齊越 李昭 侯俠 黃培池 賈冬 楊彩瑜 董笑博 房小楠 明彩榮

中圖分類(lèi)號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）09-1062-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.09.07

摘 要 目的 研究癲癇清顆粒通過(guò)調(diào)控核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體信號(hào)通路對(duì)阿爾茨海默病（AD）模型小鼠血腦屏障（BBB）損傷的改善作用。方法 將125只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=25）和造模組（n=100）。造模組小鼠采用側(cè)腦室注射β-淀粉樣蛋白25～35的方法復(fù)制AD模型;假手術(shù)組小鼠同法注射生理鹽水。選取造模成功的100只小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、鹽酸多奈哌齊片組（陽(yáng)性對(duì)照1，1.3 mg/kg，灌胃給藥）、MCC950組[陽(yáng)性對(duì)照2（選擇性NLRP3抑制劑），10 mg/kg，腹腔注射給藥]和癲癇清顆粒組（以生藥總量計(jì)12.48 g/kg，灌胃給藥），每組25只。造模后第2天，各給藥組小鼠給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)21 d;假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃水并腹腔注射生理鹽水。末次給藥后，采用Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，采用伊文思藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠BBB通透性;檢測(cè)小鼠腦組織中NLRP3、離子鈣接頭蛋白（IBA-1）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）p65、p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（PUMA）、咬合蛋白（ocln）、閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）、緊密連接蛋白5（cldn5）的表達(dá)水平。結(jié)果 與模型組比較，各給藥組小鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率和腦組織中ocln、cldn5、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），腦組織內(nèi)的伊文思藍(lán)含量及NLRP3、IBA-1、PUMA、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 癲癇清顆?？赏ㄟ^(guò)抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路起到改善AD模型小鼠BBB損傷的作用。

關(guān)鍵詞 癲癇清顆粒;阿爾茨海默病;血腦屏障;核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白 3炎癥小體;緊密連接蛋白

Improvement effects of Dianxianqing granule on blood-brain barrier injury in Alzheimer’s disease model mice

QI Yue1，LI Zhao2，HOU Xia1，HUANG Peichi1，JIA Dong3，YANG Caiyu3，DONG Xiaobo3，F(xiàn)ANG Xiaonan2，MING Cairong3（1. Dept. of Pharmaceutical Technology， Jiangsu Provincial Xuzhou Pharmaceutical Vocational College， Jiangsu Xuzhou 221116， China; 2. Dept. of Pharmacology， College of Pharmacy， Shenyang Medical College， Shenyang 110031， China; 3. Dept. of Pharmacology， the Second Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM， Shenyang 110034， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To study the improvement effects of Dianxianqing granule on blood-brain barrier （BBB） injury in Alzheimer’s disease （AD） model mice by regulating NLR family pyrin domain containing 3 （NLRP3） inflammasome signaling pathway. METHODS Totally 125 mice were randomly divided into sham operation group （n=25） and modeling group （n=100） by body weight. AD model was induced by intracerebroventricular injection of β-amyloid 25-35 in model group. Sham operation group was given normal saline with same method. The 100 model mice were randomly divided into model group， Donepezil hydrochloride tablets group （positive control 1，1.3 mg/kg，i.g.）， MCC950 group [positive control 2 （selective NLRP3 inhibitor），10 mg/kg， i.p.] and Dianxianqing granule group （12.48 g/kg by crude drug， i.g.） by body weight， with 25 mice in each group. Second day after modeling， administration groups were given relevant medicine， once a day， for consecutive 21 d. Sham operation group and model group were given intragastric administration of water and intraperitoneal injection of normal saline. At last administration，the learning and memory ability was determined by Y maze test，and blood-brain barrier permeability was measured by Evans blue leakage assay. The expressions of NLRP3， anti-ionized calcium-binding adapter molecule 1 （IBA-1）， nuclear factor kappa B （NF-κB） p65， p53 upregulated modulator of apoptosis （PUMA）， occludin （ocln）， zonula occluden-1 （ZO-1） and claudin-5 （cldn5） in cerebral tissue were determined. RESULTS Compared with model group， spontaneous alternate response rate， protein expressions of ocln， cldn5 and ZO-1 in cerebral tissue were increased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）; Evans blue content and protein expressions of NLRP3， IBA-1， PUMA and NF-κB p65 in cerebral tissue were decreased significantly（P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS Dianxianqing granule can improve BBB injury of AD model mice by inhibiting NLRP3 inflammasome signaling pathway.

