楊茂林 鄧程葉 丁玲玲

(1三亞市人民醫(yī)院疼痛科，海南 三亞 572000；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院麻醉科)

骨關(guān)節(jié)炎是老年人疼痛和殘疾的最常見原因，其特征在于骨重建、滑膜和軟骨損失〔1〕。雖然骨關(guān)節(jié)炎被歸類為非炎癥性關(guān)節(jié)病，但已證明炎癥在疾病進(jìn)展中起重要作用。這些炎癥過程發(fā)生在滑膜，其特征是淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的侵襲和升高的促炎細(xì)胞因子〔2〕。早些時候，骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛僅通過使用主觀問卷而不是通過測量體感神經(jīng)系統(tǒng)來評估〔3〕。感覺功能定量感覺測試(QST)是一種科學(xué)的測量溫度和壓力及疼痛閾值的方法〔4〕。QST可以檢測由慢性疼痛引起的感覺變化。在疾病進(jìn)展期間，活化的炎性細(xì)胞持續(xù)分泌大量炎癥介質(zhì)〔5～7〕。所有這些慢性過程在滑膜和關(guān)節(jié)損傷中起主要作用。帕瑞昔布鈉是口服制劑伐地考昔的水溶性前藥，對環(huán)氧合酶(COX)-2的效力比COX-1高約28 000倍〔8〕。它是第一種可注射的COX-2抑制劑。COX-2抑制劑是已知的骨關(guān)節(jié)炎治療劑〔9〕。本研究旨在探究帕瑞昔布鈉對接受手術(shù)應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)性升高和疼痛閾值的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 購買8～10周齡的30只BALB/c雄性小鼠在21～24℃和55%～65%濕度的環(huán)境中飼養(yǎng)，具有12 h的明暗循環(huán)。小鼠自由進(jìn)食和飲水。

1.2實驗分組 小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(n=10)，關(guān)節(jié)炎模型組(n=10)，帕瑞昔布鈉治療組(n=10)。關(guān)節(jié)炎模型組和帕瑞苷布鈉治療組建立關(guān)節(jié)炎模型(麻醉小鼠橫切內(nèi)側(cè)副韌帶并使用手術(shù)顯微鏡移除內(nèi)側(cè)半月板)，建模后關(guān)節(jié)炎模型組小鼠每天1次腹膜內(nèi)注射0.9%氯化鈉(南京化學(xué)試劑，中國)，連續(xù)5 d。帕瑞昔布鈉治療組連續(xù)5 d注射20 mg/kg帕瑞昔布鈉。假手術(shù)組對側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行假手術(shù)，沒有韌帶切斷或半月板切除術(shù)，并且在研究期間僅用0.9%氯化鈉注射治療，每日1次。

1.3醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問題 本研究根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院動物護(hù)理和使用指南第8版〔6〕進(jìn)行，機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)的方案進(jìn)行動物實驗。

1.4研究方法

1.4.1組織學(xué)分析 術(shù)后24 h處死小鼠，解剖整個膝關(guān)節(jié)并在4%多聚甲醛中用磷酸鹽緩沖液固定4 h。用10%乙二胺四乙酸(EDTA)將樣品脫鈣2 w。乙醇脫水、石蠟包埋制成4 μm切片，切片用番紅O-固綠染色。通過軟骨退化評分和國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(OARSI)評分系統(tǒng)，評估骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性。

1.4.2自然殺傷(NK)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性測定 根據(jù)制造商的說明，使用T細(xì)胞分離試劑盒和NK細(xì)胞分離試劑盒分離血漿T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞。通過四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)分別檢測NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性。所有MTT測定一式3份進(jìn)行。

1.4.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 小鼠眼眶取血收集血液樣品，離心(3 000 r/min，30 min，4℃)分離血漿，并儲存在-80℃?zhèn)溆?。根?jù)制造商的說明制備和測量標(biāo)準(zhǔn)品和小鼠血清中干擾素(IFN)-γ、白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-6，腫瘤壞死因子(TNF)-α含量。在450 nm下測量光學(xué)試劑密度(OD)值。

1.4.4疼痛閾值測量 使用QST參數(shù)測量疼痛閾值：冷檢測閾值(CDT)、熱檢測閾值(WDT)、冷痛閾值(CPT)和熱痛閾值(HPT)。為排除混淆因素，實驗均由同一研究員完成。在測試過程中，QST室溫保持在20～23℃。在測試之前，使小鼠在安靜的QST室中處于放松狀態(tài)，首先將接觸式熱電極(3×3 cm)連接并用帶子固定到小鼠爪子上，然后固定到膝關(guān)節(jié)的遠(yuǎn)端髕骨極的下部皮膚表面。從熱電極的基線溫度32℃開始，溫度以每秒1℃的速率連續(xù)增加或減少。作為安全預(yù)防措施，截止溫度設(shè)定為最高50℃且最低為0℃。然后進(jìn)行所有溫度測試3次。3次測量的平均值用作結(jié)果參數(shù)。通過確定CDT和WDT開始測試。當(dāng)小鼠首次感知到溫度變化時，停止刺激。按下停止按鈕時記錄熱電極的溫度。繼續(xù)測試按順序確定CPT和HPT。隨著熱電極溫度下降/增加，小鼠一感覺到不適就立即按下停止按鈕。

