鄔國(guó)棟，任燕霞，張 東

(1.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.) 為胡頹子科酸刺屬的落葉灌木或小喬木，又名沙棗、酸柳果、酸柳、其察日嘎察(蒙名)、達(dá)普(藏名)、吉漢(維吾爾名)，主要分布在我國(guó)的華北、西北、東北及西南地區(qū)[1-2]。沙棘具有相當(dāng)高的藥用價(jià)值，是古代藏藥和蒙藥常用藥材?！吨袊?guó)藥典》(2020版1部)記載，沙棘具有健脾消食，止咳祛痰，活血化瘀的作用[3]。藥理學(xué)研究表明，沙棘具有保護(hù)肝臟、抗高血壓、抗癌、抗?jié)?、促進(jìn)傷口愈合、抗菌、抗氧化、保護(hù)心臟和免疫調(diào)節(jié)等作用[4-7]。 沙棘中的主要活性成分是黃酮類，其主要成分有異鼠李素、山奈酚和槲皮素等[8]。

肝臟是代謝藥物的主要器官，而肝臟代謝藥物的主要酶是細(xì)胞色素P450酶系(CYP450)，它有很多同工酶，如CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6等。近年來(lái)，CYP450在植物藥代謝方面逐漸受到人們的關(guān)注。CYP450同工酶的活性容易受到外來(lái)物質(zhì)的誘導(dǎo)或抑制，進(jìn)而會(huì)影響其他藥物的代謝而發(fā)生藥物之間的相互作用[9]。這種相互作用的結(jié)果之一就是導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生甚至毒性反應(yīng)的產(chǎn)生。所以研究植物藥對(duì)CYP450酶活性的影響很有必要。人體內(nèi)CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6和大鼠體內(nèi)的CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2和CYP2b1分別具有高度同源性[10]。本課題采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究沙棘黃酮對(duì)大鼠肝臟CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2和CYP2b1酶 mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)而判斷沙棘黃酮對(duì)人體CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6酶的活性是否具有抑制或誘導(dǎo)作用，為沙棘以及沙棘黃酮的臨床合理聯(lián)合應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器、藥品和試劑 Nano Drop 2000分光光度計(jì)、5020PCR儀、Pacific T-Ⅱ型超純水儀、Micro 2/R 高速低溫離心機(jī)(美國(guó) ThermoFisher Scientific 公司)；BT125D 十萬(wàn)分之一電子天平( 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

沙棘總黃酮(大連美侖生物技術(shù)有限公司研制，批號(hào)：20181104)?？俁NA極速抽提試劑盒kit-RNAfast200(上海飛捷生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：220011)；第一鏈cDNA Synthesis Kit試劑盒以及2X Realtime PCR Master Mix(第二代)試劑盒(南京博爾迪生物科技有限公司，批號(hào)：20191103)；DEPC(Sigma公司，批號(hào)：p0031)；引物(南京金瑞斯生物科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性大鼠(體質(zhì)量200～220 g)，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于明暗交替(12 h∶12 h)的清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室中，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度50 %，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.3給藥方案 40只雄性大鼠按照隨機(jī)化原則分為空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，沙棘黃酮高劑量組、中劑量組和低劑量組。各給藥組分別灌胃400、200和100 mg/kg的沙棘黃酮提取物，空白對(duì)照組灌胃等容量蒸餾水，連續(xù)14 d；陽(yáng)性對(duì)照組從第8天開(kāi)始腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg/kg，連續(xù)7 d。末次給藥后禁食不禁水12 h，脫臼處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)大鼠血清生化指標(biāo)，取肝臟置于無(wú)RNA酶的凍存管中，液氮速凍后于-70 ℃冰箱凍存。

1.4肝功能指標(biāo)的測(cè)定 大鼠腹主動(dòng)脈取血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、總蛋白(Total protein, TP)、球蛋白(Globulin, GLB)、白蛋白(Albumin, ALB)和直接膽紅素(Direct bilirubin, DBIL)各項(xiàng)指標(biāo)。取肝臟稱重，計(jì)算肝重/體重比(Liver weight/body weight,L/W)。

1.5肝臟 CYP450 mRNA 表達(dá)水平的測(cè)定 總RNA提取 取冷凍肝組織約50 mg加生理鹽水勻漿，然后按照kit-RNAfast200極速抽提試劑盒說(shuō)明提取總RNA。各總RNA樣本 A260/A280比值為 1.8～2.0。

cDNA 合成 取適量總RNA(使其終濃度為500 ng·μL-1)，分別加入 1μL random hexamer primer、4μL 5×RT Buffer、1μL RT Enzyme Mix、1μL dNTPs和RNase free dd H2O至終體積 20 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃(10 min)，50 ℃(45 min)，85 ℃(5 min)。得到的cDNA產(chǎn)物用于 PCR 反應(yīng)或于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RT-PCR 測(cè)定mRNA表達(dá)水平 取1 μL cDNA產(chǎn)物，分別加入12.5 μL 2X Realtime PCR Master Mix、10uM的上下游引物各0.5 μL，加Nuclease-Free Water to至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，45個(gè)循環(huán)。測(cè)定樣本CT值后，采用 2-ΔΔCT法計(jì)算各組CYP450 酶基因表達(dá)相對(duì)于空白對(duì)照組的倍數(shù)變化。大鼠 CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2、CYP2b1和β-actin(內(nèi)參)引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

