郝琴琴，任 靜，成俊麗，李鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

miRNA是一類長度為20～24 nt的小分子RNA，主要通過堿基互補配對方式識別靶基因mRNA，并根據(jù)其互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，進(jìn)而調(diào)控動植物生理過程[1]。LEE等[2]首次在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)lin-4能靶向結(jié)合目的mRNA的3'UTR區(qū)，調(diào)控線蟲發(fā)育，確認(rèn)其為miRNA，隨后在不同物種中檢測出多種miRNA，并對其功能進(jìn)行研究。近年來，大量研究表明，miRNA對卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟起著重要作用，ZHANG等[3]利用高通量測序技術(shù)對超排處理的羔羊和成年綿羊卵巢中差異表達(dá)miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，miR-377-3p在超排處理的羔羊卵巢中大量表達(dá)，推測其可能影響卵母細(xì)胞生長；WANG等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-377可能通過與MMP-16相互作用影響卵細(xì)胞的生長。而miR-377對牛卵泡發(fā)育的影響尚未見報道。

CART作為下丘腦分泌的一種神經(jīng)肽，是抑制卵泡優(yōu)勢化的重要因子[5]。通過生物信息學(xué)方法已明確bta-miR-377與CART存在靶向作用。而關(guān)于miRNA的表達(dá)鑒定方法多樣，其中最早利用Northern blot技術(shù)對miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行鑒定[6-7]，其原理是用探針對電泳分離的RNA樣品進(jìn)行雜交檢測，主要克服miRNA表達(dá)量低且穩(wěn)定性差的問題，但該技術(shù)存在靈敏度低、所用樣品量大、耗時多且無法利用高通量對所得結(jié)果進(jìn)行檢測等缺點[8]；微陣列是另一種分析miRNA表達(dá)的傳統(tǒng)方法[9]，可進(jìn)行高通量分析，但存在耗時和靈敏度低的缺陷，使其應(yīng)用范圍受限；半定量RT-PCR技術(shù)檢測miRNA內(nèi)源性表達(dá)具有高效、便捷等優(yōu)點，但由于miRNA條帶過短不易表達(dá)或受到電泳條件如電源電壓、電泳時間、核酸染料、凝膠濃度等多種因素的影響，試驗中易出現(xiàn)無目的條帶、非特異性條帶多等情況，因此需要對試驗條件進(jìn)行優(yōu)化[10]。

本研究采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)法對bta-miR-377引物序列進(jìn)行特異性延長，利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測牛下丘腦中bta-miR-377的表達(dá)，通過比較不同凝膠濃度、電源電壓、時間下bta-miR-377條帶的分布情況，對電泳條件不斷進(jìn)行優(yōu)化，旨在分離鑒定bta-miR-377，為bta-miR-377在牛下丘腦組織中有內(nèi)源性表達(dá)提供依據(jù)，并為進(jìn)一步研究其通過CART調(diào)控牛卵泡發(fā)育進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料選取文水縣肉牛屠宰場3頭年齡相近且健康的西門塔爾母牛，采集其下丘腦組織后置于液氮中保存。

主要試劑包括PCR擴(kuò)增試劑盒（北京康為世紀(jì)公司）；Trizol（Invitrogen公司）；miRNA cDNA莖環(huán)法第1鏈合成試劑盒（上海生工公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 從miRbase數(shù)據(jù)庫中獲得目的bta-miR-377成熟序列，利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)法設(shè)計bta-miR-377反轉(zhuǎn)錄引物與PCR擴(kuò)增引物，得到3條引物序列，由上海生工公司合成，具體序列如表1所示。

