陶 琦 劉希望 秦 哲 白莉霞 李世宏 李劍勇 楊亞軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

利福昔明是利福霉素衍生物(圖1)，其抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，局部給藥不易吸收，是高效低毒的抗生素。該藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌和厭氧菌等均有良好的抗菌活性；利福昔明(Rifaximin)是由意大利Alfa Wassermann S.P.A公司研制生產(chǎn)，1987年作為抗感染性腹瀉藥物在意大利上市，之后在國(guó)外被廣泛研究與應(yīng)用；2004年通過(guò)SFDA批準(zhǔn)，在我國(guó)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床；近年來(lái)亦被用于獸醫(yī)臨床。利福昔明在醫(yī)學(xué)臨床中常被用于胃腸疾病的治療，如炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)、腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome, IBS)等。在獸醫(yī)臨床中，利福昔明以灌注劑的形式用于動(dòng)物疾病的治療。子宮和乳房灌注給藥后，可在子宮和乳房?jī)?nèi)保持較高的藥物濃度，以殺滅其中的敏感病原菌，用于相關(guān)疾病的治療，如奶牛子宮內(nèi)膜炎和乳房炎等。

圖1 利福昔明結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of rifaximin

口服給藥是最為便捷的給藥途徑之一，而目前尚無(wú)口服的利福昔明制劑被批準(zhǔn)用于獸醫(yī)臨床?？诜幬镞M(jìn)入體內(nèi)會(huì)受到胃腸不同酸堿環(huán)境、消化酶、腸道菌群，以及腸壁、肝臟代謝酶的作用，從而影響其藥效的發(fā)揮。國(guó)內(nèi)獸醫(yī)臨床上，利福昔明以子宮和乳房灌注給藥為主。本研究采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)，考察了利福昔明在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性以及大鼠腸道菌群、腸道及肝勻漿等對(duì)其的降解作用，為獸用相關(guān)口服制劑的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

利福昔明對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度98.8%，批次：130496-201403),烏拉坦(NJKOCED，批號(hào)：C0028),胰蛋白酶(豬源，酶活 250 NFU/mg，索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：T8150),胃蛋白酶(豬源，酶活3 000-3 500 NFU/g，索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：P8390),磷酸鹽緩沖液(索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：D1040-500),厭氧培養(yǎng)基(CM1513，北京陸橋技術(shù)股份有限公司),乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)，鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器

超高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器(安捷倫1290)，勻漿機(jī)(IKA-T25)，離心機(jī)(Multifuge X3R)，厭氧培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，6只，雄性，8～10周，體重210～230 g，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：NKMYD201907018。在試驗(yàn)開始前，動(dòng)物經(jīng)過(guò)2周的隔離和適應(yīng)。所有的試驗(yàn)方案和程序，均獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.4 相關(guān)溶液配制

1

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4

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1

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱取利福昔明對(duì)照品適量，以乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃存放備用。使用前以乙腈稀釋，得到實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1

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4

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2

人工胃液的制備

按文獻(xiàn)方法[17]，取稀鹽酸16.4 mL，然后加水800 mL和胃蛋白酶10 g，充分溶解后，用3.65 g/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1.3后，加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工胃液?？瞻兹斯の敢旱呐渲疲翰缓傅鞍酌?，其余與人工胃液配制方法相同。

1

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4

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3

人工腸液的制備

按文獻(xiàn)方法[17]，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使其溶解，用4 g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；稱取胰蛋白酶10 g，加適量水使其充分溶解；將上述兩種溶液混合后，再以水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工腸液?？瞻兹斯つc液的配制：除不含胰蛋白酶，其余與人工腸液配制相同。

1

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4

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4

SD大鼠腸道菌群的制備,按參考文獻(xiàn)[18-19]，SD大鼠禁食12 h后，刺激腹部以采集新鮮糞便。將糞便與生理鹽水按比例(1 g∶5 mL)渦旋混合制成懸濁液，4 500 r/min離心10 min(4 ℃)，再將上清液與厭氧培養(yǎng)液按比例(

V

∶

V

=1∶9)混合，置厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃過(guò)夜，制得腸道菌群培養(yǎng)液待用。

1

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4

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5

空白組織樣品的制備

按參考文獻(xiàn)[20-22]，取SD大鼠(230～250 g) 6只，禁食不禁水過(guò)夜，腹腔注射烏拉坦麻醉后，迅速處死，采集肝臟、胃、小腸和大腸，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(4 ℃放置2 h)沖洗表面后剪碎，再將各組織與磷酸鹽緩沖液按質(zhì)量與體積比例(1 g∶5 mL)混合，置于勻漿機(jī)中均質(zhì)后，4 500 r/min離心10 min(4 ℃)，取上清液備用。離心前的操作均在冰浴條件下進(jìn)行。