KEYWORDS ? Dianxianqing granule; Alzheimer’s disese; blood-brain barrier; NLRP3 inflammasome; tight junction proteins

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種常見(jiàn)的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病[1]，主要病理特征為淀粉樣蛋白沉積、Tau蛋白磷酸化以及神經(jīng)元死亡等[2]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，血腦屏障（blood brain barrier，BBB）功能障礙可能是導(dǎo)致AD發(fā)生的病理機(jī)制之一[3]。BBB由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和血管周?chē)男∧z質(zhì)細(xì)胞足突組成，對(duì)于維持腦穩(wěn)態(tài)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境有重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者BBB通透性增加，而炎癥反應(yīng)是促進(jìn)BBB損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一[5]。

炎癥小體是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要存在于小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中，其中核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）是較為常見(jiàn)的炎癥小體，已被認(rèn)為是潛在的AD炎癥標(biāo)志物之一[6]。當(dāng)腦中小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，NLRP3炎癥小體的表達(dá)會(huì)增加，繼而誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致BBB通透性增強(qiáng)[7-8]。核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，在保持BBB完整性中發(fā)揮著重要作用[9]。p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）是一種凋亡調(diào)控因子，其可通過(guò)增加下游NF-κB、NLRP3蛋白的表達(dá)，參與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過(guò)程，誘導(dǎo)BBB損傷[10]。因此，阻斷或抑制NLRP3表達(dá)已成為保持BBB完整性的關(guān)鍵[11]。

癲癇清顆粒為專(zhuān)利藥（專(zhuān)利號(hào)ZL201110069494），由熟地黃、制何首烏、芍藥（白芍）、石菖蒲、柴胡、郁金、知母等10味中藥組成，主要含芒果苷、芍藥苷和α-細(xì)辛醚等成分[12-14]，具有填精益智、開(kāi)竅豁痰、活血祛瘀的功效，臨床主要用于神情淡漠、寡言少語(yǔ)、反應(yīng)遲鈍、善忘、終日不語(yǔ)、言辭顛倒、忽笑忽哭、不欲食及舉動(dòng)異常等的治療。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)癲癇清顆粒干預(yù)后，AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織病理改變均有明顯改善，其具體機(jī)制與維持BBB完整性有關(guān)[15]。因阻斷或抑制NLRP3炎癥小體對(duì)維持BBB完整性有重要作用，故本課題組推測(cè)癲癇清顆粒改善BBB功能障礙的作用可能與抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路活化密切相關(guān)。鑒于此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用癲癇清顆粒干預(yù)AD模型小鼠，觀(guān)察其對(duì)BBB損傷的改善作用與抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路活化的關(guān)聯(lián)性，旨在進(jìn)一步探討癲癇清顆粒改善AD的潛在作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有DW-200型腦立體定位儀（成都泰盟科技有限公司），Neofuge 13R型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），ImageQuant 350型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)GE Healthcare公司），DMI3000 B型光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有癲癇清顆粒（由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供，批號(hào)20180310，每1 g顆粒相當(dāng)于生藥5.31 g），鹽酸多奈哌齊片[衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，批號(hào)140606 A，規(guī)格5 mg/片]，選擇性NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950（美國(guó)Selleck公司，批號(hào)S780907，純度99.4%），β-淀粉樣蛋白25～35（β-amyloid 25～35，Aβ25～35，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)038M4822V），兔抗咬合蛋白（occludin，ocln）多克隆抗體、兔抗閉鎖小帶蛋白1（zonula occluden-1，ZO-1）多克隆抗體、兔抗緊密連接蛋白5（claudin-5，cldn5）多克隆抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，批號(hào)分別為WL01996、WL03419、WL03731），兔抗NF-κB p65多克隆抗體、兔抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為bs-0465R、bs-10966R），兔抗PUMA多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab9643），兔抗NLRP3多克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)1977-1-1-AP），二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120219200821），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)141987），小鼠離子鈣接頭蛋白1（anti-ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBA-1）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)Ac02061708）;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)ICR雄性小鼠，共125只，體質(zhì)量為20～24 g，來(lái)源于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)為SCXY（遼）2020-0001。小鼠在沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在20～23 ℃、空氣相對(duì)濕度控制在50%～60%。本實(shí)驗(yàn)得到了沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)SYYXY2020082702），實(shí)驗(yàn)操作符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。小鼠于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 AD小鼠模型制備

