龐圓圓,張曉媛,王 磊,袁 昕,路國濤,肖煒明

龐圓圓,張曉媛,路國濤,肖煒明,揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 江蘇省揚(yáng)州市 225000

王磊,揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院病理科 江蘇省揚(yáng)州市 225000

袁昕,揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科 江蘇省揚(yáng)州市 225000

0 引言

全球范圍內(nèi),結(jié)直腸癌是第三位最常見的惡性腫瘤,也是第二位最常見的惡性腫瘤死亡原因.據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)癌癥研究中心的GLOBOCAN項(xiàng)目估計,2018年全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)約為180萬,死亡人數(shù)約為88萬.Bufill依據(jù)胚胎起源、生理解剖、內(nèi)環(huán)境和分子生物學(xué)特征等差異提出,應(yīng)將結(jié)腸癌以結(jié)腸脾曲為界分為左、右結(jié)腸癌這兩種不同的疾病.研究發(fā)現(xiàn),DNA錯配修復(fù)(mismatch repair,MMR)蛋白在DNA復(fù)制過程中可以識別和修復(fù)錯配的堿基對,從而使DNA聚合酶和DNA連接酶能夠重新合成和重新結(jié)合正確的DNA鏈.MMR蛋白表達(dá)陰性會導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性,引起短重復(fù)DNA序列長度的改變,從而產(chǎn)生新的等位基因,此現(xiàn)象被稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI).近年來,有不少學(xué)者針對MMR蛋白與結(jié)直腸癌之間的臨床相關(guān)性展開研究,認(rèn)為MMR蛋白在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后評估中起重要作用,給臨床醫(yī)生提供了有價值的經(jīng)驗(yàn).結(jié)直腸癌是一種組織形態(tài)學(xué)、臨床和分子水平的異質(zhì)性疾病.可能通過以BRAF基因突變和高水平CpG島甲基化表型為特征的“鋸齒狀”途徑進(jìn)展;或是可能通過微衛(wèi)星不穩(wěn)定性進(jìn)展,并顯示出腫瘤抑制因子同源異型框轉(zhuǎn)錄因子(caudal-related homeobox transcription factor 2,CDX-2)的顯著缺失.CDX-2是具有較高敏感性的腸上皮特異標(biāo)志物,CDX-2表達(dá)下調(diào)與結(jié)腸癌分化不良和MMR缺陷相關(guān).此外p53通過協(xié)調(diào)一系列廣泛的DNA損傷修復(fù)機(jī)制來維持基因組穩(wěn)定,且MMR系統(tǒng)的MSH2、MLH1是p53介導(dǎo)的腫瘤抑制的關(guān)鍵組成部分,因此本文就錯配修復(fù)蛋白及CDX-2、p53在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及對臨床病理特征影響展開討論.

1 材料和方法

1.1 材料 收集2017-01/2021-03揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院收治的175例結(jié)直腸腺癌患者的臨床資料.

入組標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)腸鏡活檢或術(shù)后病理明確診斷為原發(fā)性結(jié)直腸腺癌.取材前或術(shù)前均未接受過放、化療或靶向治療,且臨床及病理資料完整.

排除標(biāo)準(zhǔn):排除既往有其他腫瘤病史;排除術(shù)前接受過放、化療或靶向治療的患者;排除合并特殊藥物使用致可能對結(jié)果有影響的患者;排除由于各種原因不能耐受手術(shù)或未在本院行手術(shù)治療的患者;其中男性113例,女性62例;年齡≤50歲16例,＞50歲159例;高/中分化153例,低分化22例;腫瘤病灶侵犯黏膜下層或固有肌層47例;穿透固有肌層128例;不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移110例,伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例;左半結(jié)腸癌65例,右半結(jié)腸癌47例,直腸癌63例.所有患者均簽署知情同意書,該項(xiàng)目已通過揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審查,意見號為:2021-YKL4-28-008.

1.2 方法

1.2.1 免疫組化:所有患者病理組織均經(jīng)本院病理科行免疫組織化學(xué)法檢測,結(jié)腸癌組織塊行固定、脫水、石蠟包埋連續(xù)切片,厚度約3 μm-5 μm,經(jīng)脫蠟復(fù)水、滅活內(nèi)源性酶、抗原修復(fù)、封閉后,采用二步法染色檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2及CDX-2、p53蛋白表達(dá),在進(jìn)行陰性對照時改用PBS代替一抗.將DAB顯色后的玻片用清水沖洗后,使用蘇木素溶液進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染.脫水封片(圖1).