1

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4

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6

厭氧培養(yǎng)基的制備

依培養(yǎng)基使用說(shuō)明，稱取厭氧培養(yǎng)基9.5 g，加水800 mL搖勻，然后加水稀釋并定容至1 000 mL，混勻后分裝于試管中，于高壓濕熱條件下滅菌，制成厭氧液體培養(yǎng)基(GAM)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 利福昔明的HPLC檢測(cè)方法

1

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5

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1

色譜條件參考文獻(xiàn)[23]，略有調(diào)整。Phenomenex luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相(A)為3.16 g/L甲酸銨，(B)為

V

∶

V

=1∶1，等度洗脫(

V

∶

V

=37∶63)；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；流速1.4 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；運(yùn)行時(shí)間10 min。

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5

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2

特異性分析

分別取空白人工胃液(1 mL)、空白人工腸液(1 mL)、人工胃液(1 mL)、人工腸液(1 mL)、人工胃液(1 mL)+利福昔明儲(chǔ)備溶液(10 μL)、空白人工腸液(1 mL)+利福昔明儲(chǔ)備液(10 μL)、空白人工胃液(1 mL)+利福昔明儲(chǔ)備液(10 μL)、空白腸道菌液(1 mL)、空白肝勻漿液(1 mL)、空白胃勻漿液(1 mL)、空白大腸及內(nèi)容物的勻漿液(1 mL)、空白小腸及內(nèi)容物的勻漿液(1 mL)。按照“1.7”項(xiàng)下的樣品前處理方法操作后，按“1.5.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)比色譜圖。觀察在利福昔明標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰位置處，是否有其他物質(zhì)干擾。

1

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5

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3

重現(xiàn)性

配制質(zhì)量濃度為10、40和100 μg/mL利福昔明標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份，再按“1.5.1”項(xiàng)下進(jìn)樣1次，記錄峰面積。

1.6 重復(fù)性

配制質(zhì)量濃度為10、40和100 μg/mL利福昔明標(biāo)準(zhǔn)溶液各1份，于不同時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12和24 h)按照 “1.5.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.7 利福昔明的穩(wěn)定性分析

1

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7

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1

利福昔明在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性測(cè)定

將上述制備好的空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液迅速分裝到EP管中(每管1 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，加入利福昔明儲(chǔ)備液(1 mg/mL)10 μL，混勻后于37 ℃水浴中孵育不同時(shí)間后分別取樣300 μL，加入冰乙腈(-20 ℃放置2 h)700 μL，渦旋混勻以終止反應(yīng)，于4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜后，按“1.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。

1

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2

利福昔明在SD大鼠腸道菌群中的穩(wěn)定性測(cè)定

移取過(guò)夜培養(yǎng)液1 mL于EP管中，分別加入利福昔明標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 μL，渦旋混勻后置入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，培養(yǎng)不同時(shí)間后分別取樣0.5 mL于EP管中(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，加入冰乙腈1 mL，渦旋混勻以終止反應(yīng)，11 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜后，按“1.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。以培養(yǎng)相同時(shí)長(zhǎng)不含利福昔明的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，同法操作。

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7

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3

利福昔明在空白組織樣品中的穩(wěn)定性測(cè)定

將上述制備好的上清液迅速分裝到EP管中(每管1 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，加入利福昔明標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 μL，混勻后置37 ℃水浴中孵育不同時(shí)間后，移取300 μL，加入700 μL冰乙腈，充分渦旋以終止反應(yīng)，12 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜后，按“1.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。

P

<0.05表示差異顯著，

P

<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定利福昔明的特異性分析

如圖2所示，在前述色譜條件下，利福昔明可被檢出，保留時(shí)間均為5.45 min，分離良好，不受背景干擾。表明在前述的樣品處理及色譜條件下，利福昔明的檢測(cè)不受基質(zhì)干擾。

(a)空白人工胃液；(b)空白人工胃液+10 μg/mL利福昔明；(c)人工胃液；(d)人工胃液+利福昔明；(e)空白人工腸液；(f)空白人工腸液+10 μg/mL利福昔明；(g)人工腸液；(h)空白大鼠菌液；(i)空白大鼠大腸及內(nèi)容物；(j)空白大鼠小腸及內(nèi)容物；(k)空白大鼠胃液；(l)空白大鼠肝液。利福昔明保留時(shí)間為5.45 min。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定利福昔明的重現(xiàn)性分析

