喘病因較為復(fù)雜，具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一種小于21個核苷酸的非編碼RNA，具有高度的保守性，其通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因表達(dá)，參與機(jī)體生長發(fā)育及多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[3]。miRNA-126是常見miRNAs之一，有研究顯示，miRNA-126可能在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4]。runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(runt-related transcription factor 3，RUNX3)是一種重要的抑癌基因，近年來也顯示與呼吸道疾病密切相關(guān)[5]，但其在支氣管哮喘中的相關(guān)研究較少。我們利用生物信息學(xué)工具分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-126和RUNX3之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，且兩者均被報(bào)道與呼吸道疾病有關(guān)[6-7]，但關(guān)于二者是否在哮喘中存在靶向關(guān)系尚無研究。因此，本研究擬通過檢測支氣管哮喘患兒外周血中miRNA-126及RUNX3的表達(dá)水平，探討miRNA-126與RUNX3在小兒支氣管哮喘中的作用及可能的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年3月至2021年6月在河南省兒童醫(yī)院治療的支氣管哮喘患兒80例為研究對象，根據(jù)疾病臨床情況分為急性期42例，緩解期38例。同期選取我院健康體檢兒童40例為對照組。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中相關(guān)支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≤12歲；(3)本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者家長均對本研究知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)伴有心源性哮喘、氣管內(nèi)膜病變及變態(tài)反應(yīng)性肺浸潤等肺部疾病患兒；(2)近1個月內(nèi)服用過糖皮質(zhì)激素治療；(3)近1周內(nèi)服用過支氣管擴(kuò)張劑等抗哮喘藥物；(4)患有全身性免疫系統(tǒng)疾病。

1.5 方法

1.5.1 一般資料 收集入院時(shí)患兒的性別、年齡、BMI、哮喘家族史、過敏病史、呼吸道反復(fù)感染史、父母吸煙史一般資料。

1.5.2 臨床指標(biāo)檢測 (1)外周血miRNA-126檢測：取新鮮抗凝靜脈血2 mL，與生理鹽水按1∶1混勻后，加入裝有2 mL細(xì)胞分離液中，400g離心20 min，離心半徑13.5 cm，離心后樣品分2層，第2層為乳白色即為單核細(xì)胞層；收集該層細(xì)胞，加入生理鹽水混勻，400g離心20 min，收集細(xì)胞沉淀即得所需外周血單核細(xì)胞；使用Trizol法提取外周血單核細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；使用RT-qPCR檢測miRNA-126的mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算miRNA-126的mRNA的相對表達(dá)量。見表1。

表1 引物列表

(2)外周血單核細(xì)胞RUNX3蛋白水平檢測：取新鮮抗凝血2 mL，同上方法收集外周血中的單核細(xì)胞，采用Western blot檢測RUNX3蛋白表達(dá)水平。收集單核細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解液，裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，收集上清，采用二辛可寧酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取40 μg蛋白液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，用兔抗人RUNX3單克隆抗體(購自英國Abcam公司)，4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算各組RUNX3蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 一般及臨床資料比較 見表2。與對照組比較，急性期組及緩解期組的性別、年齡、BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，哮喘家族史、過敏史、呼吸道反復(fù)感染史均顯著增加(P<0.05)，急性期組的父母吸煙史增加(P<0.05)；與緩解期組比較，急性期組的性別、年齡、BMI、哮喘家族史、過敏史、呼吸道反復(fù)感染史、父母吸煙史差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表2 研究對象一般及臨床資料比較

2.2 miRNA-126與RUNX3表達(dá)水平比較 見圖1。與對照組相比，緩解期組與急性期組miRNA-126 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，RUNX3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且急性期組的miRNA-126 mRNA表達(dá)水平顯著高于緩解期組(P<0.05)，RUNX3蛋白表達(dá)水平顯著低于緩解期組(P<0.05)。

圖1 不同組間的miRNA-126與RUNX3表達(dá)水平比較

2.3 miRNA-126與RUNX3水平的相關(guān)性分析 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase 3.0(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)分析結(jié)果顯示，miRNA-126與RUNX3的3‘UTR端存在結(jié)合位點(diǎn)，提示二者之間可能存在靶向關(guān)系(圖2)。

圖2 Starbase預(yù)測的miRNA-126與RUNX3之間的靶向關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，哮喘兒童外周血中的miRNA-126與RUNX3水平呈顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.232，P=0.039)，見圖3。