表1 研究所用引物序列Tab.1 Sequences of primer s used in this study

1.2.2 總RNA提取與bta-miR-377反轉(zhuǎn)錄 利用Trizol法提取牛下丘腦組織中總RNA，核酸濃度檢測合格后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。反應(yīng)體系為：RNA 4μg，2×miRNA LRT Solution mix 10μL，Stem-loop primer（10μmol/L）1μL，miRNA L-RT Enzyme mix 1.5μL，RNasefree water 3.5μL，總體積為20μL。所得cDNA于4℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 對獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2×EsTaqMaster Mix 10μL，上下游引物各1.5μL，模板cDNA 3μL，ddH2O 4μL，總體積為20μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃5 min；94℃30 s，退火溫度58～63℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃5 min。4℃保存。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳及灰度分析 分別設(shè)置不同瓊脂糖凝膠電泳條件（瓊脂糖凝膠濃度2.0%、2.5%；電泳電壓100、80 V；電泳時間80、60 min）分離鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并利用Image J軟件在一定面積和像素數(shù)下，對不同電泳條件bta-miR-377的70 bp左右條帶除背景像素外的所有有效像素灰度平均值進(jìn)行灰度分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗重復(fù)3次，運用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；組間數(shù)據(jù)分析采用t檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同電泳條件對bta-miR-377條帶遷移的影響

RNA提取后，經(jīng)檢測RNA濃度與純度均符合試驗要求。經(jīng)2.0%、2.5%瓊脂糖凝膠于100 V電泳40 min后結(jié)果如圖1所示，已知bta-miR-377大小為70 bp，當(dāng)凝膠濃度為2.0%時，Marker條帶堆積、拖尾，且無法區(qū)分目的條帶；當(dāng)凝膠濃度為2.5%時，Marker條帶遷移效果較好，但略有拖尾，目的條帶出現(xiàn)70 bp左右，可見后者的分辨率高于前者，表明凝膠濃度為2.5%時適合bta-miR-377表達(dá)檢測。

進(jìn)一步對電泳電壓和時間進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)100 V延長電泳時間至60 min時，Marker條帶拖尾且目的條帶彌散，說明長時間高壓可能會導(dǎo)致緩沖液溫度過高而使DNA降解；80 V 60 min相較于100 V 60 min的Marker條帶完全分離，但目的條帶過寬，可能是由于電泳時間太短DNA分子沒有聚集；而80 V 80 min相較于80 V 60 min的Marker完全分離，且目的條帶集中清晰，沒有非特異性擴(kuò)增。

綜上可見，2.5%瓊脂糖凝膠、80 V 80 min為本研究范圍內(nèi)分離bta-miR-377的最優(yōu)電泳條件。

2.2 灰度分析

采用Image J軟件分析凝膠濃度為2.5%時，不同電壓和電泳時間下bta-miR-377條帶表達(dá)情況影響，其結(jié)果如圖2所示，時間分別為60 min和80 min時條帶灰度值差異極顯著（P＜0.01），表明時間長短對bta-miR-377條帶分布有影響，電泳中小片段的出現(xiàn)需較長時間；電壓分別為100 V和80 V時條帶灰度值差異顯著（P＜0.05），表明電壓大小對bta-miR-377表達(dá)有影響；凝膠濃度為2.5%、時間為80 min、電壓為80 V時，bta-miR-377條帶表達(dá)效果最好，灰度值最高，與電泳結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

近年來，miRNA的研究備受關(guān)注，運用靈敏、精確、快速的技術(shù)檢測miRNA表達(dá)具有重要意義[11]。相比于Nothern blot和微陣列技術(shù)，瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)具有快速簡便、成本低、特異性強(qiáng)的特點，后續(xù)可用于高通量檢測，其已被廣泛應(yīng)用于檢測miRNA表達(dá)中[12]。本研究在反轉(zhuǎn)錄過程中采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)法對bta-miR-377引物序列進(jìn)行特異性延長，解決了其序列較短難以檢測表達(dá)的問題，該方法相比于加尾法[13]，具有成本低、效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，普遍用于miRNA研究中。李衛(wèi)振等[14]采用莖環(huán)法設(shè)計siRNA序列特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)成功檢測出哺乳動物體內(nèi)抗病毒siRNA表達(dá)水平；高克儉等[15]利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)特異性引物反轉(zhuǎn)錄miRNA，并利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）檢測出單細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平；HU等[16]采用Stem-loop RT-PCR法分析了棉花中Gh-miR156和Gh-miR159的特異性表達(dá)，推動了棉花中miRNA的研究。本研究結(jié)果表明，莖環(huán)結(jié)構(gòu)法設(shè)計獲得的引物能夠有效鑒定bta-miR-377，此方法可行。