如表1和2所示，利福昔明低、中、高3種質(zhì)量濃度在不同時(shí)間點(diǎn)所得到的峰面積和保留時(shí)間。峰面積的RSD值為分別為0.27%、0.26%和0.25%；保留時(shí)間的RSD值分別為0.67%、0.33%和0.13%。結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3 高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定利福昔明的重復(fù)性分析

檢測(cè)相同濃度的平行樣品得到的峰面積如表3所示。RSD 值為分別為0.22%、0.16%和0.26%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4 利福昔明在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性

以0 h時(shí)利福昔明的峰面積為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比，結(jié)果見圖3。如圖所示，經(jīng)過(guò)37 ℃孵育6 h后，在空白胃液、人工胃液及空白腸液、人工腸液中的相對(duì)剩余百分率分別為(91.57±1.29)%、(84.03±0.49)%、(81.14±1.69)%和(78.12±1.20)%。盡管空白人工胃液4 h和6 h孵育后的剩余百分比分別比3和5 h的稍高，但沒(méi)有顯著性差別且基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，主要原因可能是測(cè)定誤差造成的。結(jié)果說(shuō)明，利福昔明在堿性或消化酶存在的條件下更易降解。

表1 HPLC測(cè)定利福昔明時(shí)儀器響應(yīng)的穩(wěn)定性分析
Table 1 Stability analysis of instrument response for determination of rifaximin by HPLC

質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentration峰面積/(mAU·min) Chromatographic peak area0 h4 h8 h12 h24 h平均值A(chǔ)verage標(biāo)準(zhǔn)差SD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差/%RSD10171.1171.5171.1170.7171.9171.30.460.2740610.6608.1606.6607.1607.4608.01.570.261001 452.61 443.21 145.51 444.71 446.81 446.63.620.25

表2 HPLC測(cè)定利福昔明時(shí)儀器保留時(shí)間的穩(wěn)定性分析
Table 2 Stability analysis of instrument retention time for determination of rifaximin by HPLC

質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentration保留時(shí)間/min Retention time0 h4 h8 h12 h24 h平均值A(chǔ)verage標(biāo)準(zhǔn)差SD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差/%RSD105.3555.4495.4465.3845.4025.4070.0360.67405.4505.4595.4985.4505.4535.4620.0180.331005.4315.4285.4255.4295.4465.4320.0070.13

表3 HPLC測(cè)定利福昔明的重復(fù)性分析
Table 3 Repeatability analysis of rifaximin determination by HPLC

質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentration峰面積/(mAU·min) Chromatographic peak area123456平均值A(chǔ)verage標(biāo)準(zhǔn)差SD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差/%RSD10171.1171.2170.6171.3171.6170.7171.10.380.2240608.7606.7608.1607.9608.2609.6608.10.950.161001 442.61 446.71 444.61 445.91 452.814 50.71 447.23.830.26

圖3 利福昔明在人工胃腸液中的孵育后的剩余利百分比Fig.3 The remaining percentage of rifaximin after incubation in artificial gastrointestinal fluid

2.5 利福昔明在SD大鼠腸道菌群中的穩(wěn)定性

以0 h時(shí)利福昔明的峰面積為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比，結(jié)果見圖4。經(jīng)過(guò)37 ℃孵育12 h后，利福昔明在SD大鼠腸道菌群中孵育時(shí)發(fā)生了部分降解，但剩余百分比仍在90%上，總體表現(xiàn)出穩(wěn)定的趨勢(shì)。結(jié)果表明，利福昔明不易受SD大鼠腸道菌群的影響。

圖4 利福昔明在SD大鼠腸道菌群中的孵育后的剩余百分比(n=3)Fig.4 The remaining percentage of rifaximin in the intestinal flora of SD rats after incubation (n=3)

2.6 利福昔明在組織樣品中的穩(wěn)定性分析

以0 h時(shí)利福昔明的峰面積為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比，結(jié)果見圖5。如圖所示，經(jīng)37 ℃ 孵育6 h后，利福昔明在胃液、肝液、大腸及其內(nèi)容物、小腸及其內(nèi)容物的相對(duì)剩余百分率分別為(92.09±0.63)%、(75.95±0.14)%、(83.90±0.91)%和(78.24±0.35)%。結(jié)果表明，利福昔明在空白SD大鼠胃勻漿液中基本穩(wěn)定，但在空白SD大鼠肝勻漿液、大腸及內(nèi)容物勻漿液、小腸及內(nèi)容物勻漿液中有一定的降解。

