朱麗燕,占路娟,盧吉英

朱麗燕,占路娟,浙江衢化醫(yī)院消化內科 浙江省衢州市 324000

盧吉英,金華市中心醫(yī)院肛腸科 浙江省金華市 321099

0 引言

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是癌癥相關死亡的主要原因之一,預測顯示,到2030年CRC年新增病例將超過220萬例,年死亡病將超過110萬例.CRC患者預后不良與腫瘤轉移有關.因此,明確CRC轉移機制對于開發(fā)新的治療策略、改善CRC患者預后意義重大.環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是非編碼RNA家族成員,具有閉環(huán)結構,缺少5’端和3’端.circRNA表達異常與CRC等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關.資料顯示,環(huán)狀RNA VANGL1(circRNA VANGL1,circ_VANGL1)在膀胱癌中表達升高,其高表達與患者預后不良以及癌細胞異常增殖和侵襲有關.靶基因預測顯示,微小RNA(microRNA,miR)-493-5p是circ_VANGL1的潛在靶點.miR-493-5p在CRC中表達水平降低,miR-493-5p的上調可降低CRC細胞惡性增殖和遷移能力.靶基因預測還顯示,脆性X相關基因1(fragile X-related gene 1,FXR1)是miR-493-5p的潛在靶點.此前研究表明,FXR1高表達與CRC患者預后差相關,它可增強CRC細胞增殖、侵襲能力,發(fā)揮腫瘤啟動子作用.基于上述文獻,本研究以miR-493-5p、FXR1為切入點,探討circ_VANGL1在CRC中的作用和分子機制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源:CRC組織和對應癌旁組織為2017-06/2019-06在我院接受手術治療的29例CRC患者的組織樣本.其中,男性18例,女性11例,年齡45-75歲,中位年齡64歲.入組患者術前均未接受化療或放療,且將急性或慢性感染、其他原發(fā)惡性腫瘤患者排除在外.本研究經(jīng)我院倫理委員會批準,并獲得每位患者的知情同意.CRC組織樣本在液氮中冷凍,并在-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 細胞和試劑:CRC細胞Caco-2購自美國ATCC;SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自大連Takara公司;TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒、M-MLV逆轉錄酶購自北京百奧萊博生物公司;放射免疫沉淀測定(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、化學發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀生物公司;細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)兔多抗(ab9485)、FXR1兔多抗(ab155124)、山羊抗兔IgG抗體(ab205718)購自中國Abcam公司;Transwell室(24孔)購自美國Corning公司;重組熒光素酶報告載體購自廣州銳博生物公司.

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測CRC組織circ_VANGL1和miR-493-5p表達:為檢測circ_VANGL1表達用M-MLV逆轉錄酶合成cDNA.為檢測miR-493-5p表達用TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA.采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行RT-qPCR檢測組織樣品中circ_VANGL1和miR-493-5p表達.2法計算相對表達量.GAPDH為circ_VANGL1的內參,U6為miR-493-5p的內參.引物序列:circ_VANGL1上游5′-CTACAGCC TGGGACACCTGAG-3′,下游5′-CCTCTGCCGTCTTTATTG-3′;GAPDH上游5′-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′,下游5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3′;miR-493-5p上游5′-TCCTACGGAGAGGCTCAG-3′,下游5′-TCCTCGTAGTCCAACACG-3′;U6上游5′-CTCGCTTC GGCAGCACA-3,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′.1.2.2 Western blot檢測CRC組織FXR1蛋白表達:RIPA裂解液提取CRC組織和癌旁組織樣本中總蛋白.取50 μg變性蛋白上樣到10%凝膠上進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,隨后濕轉到PVDF膜上.膜用5%脫脂牛奶封閉后,分別進行一抗反應、二抗反應.向PVDF膜滴加化學發(fā)光溶液顯影.GAPDH作為內參,應用Image J軟件分析FXR1蛋白相對表達量.

1.2.3 細胞培養(yǎng)和實驗分組:Caco-2細胞在37 ℃、含95%空氣、含5% CO的培養(yǎng)箱中,用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng).取1×10個第3代對數(shù)期Caco-2細胞接種24孔板.將脂質體Lip2000、待轉染序列分別溶于50 μL無血清培養(yǎng),孵育5 min后將Lip2000與待轉染序列混勻,并在室溫靜置20 min.當細胞50%匯合時,棄去培養(yǎng)液,加入100 μL混合物和400 μL無血清培養(yǎng)基,孵育6 h更換為500 μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基.收集轉染48 h Caco-2細胞,RT-qPCR檢測細胞中circ_VANGL1和/或miR-493-5p相對水平.根據(jù)轉染序列不同,Caco-2細胞分為si-circ_VANGL1組、si-NC組、miR-NC組、miR-493-5p mimic組、si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組.1.2.4 CCK-8和克隆形成實驗檢測細胞增殖:CCK-8實驗:每組取5×10個Caco-2細胞接種96孔板,培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入90 μL DMEM培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)孵育2.5 h.酶標儀測定450 nm處吸光度(A)值.抑制率=(1-A/A)×100%.