王杰等[17]利用RT-PCR技術(shù)分析miR-18和miR-224在原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）和癌旁組織中的差異表達(dá)量，設(shè)置凝膠濃度為2.0%、100 V 20 min條件下進(jìn)行電泳，并對電泳條帶進(jìn)行光密度分析，結(jié)果表明，miR-18和miR-224在HCC中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織；高雯華等[18]對小鼠雙側(cè)海馬中的miRNA-101半定量檢測時，利用凝膠濃度為2.5%、80 V 30 min條件下進(jìn)行；張金梅等[19]利用半定量RT-PCR對不同時間冷脅迫下金橘中miRNA的差異表達(dá)進(jìn)行鑒定時，PCR產(chǎn)物在凝膠濃度為1.5%、80 V 20 min條件下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并通過比較條帶強(qiáng)弱以確定miRNA在不同時間下的表達(dá)情況。以上研究表明，半定量RT-PCR可用于miRNA表達(dá)的鑒定，但在不同組織中檢測所需電泳條件不同，因此需對miRNA表達(dá)條件進(jìn)行不斷優(yōu)化。本試驗針對miRNA片段小的特點，首先對凝膠濃度進(jìn)行優(yōu)化；高電壓使緩沖液溫度升高導(dǎo)致DNA變性或降解，條帶泳動過快出現(xiàn)彌散，或時間過短片段不能完全分離或集中現(xiàn)象，通過優(yōu)化電源電壓和電泳時間，試驗結(jié)果顯示，凝膠濃度2.5%、80 V 80 min為bta-miR-377分離的最佳條件，該條件下條帶集中清晰，無彌散現(xiàn)象。

灰度分析是一種根據(jù)灰度值大小對所測樣品中目的蛋白表達(dá)量高低進(jìn)行定量分析的方法，具有分析快、結(jié)果直觀的特點，一般數(shù)值在0～255[20]。杜珍武等[21]利用Image J軟件對DNA的灰度值與DNA含量關(guān)系進(jìn)行分析，在相同面積和像素數(shù)下，對電泳條帶750 bp平均灰度值分析發(fā)現(xiàn)，DNA含量為50.0、66.8、83.5、100 ng時，與相應(yīng)的灰度值呈正向線性關(guān)系，即DNA含量越高，灰度值越高；沈海瀅等[22]對不同直徑毛細(xì)管中血清甲胎蛋白灰度值進(jìn)行分析，在不同抗體濃度和一定曝光時間下，大內(nèi)徑的毛細(xì)管中灰度值大，血清甲胎蛋白含量高，表明灰度值可用于分析核酸表達(dá)量。本研究在凝膠濃度為2.5%、電壓100 V、時間60 min時灰度值為86.111；凝膠濃度為2.5%、電壓100 V、時間80 min時灰度值為170.766，在電泳條件最佳時的灰度值為200.867，此時灰度值明顯高于其他條件，說明此條件下bta-miR-377表達(dá)量最高，可在該條件下進(jìn)行后續(xù)試驗。

本研究優(yōu)化了檢測bta-miR-377表達(dá)的瓊脂糖凝膠電泳條件，當(dāng)凝膠濃度為2.5%、電源電壓為80 V、電泳時間為80 min時可有效分離鑒定btamiR-377，利用簡便方式高效精準(zhǔn)鑒定其在牛下丘腦中有表達(dá)，為后續(xù)深入研究奠定了基礎(chǔ)；然而對bta-miR-377在牛下丘腦中功能和調(diào)控方式還不清楚，仍需進(jìn)一步研究。