小鼠用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，將其頭部固定在腦立體定位儀上，沿正中線(xiàn)切開(kāi)頭部皮膚約2 cm，尋找囟門(mén)位置。以囟門(mén)為原點(diǎn)，移動(dòng)微量進(jìn)樣器（將微量進(jìn)樣器向右移動(dòng)1 mm，再向后移動(dòng)0.5 mm），然后垂直進(jìn)入腦組織（深約3 mm），緩慢注射老化的Aβ25～35（用無(wú)菌生理鹽水稀釋Aβ25～35至1 mg/mL，37 ℃孵育7 d老化）3 μL，彌散5 min，縫合消毒[16]。假手術(shù)組小鼠同法注射等體積無(wú)菌生理鹽水。術(shù)后第2天，采用Y迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行自發(fā)交替反應(yīng)率的測(cè)定。若與假手術(shù)組相比，造模組小鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率明顯降低，則視為造模成功[17]。

2.2 分組與給藥

將125只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=25）和造模組（n=100）。造模組小鼠按“2.1”項(xiàng)下操作復(fù)制AD模型;假手術(shù)組小鼠在相同部位注射等體積無(wú)菌生理鹽水，其余步驟與造模組相同。造模組小鼠在手術(shù)過(guò)程中無(wú)死亡，且均造模成功。將造模成功的100只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、鹽酸多奈哌齊片組（陽(yáng)性對(duì)照1，1.3 mg/kg，灌胃給藥）、MCC950組（陽(yáng)性對(duì)照2，10 mg/kg，腹腔注射給藥）和癲癇清顆粒組（以生藥總量計(jì)12.48 g/kg，灌胃給藥），每組25只。造模后第2天，各給藥組小鼠給予相應(yīng)藥物（灌胃給藥體積均為20 mL/kg，腹腔注射體積為10 mL/kg），每日給藥1次，連續(xù)給藥21 d。為避免給藥途徑對(duì)小鼠精神狀態(tài)的影響，假手術(shù)組、模型組小鼠灌胃水20 mL/kg，并腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊片組的給藥劑量參考文獻(xiàn)[18]設(shè)置;MCC950組的給藥劑量參考文獻(xiàn)[19]設(shè)置。

2.3 Y迷宮實(shí)驗(yàn)

各組小鼠在第21天灌胃/腹腔注射結(jié)束后進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)裝置為自制器材，由3個(gè)木質(zhì)支臂組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)，把小鼠放在支臂的交叉點(diǎn)處，記錄8 min內(nèi)小鼠進(jìn)入支臂的總次數(shù)（N）。連續(xù)進(jìn)入3個(gè)不同支臂記錄為1次正確交替反應(yīng)，計(jì)算自發(fā)交替反應(yīng)率：自發(fā)交替反應(yīng)率=正確交替反應(yīng)次數(shù)/（N-2）×100%。

2.4 伊文思藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)

在Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)選取7只小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)溶液（4 mL/kg）;3 h后，以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，將輸液器針頭插入左心室，用生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，直至流出液體澄清、透明為止。斷頭取腦，用濾紙拭去腦組織表面液體，稱(chēng)質(zhì)量，然后放置于3 mL甲酰胺內(nèi)，剪碎，45 ℃避光水浴72 h，離心（4 ℃，3 500 r/min）20 min，取上清液。根據(jù)文獻(xiàn)[15]方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算每克小鼠腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)的含量（μg/g）。

2.5 腦組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平測(cè)定

采用免疫組化法進(jìn)行測(cè)定。在Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6只小鼠，采用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，以生理鹽水進(jìn)行心臟灌流。將小鼠處死，取出其腦組織，以4%多聚甲醛固定24 h。將組織常規(guī)脫蠟、脫水后，制備5 μm厚的石蠟切片，脫蠟至水;以3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液（pH6.0）中，以高壓方式加熱至沸騰，然后冷卻至室溫;以5%胎牛血清封閉，37 ℃孵育30 min;加入NLRP3一抗（稀釋比例1 ∶ 100），4 ℃孵育過(guò)夜;滴加二抗（稀釋比例1 ∶ 3 000），37 ℃孵育30 min;二氨基聯(lián)苯胺顯色后以蘇木素復(fù)染;脫水，透明，封片，然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察（細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒為NLRP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)）。采用JEOA 801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組小鼠腦組織中陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值，平均光密度值越大表示NLRP3蛋白表達(dá)水平越高。

2.6 腦組織中IBA-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定

采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定。在Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將每組剩余的12只小鼠用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，處死后分離其腦組織，置于-80 ℃下冷凍保存。每組隨機(jī)選取7只小鼠的腦組織，按照1 ∶ 10（mg/mL）的比例加入磷酸鹽緩沖液，勻漿，以3 500 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定腦組織中IBA-1蛋白表達(dá)水平。

2.7 腦組織中PUMA、NF-κB p65、ocln、cldn5、ZO-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定

采用Western blot法進(jìn)行測(cè)定。每組選取“2.6”項(xiàng)下冷凍保存的5只小鼠腦組織，以RIPA裂解液提取組織中總蛋白，以BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取60 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓180 V，電泳時(shí)間40 min），電轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)膜電流100 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2 h）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上;以含5%TBST緩沖液的脫脂奶粉室溫封閉 2 h，加入NF-κB p65一抗（稀釋比例1 ∶ 500）、ocln一抗（稀釋比例1 ∶ 300）、cldn5一抗（稀釋比例1 ∶ 300）、ZO-1一抗（稀釋比例1 ∶ 200）和β-actin一抗（稀釋比例1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過(guò)夜;TBST洗膜，加入二抗（稀釋比例均為1 ∶ 5 000），室溫孵育2 h;加入發(fā)光液進(jìn)行曝光，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。以Image J V1.8.0.112 圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參 β-actin條帶的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組小鼠進(jìn)入支臂的總次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明鹽酸多奈哌齊片、MCC950及癲癇清顆粒不影響小鼠的自發(fā)活動(dòng)。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠自發(fā)交替反應(yīng)率顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，鹽酸多奈哌齊片組、MCC950組和癲癇清顆粒組小鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率均顯著升高（P<0.05）。各組小鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 伊文思藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織內(nèi)的伊文思藍(lán)含量顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，鹽酸多奈哌齊片組、MCC950組和癲癇清顆粒組小鼠腦組織內(nèi)的伊文思藍(lán)含量均顯著減少（P<0.01）。各組小鼠腦組織內(nèi)的伊文思藍(lán)含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 小鼠腦組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，鹽酸多奈哌齊片組、MCC950組和癲癇清顆粒組小鼠腦組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠腦組織中NLRP3蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

3.4 小鼠腦組織中IBA-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中IBA-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，鹽酸多奈哌齊片組、MCC950組和癲癇清顆粒組小鼠腦組織中IBA-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠腦組織中IBA-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.5 小鼠腦組織中PUMA、NF-κB p65、ocln、cldn5、ZO-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中PUMA、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），ocln、cldn5、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，鹽酸多奈哌齊片組、MCC950組和癲癇清顆粒組小鼠腦組織中PUMA、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），ocln、cldn5、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠腦組織中PUMA、NF-κB p65、ocln、cldn5、ZO-1蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