克隆形成實驗:每組取4×10個Caco-2細胞接種到6孔板,晃動平板使細胞均勻分散.培養(yǎng)箱孵育約2 w直到現(xiàn)細胞克隆.取出6孔板,棄去培養(yǎng)液.磷酸鹽緩沖液小心漂洗2次,室溫下用甲醇固定20 min,用0.1%結晶紫染色20 min.顯微鏡下拍照,計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù).1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲:每組取1×10個Caco-2細胞懸浮在200 μL無血清培養(yǎng)基中,并接種到Transwell裝置上室.Transwell裝置下室加入500 μL含有20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為Caco-2轉移的化學誘導劑.將Transwell裝置放入培養(yǎng)箱孵24 h.取出Transwell裝置,用棉簽將上室擦去上室非遷移細胞,用甲醇固定膜下表面遷移細胞,0.1%結晶紫染色后,置于倒置顯微鏡下拍照,隨機選擇5個視野計數(shù)染色數(shù),以平均值表示細胞遷移數(shù)量.侵襲測定時先用基質膠包被Transwell裝置上室膜,其與步驟同遷移檢測.

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗:將包含miR-493-5p

結合位點的circ_VANGL1或FXR1-3’-非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)野生型(wild type,WT)序列以及不含miR-493-5p結合位點的circ_VANGL1或FXR1-3’-UTR突變型(mutant type,MUT)序列克隆到雙熒光素酶報告基因pmirGLO載體中,構建成重組載體WT-circ_VANGL1、WT-FXR1、MUT-circ_VANGL1、MUT-FXR1.將上述重組載體分別與miR-493-5p mimic或miR-NC共轉染Caco-2細胞.轉染48 h裂解細胞,雙熒光素酶報告物檢測系統(tǒng)評估Caco-2細胞相對熒光素酶活性.

用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以mean±SD表示.兩組數(shù)據(jù)的差異采用獨立樣本檢驗分析,多組間的數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析和-檢驗.＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 CRC組織中circ_ VANGL1、miR-493-5p和FXR1表達的檢測 CRC組織中circ_ VANGL1相對水平、FXR1蛋白表達顯著高于癌旁組織(＜0.05),miR-493-5p相對水平顯著低于癌旁組織(＜0.05).見圖1和表1.

表1 circ_ VANGL1、miR-493-5p和FXR1表達的檢測

圖1 bP＜0.01與癌旁組織組相比.CRC組織:結直腸癌組織;FXR1:脆性X相關基因1.

2.2 沉默circ_VANGL1對Caco-2增殖、遷移、侵襲的影響 轉染si-circ_VANGL1后Caco-2細胞circ_VANGL1相對水平顯著低于si-NC組(＜0.05),表明轉染si-circ_VANGL1可抑制circ_VANGL1表達.與si-NC組比較,sicirc_VANGL1組Caco-2細胞miR-493-5p相對水平、抑制率顯著升高(＜0.05),FXR1蛋白表達、克隆形成數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著降低(＜0.05).見圖2和表2.

表2 沉默circ_VANGL1抑制Caco-2增殖、遷移、侵襲(mean±SD,n=9)

圖2 沉默circ_VANGL1抑制Caco-2遷移、侵襲、克隆及細胞FXR1蛋白的表達.A:si-circ_VANGL1組 vs si-NC組Caco-2細胞遷移、侵襲數(shù)減少;B:si-circ_VANGL1組 vs si-NC組Caco-2細胞克隆數(shù)減少;C:si-circ_VANGL1組 vs si-NC組Caco-2細胞總FXR1蛋白表達降低.FXR1:脆性X相關基因1.

2.3 circ_VANGL1、miR-493-5p靶向關系 Starbase預測到circ_VANGL1和miR-493-5p存在互補序列,見圖3.與miR-NC和WT-circ_VANGL1共轉染比較,miR-493-5p mimic和WT-circ_VANGL1共轉染后細胞相對熒光素酶活性顯著降低(＜0.05),與miR-NC和MUT-circ_VANGL1共轉染比較,miR-493-5p mimic和MUT-circ_VANGL1共轉染后細胞相對熒光素酶活性差異不顯著,見表3.