圖5 利福昔明在生物樣品中孵育后的剩余百分比(n=3)Fig.5 The remaining percentage of rifaximin after incubation in biological samples (n=3)

3 討 論

口服給藥是最為便捷的給藥方式，藥物在胃腸道的穩(wěn)定性，直接影響其藥效的發(fā)揮。因此，對(duì)藥物在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，是新藥制劑研究開發(fā)的重要內(nèi)容。

利福昔明是半合成的利福霉素類抗菌藥物，抗菌活性強(qiáng)，作用范圍廣，口服后不易吸收，可在腸道局部高濃度環(huán)境而發(fā)揮抗菌優(yōu)勢(shì)。在獸醫(yī)臨床中，利福昔明僅以注入劑的形式，被用作奶牛子宮內(nèi)膜炎和乳房炎的治療。體外條件下考察胃腸液、腸道菌群、腸道及肝臟勻漿液對(duì)其穩(wěn)定性的影響，有助于利福昔明獸用口服制劑的研究與開發(fā)。

人工胃腸液模型包括人工胃液和人工腸液，腸道菌群可直接代謝藥物或作用于宿主系統(tǒng)，間接影響藥物代謝，動(dòng)物組織樣品勻漿液更加接近體內(nèi)環(huán)境；此三種體系易于制備，可在一定程度上反映體內(nèi)情況，以此考察藥物的穩(wěn)定性，有助于了解藥物在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性情況，探討影響藥物穩(wěn)定性的因素，有助于指導(dǎo)藥物結(jié)構(gòu)優(yōu)化和制劑的開發(fā)，在藥物研究與開發(fā)中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。

因此，本研究將利福昔明分別與人工胃腸液、SD大鼠(雄性)腸道菌群及不同組織樣品的勻漿液等共孵育，以考察pH、消化酶、腸道菌群和組織中的酶，對(duì)其穩(wěn)定性的影響。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：在體外模擬的胃腸道環(huán)境中，利福昔明是較穩(wěn)定的藥物，在酸性的空白人工胃液(不含酶)中總體呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)，而在堿性的人工腸液中有一定的降解，這可能與利福昔明的結(jié)構(gòu)有關(guān)。肝臟是藥物代謝的主要器官，其中肝臟藥物代謝酶發(fā)揮主要的作用。利福昔明在SD大鼠肝勻漿液中有一定的降解，說(shuō)明肝臟藥物代謝酶對(duì)利福昔明有一定的生物轉(zhuǎn)化作用；利福昔明在空白大鼠大腸及內(nèi)容物勻漿液、小腸及內(nèi)容物勻漿液中均有一定的降解，說(shuō)明腸道對(duì)其穩(wěn)定性有一定的影響。Descombe等對(duì)利福昔明做了人體藥動(dòng)學(xué)研究，結(jié)果顯示，志愿者口服給藥48 h后，一半以上血漿樣本未檢測(cè)出利福昔明，在給藥4 h后，僅有一半的血漿中能檢測(cè)出極少量的藥物(2～5.3 ng/mL)。在給藥后48 h，尿液樣本中檢測(cè)出微量的原形藥物；旅行者腹瀉患者每天口服利福昔明800 mg，連續(xù)口服3 d后，糞便中的原型藥物濃度非常高，平均為7 961 μg/g。研究結(jié)果表明，利福昔明在體內(nèi)主要以原形發(fā)揮作用，并通過(guò)糞便以原形排出體外。說(shuō)明利福昔明在胃腸道和肝臟內(nèi)的降解較少。本研究結(jié)果亦表明，利福昔明在不同條件下僅發(fā)生了少量降解，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。綜上，利福昔明在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，而在堿性條件下，胰蛋白酶、胃蛋白酶和腸壁、肝臟代謝酶等對(duì)其穩(wěn)定性的影響亦較為有限；因此，在開發(fā)獸用利福昔明口服制劑時(shí)，可減少對(duì)藥物本身穩(wěn)定性的考慮。后續(xù)將進(jìn)行體外Caco-2細(xì)胞試驗(yàn)，分析結(jié)腸上皮細(xì)胞對(duì)利福昔明的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)情況，為利福昔明開發(fā)獸用口服制劑提供數(shù)據(jù)支持。