4 討論

NLRP3炎癥小體是目前AD藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)[20]。NLRP3炎癥小體與AD患者的BBB通透性密切相關(guān)——抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)，可降低BBB通透性[21]。MCC950是目前最為有效的選擇性NLRP3炎癥小體小分子抑制劑，其通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的形成和激活，改善AD患者的BBB功能[22-23]。鹽酸多奈哌齊片作為膽堿酯酶抑制劑，多用于AD的治療，可改善AD患者的行為學(xué)變化[15]。因此，本研究選擇MCC950和鹽酸多奈哌齊片同時(shí)作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種類(lèi)型，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)AD患者的炎癥進(jìn)程。NLRP3廣泛表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞中，在啟動(dòng)炎癥反應(yīng)中扮演重要角色[24]。緊密連接蛋白是構(gòu)成BBB基本結(jié)構(gòu)并維持其功能的主要部分，在保持BBB通透性方面起到了較為重要的作用[25]。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后，NLRP3的表達(dá)量增加，緊密連接蛋白（ocln、cldn5和ZO-1）表達(dá)降低[26]，BBB通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙[27]。IBA-1參與小膠質(zhì)細(xì)胞骨架形成，是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)量的多少與小膠質(zhì)細(xì)胞活性密切相關(guān)[28]。在伊文思藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)測(cè)定小鼠腦組織內(nèi)的伊文思藍(lán)含量來(lái)評(píng)估BBB的完整性[29]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織內(nèi)的伊文思藍(lán)含量明顯增加，小鼠自發(fā)交替反應(yīng)率明顯降低;且腦組織中的IBA-1、NLRP3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，ocln、cldn5、ZO-1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。以上結(jié)果提示，AD模型小鼠腦組織中NLRP3表達(dá)上調(diào)可促使BBB通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶功能受損。癲癇清顆粒干預(yù)后可以顯著提高AD模型小鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率，減少其腦組織內(nèi)的伊文思藍(lán)含量，并可顯著下調(diào)腦組織中IBA-1、NLRP3蛋白表達(dá)，上調(diào)其腦組織中ocln、cldn5、ZO-1蛋白表達(dá)。

以往研究表明，PUMA作為一種凋亡調(diào)控因子，具有強(qiáng)大的促凋亡作用[30]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PUMA與BBB完整性密切相關(guān)[31]，敲除PUMA基因能夠顯著抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)BBB完整性的作用[32];而沉默NF-κB基因可抑制PUMA過(guò)表達(dá)引起的緊密連接蛋白（ocln、cldn5、ZO-1）表達(dá)量的降低，說(shuō)明PUMA是NF-κB的上游調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)BBB通透性[33]。NF-κB作為一條經(jīng)典的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)外源性刺激存在時(shí)，可促使NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，使NLRP3表達(dá)增加，而抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)錄可以減少AD模型小鼠腦組織中NLRP3的表達(dá)，降低BBB通透性，從而改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙[32]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中PUMA、NF-κB p65蛋白表達(dá)均明顯上調(diào);癲癇清顆粒干預(yù)后可以顯著下調(diào)AD模型小鼠腦組織中PUMA、NF-κB p65蛋白表達(dá)。

綜上所述，癲癇清顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，有效改善AD模型小鼠的BBB損傷，有望為臨床治療AD提供新的思路和靶點(diǎn)。本課題組后續(xù)將進(jìn)一步探討癲癇清顆粒是否能通過(guò)抑制Aβ沉積和Tau蛋白磷酸化來(lái)降低NLRP3炎性小體的激活，從而發(fā)揮其維持BBB完整性的作用。

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（收稿日期：2022-01-29 修回日期：2022-04-05）

（編輯：林 靜）