圖3 circ_VANGL1和miR-493-5p的互補序列.WT-VANGL1:野生型VANGL1;MUT-VANGL1:突變型VANGL1.

表3 雙熒光素酶報告實驗(mean±SD,n=9)

2.4 miR-493-5p對Caco-2增殖、遷移、侵襲的影響 轉染miR-493-5p mimic后Caco-2細胞miR-493-5p相對水平顯著高于miR-NC組(＜0.05),表明轉染miR-493-5p mimic可促進miR-493-5p表達.與miR-NC組比較,miR-493-5p mimic組Caco-2細胞抑制率顯著升高(＜0.05),FXR1蛋白表達、克隆形成數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著降低(＜0.05).見圖4和表4.

圖4 miR-493-5p抑制Caco-2遷移、侵襲、克隆及細胞中FXR1蛋白的表達.A:miR-493-5p mimic組 vs miR-NC組Caco-2細胞遷移、侵襲數(shù)減少;B:miR-493-5p mimic組 vs miR-NC組Caco-2細胞克隆數(shù)減少;C:miR-493-5p mimic組 vs miR-NC組Caco-2細胞中FXR1蛋白表達減少.FXR1:脆性X相關基因1.

表4 miR-493-5p抑制Caco-2增殖、遷移、侵襲(mean±SD,n=9)

2.5 miR-493-5p和FXR1靶向關系 Targetscan預測到miR-493-5p和FXR1-3’-UTR存在互補序列,見圖5.與miR-NC和WT-FXR1共轉染比較,miR-493-5p mimic和WT-FXR1共轉染后細胞相對熒光素酶活性顯著降低(＜0.05),與miR-NC和MUT-FXR1共轉染比較,miR-493-5p mimic和MUT-circ_FXR1共轉染后細胞相對熒光素酶活性差異不顯著,見表5.

圖5 miR-493-5p和FXR1的互補序列.FXR1:脆性X相關基因1;WT-FXR1:野生型FXR1;MUT-FXR1:突變型FXR1.

表5 雙熒光素酶報告實驗(mean±SD,n=9)

2.6 抑制miR-493-5p對沉默circ_VANGL1處理的Caco-2增殖、遷移、侵襲的影響 與si-circ_VANGL1組比較,si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組Caco-2細胞miR-493-5p相對水平、抑制率顯著降低,FXR1蛋白表達、克隆形成數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著升高(＜0.05),見圖6和表6.

圖6 抑制miR-493-5p可逆轉沉默circ_VANGL1對Caco-2遷移、侵襲、克隆及細胞中FXR1蛋白表達的抑制作用.A:si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組 vs si-circ_VANGL1組Caco-2細胞遷移、侵襲數(shù)增加;B:si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組 vs si-circ_VANGL1組Caco-2細胞克隆數(shù)增加;C:si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組 vs si-circ_VANGL1組Caco-2細胞中FXR1蛋白表達增高;FXR1:脆性X相關基因1.

表6 抑制miR-493-5p可逆轉沉默circ_VANGL1對Caco-2增殖、遷移、侵襲的抑制作用(mean±SD,n=9)

3 討論

越來越多的證據(jù)表明,circRNA在CRC組織、細胞系和血漿中異常表達,與結直腸癌的臨床惡性特征密切相關,如hsa_circ_0005273,circRNA_0000392.然而CRC中circ_VANGL1的表達及潛在功能仍然未知.circ_VANGL1在人非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中表達增加,其高表達與NSCLC患者總生存期縮短、較差的臨床病理特征相關,且circ_VANGL1通過與miR-195相互作用促進NSCLC細胞增殖和其遷移,加速NSCLC進展.circ_VANGL1在膀胱癌中表達上調,circ_VANGL1沉默通過調節(jié)miR-1184/胰島素樣生長因子結合蛋白2分子軸抑制膀胱癌細胞惡性生物學行為.胃癌中circ_VANGL1表達增加,慢病毒載體介導的circ_VANGL1下調可激活線粒體凋亡通路,誘導胃癌細胞凋亡.本研究首次揭示了CRC組織中circ_VANGL1相對水平升高,提示circ_VANGL1可能在CRC進展中發(fā)揮促癌作用.功能實驗顯示,沉默circ_VANGL1表達可降低Caco-2細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,表明circ_VANGL1在CRC細胞增殖和轉移中具有致癌作用.