圖1 MLH1、PMS2、CDX-2、p53蛋白在結(jié)直腸惡性腫瘤中的表達(dá)(免疫組化染色). A:MLH1(+);B:MLH1(-);C:PMS2(+);D:PMS2(-);E:CDX-2(+);F:CDX-2(-);G:p53(+);H:p53(-).

錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6、MLH1和PMS2表達(dá)于腫瘤細(xì)胞、正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞,呈細(xì)胞核棕黃色顆粒.腫瘤細(xì)胞核呈棕黃色表達(dá)判讀為陽性,即判定為MMR蛋白表達(dá)正常,定義為錯配修復(fù)基因完整(pMMR組);任意一項(xiàng)或多項(xiàng)不著色判讀為陰性,即判定為MMR蛋白表達(dá)陰性,定義為錯配修復(fù)基因表達(dá)陰性(dMMR組).判定過程由2名高年資病理科醫(yī)師雙盲法獨(dú)立進(jìn)行.隨機(jī)選取5個400倍視野計算每100個細(xì)胞中表達(dá)呈陽性的細(xì)胞數(shù),取其平均值作為檢測數(shù)值,按陽性細(xì)胞比例數(shù)分為:(-),≤10%;(+),11%-25%;(++),25%-50%;(+++),≥50%;有異議的病例,提交1名上級醫(yī)師重新判讀.

病理分期按第8版AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分期.統(tǒng)計并比較2組患者CDX-2、p53表達(dá)差異及年齡、性別、組織分化程度、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤位置等臨床病理特征差異.

采用SPSS 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.MMR、CDX-2、p53表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的差異進(jìn)行檢驗(yàn)、校正檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn).以＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中MMR蛋白的表達(dá) 根據(jù)免疫組化分析結(jié)果,175例結(jié)直腸腺癌患者中pMMR組136例,dMMR組39例,表達(dá)陰性率達(dá)22.3%,其中MSH2、MSH6、MLH1、PMS2的表達(dá)陰性者分別為12例(6.9%)、1例(0.6%)、17例(9.7%)、28例(16.0%).

2.2 MMR蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系

本文共分析175例結(jié)直腸腺癌中MMR蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系,MMR蛋白表達(dá)陰性與結(jié)直腸癌患者發(fā)病年齡、腫瘤位置及分化程度差異有顯著性(＜0.05,表1),在患者性別、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異均無顯著性(＞0.05,表1).

表1 MMR表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 不同MMR-CDX-2蛋白狀態(tài)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系 本文共分析91例結(jié)直腸腺癌中MMRCDX-2蛋白狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系,CDX-2表達(dá)陰性共34例(35.1%),CDX-2表達(dá)陰性病例中MMR表達(dá)陰性率(8.82%)高于CDX-2表達(dá)病例中MMR表達(dá)陰性率(6.35%),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析MMR表達(dá)與CDX-2表達(dá)無相關(guān)性(＞0.05,表2).

表2 MMR與CDX-2、p53的相關(guān)性

dMMR-CDX-2(+)蛋白組和dMMR-CDX-2(-)蛋白組相比,兩者在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤部位方面差異均無顯著性(＞0.05,表3).pMMR-CDX-2(+)蛋白組和pMMR-CDX-2(-)蛋白組相比,兩者在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤部位方面差異均無顯著性(＞0.05,表3).

表3 MMR及CDX-2表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

2.4 不同MMR-p53蛋白狀態(tài)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系 本文共分析28例結(jié)直腸腺癌中MMR-p53蛋白狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系,p53表達(dá)陰性共7例(25%),p53表達(dá)陰性病例中MMR表達(dá)陰性率(42.9%)高于p53表達(dá)病例中MMR表達(dá)陰性率(23.8%),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析MMR表達(dá)與p53表達(dá)無相關(guān)性(＞0.05,表2).dMMR-p53(+)蛋白組和dMMR-p53(-)蛋白組相比,兩者在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤部位方面差異均無顯著性(＞0.05,表4).pMMR-p53(+)蛋白組和pMMR-p53(-)蛋白組相比,兩者在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤部位方面差異均無顯著性(＞0.05,表4).