圖3 哮喘兒童外周血中miRNA-126與RUNX3表達(dá)水平的相關(guān)性

2.4 miRNA-126及RUNX3診斷哮喘及其臨床分期的預(yù)測價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，miRNA-126與RUNX3診斷哮喘的曲線下面積(AUC)分別為0.933，0.847，敏感性分別為87.50%，76.25%，特異性分別為92.50%，82.50%；miRNA-126與RUNX3診斷哮喘病情的AUC分別為0.696，0.798，敏感性分別為69.05%，92.86%，特異性分別為71.05%，63.16%，提示二者對兒童哮喘疾病具有一定診斷價(jià)值，見圖4，表3。

表3 miRNA-126、RUNX3預(yù)測哮喘及其臨床分期的ROC曲線分析

圖4 miRNA-126、RUNX3預(yù)測哮喘及其臨床分期的ROC曲線

3 討論

支氣管哮喘是呼吸科最常見的慢性呼吸道疾病之一，好發(fā)于兒童，并給其生活及正常生長發(fā)育帶來較為嚴(yán)重的影響。加強(qiáng)對兒童支氣管哮喘疾病誘發(fā)因素的關(guān)注對預(yù)防兒童哮喘具有重要作用。既往研究顯示，過敏史、呼吸道反復(fù)感染史、父母哮喘史、父母吸煙史均是導(dǎo)致兒童支氣管哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，哮喘患兒的哮喘家族史、過敏史、呼吸道反復(fù)感染史、父母吸煙史比例均顯著升高，與既往研究一致。研究顯示，miRNA作為一類非編碼RNA，可與多種靶基因結(jié)合，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤[10]、哮喘等[11]。miRNA-126是miRNAs家族中的重要一員，既往研究表明miRNA-126異常表達(dá)與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。邢國英等[13]通過抑制哮喘小鼠肺組織miRNA-126表達(dá)，可顯著降低Th2型細(xì)胞炎性細(xì)胞因子水平表達(dá)，緩解哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)，進(jìn)一步說明miRNA-126可能通過調(diào)節(jié)Th2型細(xì)胞參與哮喘發(fā)生。研究顯示哮喘患者中的miRNA-126水平明顯增加，且急性期更為顯著，對哮喘診斷具有一定的預(yù)測價(jià)值[14]。

RUNX3屬于Runt家族，作為重要的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，可調(diào)節(jié)特異性基因的表達(dá)，與各種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如胃癌[15]、結(jié)腸癌[16]等疾病。有研究顯示，RUNX3基因敲除小鼠可出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增多，導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)和氣道重塑現(xiàn)象[17]。研究已顯示支氣管哮喘患者中RUNX3基因表達(dá)水平顯著降低，且急性期低于緩解期[18]。RUNX3還可通過調(diào)控基因表達(dá)對T細(xì)胞、B細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。另外，研究顯示miRNAs中某些成員對RUNX3具有靶向調(diào)控功能，如miRNA-138可通過靶向調(diào)控RUNX3基因表達(dá)參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展[19]。miRNA-371，miRNA-138，miRNA-544，miRNA-145可通過靶向調(diào)控RUNX3mRNA表達(dá)水平參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[20]。本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘患兒外周血單核細(xì)胞中的miRNA-126表達(dá)水平升高，RUNX3蛋白表達(dá)水平降低，而急性期組的miRNA-126顯著高于緩解期組，RUNX3蛋白表達(dá)水平顯著低于緩解期組，且miRNA-126與RUNX3在診斷哮喘以及評估其病情的嚴(yán)重程度均具有一定的診斷價(jià)值。以上結(jié)果提示外周血單核細(xì)胞中的miRNA-126與RUNX3均與支氣管哮喘患兒的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能作為判斷支氣管哮喘疾病的預(yù)測指標(biāo)。另外研究表明,miRNA-138與RUNX3呈負(fù)相關(guān)，miRNA-138可通過靶向RUNX3基因調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[21]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-126與RUNX3可能具有靶向關(guān)系，且相關(guān)性分析顯示，miRNA-126與RUNX3呈顯著負(fù)相關(guān)性。以上結(jié)果說明外周血單核細(xì)胞中miRNA-126可能是通過靶向RUNX3基因的表達(dá),進(jìn)而參與支氣管哮喘疾病發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究認(rèn)為支氣管哮喘患兒外周血單核細(xì)胞中存在miRNA-126高表達(dá)、RUNX3蛋白低表達(dá)，且二者間可能存在靶向協(xié)同作用，共同參與支氣管哮喘疾病發(fā)生、發(fā)展。