2 結(jié)果

2.1沙棘黃酮對(duì)大鼠肝功能的影響 與空白對(duì)照組相比，沙棘黃酮各給藥組對(duì)ALT、AST、TP、GLB、ALB和L/W沒(méi)有影響(P>0.05)，但是中劑量組和低劑量組可以顯著降低DBIL(P<0.05)。提示沙棘黃酮對(duì)大鼠肝功能沒(méi)有影響，不會(huì)造成肝損傷，DBIL的降低沒(méi)有太大意義。見(jiàn)表2。

表2 大鼠肝功能各項(xiàng)指標(biāo)

2.2沙棘黃酮對(duì)CYP450各同工酶mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，高劑量組CYP2d2 mRNA表達(dá)上調(diào)了3.2倍(P<0.01)，而CYP2c11、CYP2e1和CYP2b1 mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著性變化(P>0.05)(圖1)。

圖1 沙棘黃酮對(duì)大鼠肝臟CYP450酶mRNA表達(dá)的影響

3 討論

3.1沙棘黃酮對(duì)大鼠肝臟CYP2b1、CYP2c11和CYP2e1 mRNA表達(dá)的影響 CYP2B6、CYP2C9和CYP2E1是人體肝臟中非常重要的代謝藥物的CYP450酶系同工酶。CYP2B6占人體肝臟中CYP450含量的2 %～10 %，并且可能參與了市場(chǎng)上近25 %的藥物的代謝，例如麻醉藥，抗癌藥，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒依非韋倫和某些促癌物等[11-13]。CYP2C9可能參與了16%的臨床藥物的代謝，如非甾體抗炎藥，AT1受體阻滯劑，抗驚厥藥等[14-16]。CYP2E1在酒精、有機(jī)溶劑、毒素、致癌物和致癌物代謝中起重要作用[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘黃酮對(duì)大鼠肝臟CYP2b1、CYP2c11和CYP2e1 mRNA表達(dá)沒(méi)有影響，說(shuō)明沙棘黃酮對(duì)CYP2B6、CYP2C9和CYP2E1的活性沒(méi)有影響。即沙棘黃酮可以安全地與通過(guò)CYP2E1、CYP2B6和CYP2C9代謝的藥物聯(lián)合使用，它們之間不會(huì)發(fā)生草藥-藥物之間的相互作用。

3.2沙棘黃酮對(duì)大鼠肝臟CYP2d2 mRNA表達(dá)的影響 CYP2D6也是肝臟中非常重要的CYP450同工酶之一。CYP2D6可以代謝約20 %的目前已知的臨床治療藥物[19]，如β受體阻滯劑(丁呋洛爾、卡維地洛、甲氧普羅爾)、抗抑郁藥(阿米替林、帕羅西汀、地昔帕明、氟伏沙明、文拉法辛)抗心律不齊藥物(普羅帕酮、美西律、氟利卡胺)、抗精神病藥(阿立哌唑、利培酮)、抗癌藥(他莫昔芬、吉非替尼、司巴汀)和阿片類鎮(zhèn)痛藥(可待因、曲馬多、曲馬多)等[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TFH可以上調(diào)CYP2d2 mRNA的表達(dá)，也就是說(shuō)，TFH可以誘導(dǎo)CYP2D6的活性，提示沙棘黃酮與CYP2D6的底物之間存在代謝層面的相互作用。當(dāng)沙棘黃酮與經(jīng)CYP2D6代謝的藥物一起使用時(shí)，這些藥物的代謝可能會(huì)加快，導(dǎo)致藥理效應(yīng)下降，所以在聯(lián)合用藥時(shí)需要調(diào)整這些藥物的給藥方案。如果這些藥物的代謝產(chǎn)物是有毒的，則聯(lián)合使用也會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

3.3沙棘黃酮對(duì)大鼠肝功能的影響 從表2結(jié)果可知，沙棘黃酮對(duì)大鼠肝臟的ALT、AST、TP、ALB、GLB和L/W沒(méi)有影響，但可以降低DBIL的水平，說(shuō)明沙棘黃酮對(duì)大鼠肝功能沒(méi)有影響，不會(huì)引起肝損傷。至于 DBIL降低沒(méi)有意義。

綜上所述，沙棘黃酮可以上調(diào)大鼠CYP2d2 mRNA的表達(dá)，而對(duì)CYP2b1、CYP2e1和CYP2c11 mRNA的表達(dá)沒(méi)有影響，這提示沙棘黃酮可能會(huì)誘導(dǎo)人CYP2D6酶的活性。當(dāng)沙棘或沙棘黃酮與經(jīng)CYP2D6代謝的藥物合用時(shí)，可能發(fā)生草藥-藥物相互作用。因此，在臨床實(shí)踐中應(yīng)給予足夠的重視。