表4 MMR及p53表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生主要有兩條途徑:染色體不穩(wěn)定(chromosomal instability,CIN)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI),MSI是錯配修復(fù)(mismatch repair,MMR)缺陷的重要標(biāo)志,MMR系統(tǒng)對于糾正DNA復(fù)制過程中的DNA序列錯配起著至關(guān)重要的作用.這個修復(fù)系統(tǒng)主要由四種蛋白質(zhì)(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)相互作用來檢測錯配并將其剪除,從而使DNA聚合酶和DNA連接酶能夠重新合成和重新結(jié)合正確的DNA鏈.其中PMS2和MSH6分別與MLH1和MSH2相互作用,形成異源二聚體.MMR蛋白其表達(dá)與其主要配對(即MLH1和MSH2)的結(jié)合密切相關(guān).MSH2的表達(dá)陰性常常與MSH6的表達(dá)陰性相關(guān),這種模式高度提示MSH2胚系突變.同樣,MLH1的表達(dá)陰性通常與PMS2的表達(dá)陰性相關(guān),這種模式可能是MLH1胚系突變或MLH1基因啟動子的獲得性高甲基化所致.MSH6和PMS2的胚系突變通常分別與單獨(dú)的MSH6和PMS2蛋白表達(dá)陰性有關(guān).結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于MMR蛋白與結(jié)直腸癌相關(guān)性分析的文獻(xiàn),亞洲國家報道的MMR蛋白表達(dá)陰性率約為5.6%-19.24%,而本文涉及的腫瘤患者表達(dá)陰性率達(dá)22.3%,基本符合,由于各研究中MMR蛋白表達(dá)陰性率差異較大,推斷MMR蛋白表達(dá)陰性具有種族和地域差異性.在多項(xiàng)涉及中國結(jié)直腸癌患者的研究中,MMR蛋白表達(dá)陰性率達(dá)6.7%-7.6%,主要表現(xiàn)為MLH1、PMS2雙表達(dá)陰性,認(rèn)為MMR蛋白表達(dá)陰性在結(jié)直腸癌患者發(fā)病年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期均有顯著性差異,而與患者性別方面無關(guān).提出MMR蛋白表達(dá)陰性在50歲以下、右半結(jié)腸、低分化腺癌、TNM分期Ⅰ＋Ⅱ期的患者中有相對更高的發(fā)病率.而也有作者認(rèn)為結(jié)直腸癌MMR蛋白表達(dá)陰性與腫瘤位置、分化類型及組織學(xué)類型有關(guān),而與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期無關(guān).本研究中MMR蛋白表達(dá)陰性共39例(22.3%),其中MSH2、MSH6、MLH1、PMS2的表達(dá)陰性分別為12例(6.9%)、1例(0.6%)、17例(9.7%)、28例(16.0%).通過統(tǒng)計學(xué)分析得出,MMR蛋白表達(dá)陰性與結(jié)直腸癌患者發(fā)病年齡、腫瘤部位及分化程度差異有顯著性(＜0.05),好發(fā)于年齡≤50歲、右半結(jié)腸、低分化腫瘤患者,而與患者性別、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān).本文結(jié)論與以上研究結(jié)論相一致.