目前研究認為circ_VANGL1可作為miRNA“海綿”抑制miRNA對其靶mRNA表達的調節(jié)作用,進而參與調控細胞生物學過程和疾病進展,例如circ_VANGL1通過靶向miR-217上調核心結合因子α1表達能夠調控成骨分化和骨質疏松進展.本研究證實circ_VANGL1可靶向負調控miR-493-5p.研究表明miR-493-5p靶向DKK2可抑制CRC細胞有氧糖酵解和血管生成.miR-493-5p通過靶向FUT4能夠減弱人乳腺癌的侵襲性和致瘤性.長鏈非編碼RNA NR2F1-AS1充當miR-493-5p的“分子海綿”上調整合素β1的表達促進NSCLC發(fā)生和轉移.本研究發(fā)現(xiàn)CRC組織中miR-493-5p表達降低,轉染miR-493-5p mimic過表達miR-493-5p可降低Caco-2細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,這與Cui等報道吻合.FXR1是脊椎動物中高度保守的胞漿RNA結合蛋白,其腫瘤發(fā)生中作用已被研究.FXR1在膠質瘤中表達增加,下調FXR1可抑制膠質瘤進展.前列腺癌細胞中FXR1表達缺失與細胞增殖、遷移、侵襲能力的減弱有關.FXR1通過與circ_0000079相互作用降低NSCLC細胞的侵襲性和耐藥性.本研究發(fā)現(xiàn)CRC組織中FXR1蛋白表達增加,并證實FXR1為miR-493-5p的直接靶點.由于沉默circ_VANGL1表達、過表達miR-493-5p均可下調FXR1蛋白表達、抑制CRC細胞惡性生物學行為,本研究推測在CRC中存在circ_VANGL1/miR-493-5p/FXR1調控途徑.為證實沉默circ_VANGL1在CRC中的抗癌作用依賴于上調miR-493-5p/FXR1軸,本研究將si-circ_VANGL1和miR-493-5p Inhibitor共轉染Caco-2細胞,結果顯示,抑制miR-493-5p表達顯著減弱沉默circ_VANGL1對FXR1蛋白表達的抑制作用以及對Caco-2細胞的抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用,這表明circ_VANGL1至少通過調控miR-493-5p/FXR1軸在CRC中發(fā)揮作用.

4 結論

總之,CRC組織中circ_VANGL1和FXR1蛋白表達上調,miR-493-5p表達下調.沉默circ_VANGL1通過調控miR-493-5p/FXR1軸抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲.因此,靶向抑制circ_VANGL1/miR-493-5p/FXR1途徑有可能成為CRC治療的新方向.

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)已逐漸成為全球人類健康和生命最致命的威脅之一.盡管有報道表明circRNA與CRC的進展和轉移有關,但在這些過程中,circRNA的生物學功能仍然很大程度上未知,包括circ_VANGL1.

探討circ_VANGL1在CRC中的表達情況,以及是否通過調控miR-493-5p/FXR1軸影響CRC細胞增殖、遷移和侵襲.這對于明確CRC轉移機制對于開發(fā)新的治療策略、改善CRC患者預后意義重大.

確定circ_VANGL1在CRC中的表達,并闡明circ_VANGL1是否通過調控miR-493-5p/FXR1軸影響CRC細胞增殖、遷移和侵襲.

采用RT-qPCR檢測CRC組織中circ_VANGL1表達,采用細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、克隆形成實驗、Transwell實驗評估沉默circ_VANGL1對Caco-2增殖能力、遷移和侵襲能力的影響.雙熒光素酶報告實驗檢測miR-493-5p和circ_VANGL1、FXR1之間的靶向關系.

研究達到實驗目標,本研究首次發(fā)現(xiàn)CRC組織中circ_VANGL1表達增強,而沉默circ_VANGL1表達使CRC Caco-2細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力被抑制.此外,circ_VANGL1通過充當miR-493-5p的分子海綿,調控Caco-2細胞中FXR1的表達.

circ_VANGL1通過靶向miR-493-5p調節(jié)CRC細胞中FXR1的表達,來促進細胞增殖和轉移,作為致癌circRNA促進CRC進展.

因此,靶向抑制circ_VANGL1/miR-493-5p/FXR1途徑有可能成為CRC治療的新方向.未來將進一步利用動物模型探討circ_VANGL1/miR-493-5p/FXR1在CRC中的功能.