CDX-2是腸特異性的核轉(zhuǎn)錄因子,在小腸及結(jié)直腸上皮的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用,CDX-2的表達(dá)幾乎完全局限于胃腸道,它在日常診斷程序中被用作識別腸源性腫瘤的標(biāo)志物.CDX-2表達(dá)降低與癌細(xì)胞的遷移和侵襲增加有關(guān),并可能通過破壞WNT通路信號在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用.結(jié)直腸癌患者中,CDX-2表達(dá)與微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stable,MSS)患者的預(yù)后有一定的相關(guān)性,主要表現(xiàn)為CDX-2表達(dá)陰性患者預(yù)后不佳,而MSI-CDX-2表達(dá)陰性的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較低.CDX-2表達(dá)陰性可能只在MSS結(jié)直腸癌患者亞組中是一個較差的預(yù)后因素.此前多項(xiàng)研究認(rèn)為CDX-2表達(dá)陰性與腫瘤大小、位置、分化程度、浸潤深度和淋巴浸潤及神經(jīng)侵襲相關(guān);提出CDX-2表達(dá)陰性患者在較大的原發(fā)灶、右半結(jié)腸、高分化、較深的浸潤深度的患者中有相對更高的發(fā)病率,轉(zhuǎn)移灶中的CDX-2表達(dá)陰性與dMMR顯著相關(guān).MMR表達(dá)陰性與CDX-2在腫瘤中的表達(dá)降低顯著相關(guān);且CDX-2表達(dá)陰性與生存率惡化相關(guān),CDX-2的表達(dá)陰性是MMR表達(dá)陰性的敏感和特異性預(yù)測因子.同時,也有部分研究認(rèn)為CDX-2表達(dá)陰性與臨床病理特征無明顯相關(guān)性,PMS2表達(dá)陰性與CDX-2表達(dá)陰性顯著相關(guān).CDX-2表達(dá)陰性存在多種機(jī)制:DNA甲基化、雜合性缺失、基因位點(diǎn)擴(kuò)增和MSI,這些機(jī)制都已被報道可調(diào)節(jié)CDX2的表達(dá).CDX-2的蛋白低表達(dá)可能發(fā)生在無蒂鋸齒狀腺瘤(鋸齒狀通路的前體病變)后和進(jìn)展為癌癥之前,其基因很少發(fā)生突變,蛋白的低表達(dá)伴隨著CDX-2 mRNA的低表達(dá),反映了轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),這可能是CDX-2調(diào)節(jié)中最重要的因素.CDX2缺失與MMR缺乏、BRAFV突變和高CIMP表達(dá)有顯著且特異的關(guān)聯(lián).在多項(xiàng)研究中均有證據(jù)表明CDX-2可能在結(jié)直腸癌的MSI/鋸齒狀通路中發(fā)揮作用,但該分子是否真的作為該通路內(nèi)腫瘤進(jìn)展的原因而非結(jié)果參與功能尚未確定.本研究發(fā)現(xiàn)dMMR病例中CDX-2表達(dá)陰性率(42.9%)高于pMMR病例中CDX-2表達(dá)陰性率(34.4%),通過統(tǒng)計學(xué)分析得出,dMMR病例中CDX-2基因突變狀態(tài)與患者各臨床病理特征均無相關(guān)性(＞0.05),MMR表達(dá)陰性與CDX-2表達(dá)陰性無相關(guān)性(＞0.05),這一結(jié)論與上述研究有所差異,可能由于本組病理組織均采自原發(fā)灶,且不能排除地區(qū)及種族差異性,后續(xù)或可對轉(zhuǎn)移灶批量行免疫組化染色及統(tǒng)計分析.

p53參與細(xì)胞增殖、分化、DNA損傷修復(fù)和凋亡的調(diào)節(jié),其突變被認(rèn)為是結(jié)直腸腺瘤向癌發(fā)展中相對較晚的事件,作為結(jié)直腸癌預(yù)后評估指標(biāo)的作用仍有爭議.MMR在p53抑制腫瘤發(fā)展中起重要的協(xié)調(diào)作用,且MMR系統(tǒng)的MLH1基因作為p53下游靶基因參與抑制腫瘤的發(fā)展,MLH1的表達(dá)陰性或者p53基因的突變均會促進(jìn)腫瘤的發(fā)展.MLH1是p53介導(dǎo)的腫瘤抑制的關(guān)鍵貢獻(xiàn)者,一項(xiàng)涉及淋巴瘤及結(jié)直腸癌的研究中作者驗(yàn)證了p53的丟失不僅會導(dǎo)致MLH1的表達(dá)減少,而且會導(dǎo)致DNA修復(fù)基因的表達(dá)減少,并可能推動腫瘤的發(fā)生.在多項(xiàng)涉及結(jié)直腸癌患者的臨床研究中,認(rèn)為MMR表達(dá)陰性與p53基因突變狀態(tài)無相關(guān)性,但對于dMMR病例中p53基因突變狀態(tài)與患者各臨床病理特征有無相關(guān)性仍存在爭議,同樣,也有研究認(rèn)為MMR蛋白表達(dá)陰性與p53基因突變狀態(tài)有顯著相關(guān)性,以上研究皆認(rèn)同p53表達(dá)水平對總生存率和無病生存率沒有預(yù)后影響.本研究通過統(tǒng)計學(xué)分析得出,dMMR病例中p53基因突變狀態(tài)與患者各臨床病理特征均無相關(guān)性(＞0.05),MMR表達(dá)陰性與p53基因突變無相關(guān)性(＞0.05),這雖與上述研究部分結(jié)論一致,但由于本文涉及臨床病例中檢測的局限性,關(guān)于p53的數(shù)據(jù)共計28例,因此得出的結(jié)論及臨床意義存在一定的缺陷;考慮到樣本量原因,且CDX-2及p53相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)分析后無意義,故本文未對其做進(jìn)一步探討,必要時或可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量行檢驗(yàn)分析.

MSI的主要病理特征為粘液成分、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)和克羅恩樣淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Crohn’s-like lymphocytic reaction,CLR),而本文未討論單純型粘液腺癌,是為本文的不足之處,不排除因此對其余統(tǒng)計學(xué)結(jié)果產(chǎn)生偏倚.

4 結(jié)論

綜上所述,MMR蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者發(fā)病年齡、腫瘤部位及分化程度有關(guān),而與患者性別、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及p53、CDX-2表達(dá)無關(guān).檢測MMR蛋白對結(jié)直腸腺癌的早期診斷、制定治療方案及評估預(yù)后具有重要的臨床意義.

結(jié)直腸癌為臨床常見惡性腫瘤,錯配修復(fù)蛋白及CDX-2、p53的表達(dá)陰性明確與其發(fā)生發(fā)展相關(guān),錯配修復(fù)蛋白與CDX-2、錯配修復(fù)蛋白與p53間存在相互關(guān)系.本文探討三者與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性,以期對其相互關(guān)系做進(jìn)一步驗(yàn)證.

隨著結(jié)直腸癌患者的增多及年輕化,本研究主題為利用統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)直腸腺癌患者腫瘤原發(fā)灶中錯配修復(fù)蛋白及CDX-2、p53及臨床病理特征的相關(guān)性,以期驗(yàn)證三者對何臨床病理特征存在影響.

本研究主要目標(biāo)為探討結(jié)直腸腺癌患者腫瘤原發(fā)灶中錯配修復(fù)蛋白及CDX-2、p53的表達(dá)與臨床病理特征是否存在相關(guān)性,旨在為結(jié)直腸癌的臨床治療和預(yù)后評價提供一個有效的參考依據(jù).

選取175例揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院收治的結(jié)直腸腺癌患者,采用免疫組化方法檢測腫瘤原發(fā)灶中錯配修復(fù)蛋白(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)及CDX-2、p53的表達(dá)情況,采用檢驗(yàn)統(tǒng)計分析各組中的分布差異,采用Spearman等級相關(guān)統(tǒng)計分析各指標(biāo)間的相關(guān)性.

175例結(jié)直腸腺癌患者中四種錯配修復(fù)蛋白表達(dá)陰性比例為22.3%,其中MLH1、PMS2的表達(dá)陰性比例較高,分別為9.7%及16.0%;91例結(jié)直腸腺癌中CDX-2表達(dá)陰性比例為35.1%,28例結(jié)直腸腺癌中p53表達(dá)陰性比例為25%.dMMR與結(jié)直腸腺癌患者發(fā)病年齡、腫瘤部位及分化程度有顯著性,在患者性別、腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異均無顯著性.錯配修復(fù)蛋白與CDX-2、p53表達(dá)水平相關(guān)性無顯著性.

錯配修復(fù)蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征-發(fā)病年齡、腫瘤部位及分化程度有關(guān).腫瘤原發(fā)灶中錯配修復(fù)蛋白的檢測對于結(jié)直腸腺癌的早期診斷、風(fēng)險管理評估及預(yù)后評價具有一定的參考意義.

本研究收集的病例數(shù)有限,研究結(jié)果可能存在一定偏倚,后續(xù)工作中仍需納入更多病例進(jìn)一步驗(yàn)證.未來我們將調(diào)整樣本量,同時分析腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶,探究錯配修復(fù)蛋白及CDX-2、p53三者間的相關(guān)性,并進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)制分析.