1.4.5壓力疼痛閾值(PPT) 通過用壓力測量儀測定PPT。校準(zhǔn)輸送100～1 000 kPa，相當(dāng)于0.1 kg施加重量，以每秒0.5 kg/cm2的速率增加，接觸面為1 cm2。在與熱閾值相同的位置進(jìn)行3次壓力測量，取平均值。

1.4.6mRNA表達(dá)分析 通過RT-qPCR評估B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)mRNA表達(dá)。使用Trizol試劑提取總RNA，并使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄cDNA用于PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。使用2-ΔΔCt方法計算數(shù)據(jù)，對每個單獨的樣品進(jìn)行3次重復(fù)實驗。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.7肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測 采用Western 印跡檢測CK、LDH、SOD、MDA蛋白表達(dá)。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1小鼠關(guān)節(jié)軟骨評分 與假手術(shù)組相比，關(guān)節(jié)炎模型組軟骨退化評分和OARSI評分均顯著升高(P<0.05)。帕瑞昔布鈉治療組較關(guān)節(jié)炎模型組軟骨退化評分和OARSI評分顯著降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組脛骨軟骨內(nèi)側(cè)部分的組織學(xué)檢測(番紅O-固綠染色，×100)

2.2NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 與假手術(shù)組相比，關(guān)節(jié)炎模型組血漿NK細(xì)胞百分比顯著降低，CD4+/CD8+比率顯著上調(diào)(P<0.05)，帕瑞昔布鈉治療組較關(guān)節(jié)炎模型組血漿NK細(xì)胞百分比顯著升高，CD4+/CD8+比率顯著下調(diào)(P<0.05)。見表2。

2.3ELISA檢測特異性炎性細(xì)胞因子 與假手術(shù)組相比，關(guān)節(jié)炎模型組IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α蛋白含量均顯著增加(P<0.05)，帕瑞昔布鈉治療組較關(guān)節(jié)炎模型組IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α蛋白含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠關(guān)節(jié)軟骨評分、NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性、炎癥因子水平比較

2.4疼痛閾值及壓力疼痛閾值比較 與假手術(shù)組相比，關(guān)節(jié)炎模型組CDT和CPT顯著增加，WDT、PPT和HPT顯著降低(P<0.05)，說明關(guān)節(jié)炎小鼠敏感性增加。帕瑞昔布鈉治療組較關(guān)節(jié)炎模型組CDT和CPT顯著降低，WDT、PPT和HPT顯著增加(P<0.05)，說明帕瑞昔布鈉治療小鼠敏感性降低。見表3。

表3 3組疼痛閾值檢測

2.5Western印跡檢測CK、LDH、SOD、MAD蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，關(guān)節(jié)炎模型組CK、LDH和MDA蛋白含量均顯著增加，SOD蛋白含量顯著降低(P<0.05)，而帕瑞昔布鈉治療組較關(guān)節(jié)炎模型組CK、LDH和MDA蛋白含量均顯著降低，SOD蛋白含量顯著增加(P<0.05)。見表4。

2.6Bcl-2和Bax mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組相比，關(guān)節(jié)炎模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著升高，Bax mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，帕瑞昔布鈉治療組較關(guān)節(jié)炎模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著降低，Bax mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 3組CK、LDH、SOD、MAD蛋白水平及Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)

3 討 論

帕瑞昔布鈉是一種高選擇性COX-2抑制劑，用于圍術(shù)期鎮(zhèn)痛/抗炎治療。帕瑞昔布鈉是伐地考昔的前藥，已被開發(fā)為唯一可用于腸外制劑的COX-2選擇性抑制劑〔10〕。在靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射后，它在肝臟中迅速代謝成活性形式伐地考昔，峰值血漿伐地考昔濃度發(fā)生在30 min至3.5 h，消除半衰期約為8 h〔11〕。本研究的結(jié)果表明，在關(guān)節(jié)炎模型中帕瑞昔布鈉治療降低疼痛閾值并降低臨床關(guān)節(jié)炎評分、抑制炎性因子(包括IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α)的表達(dá)，降低氧化應(yīng)激因子CK、LDH和MDA蛋白含量，增加SOD活性。

本研究最重要的發(fā)現(xiàn)是骨關(guān)節(jié)炎小鼠PPT顯著低于假手術(shù)組。疼痛水平越高，PPT越低，通過了解不同類型的疼痛閾值與骨關(guān)節(jié)炎患者的臨床評分相關(guān)，可以調(diào)整和區(qū)分疼痛治療。在術(shù)后即刻階段采用精心設(shè)計的急性疼痛治療方案可能會限制神經(jīng)向慢性疼痛發(fā)展。經(jīng)常使用涉及非甾體抗炎藥(NSAID)、COX-2抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)拮抗劑、冷凍療法和使用添加劑的局部麻醉的經(jīng)典藥物治療可減少術(shù)后阿片類藥物的用量〔12～14〕。在本研究中，骨關(guān)節(jié)炎小鼠顯示出比假手術(shù)組更低的PPT、WDT和HPT，更高的CDT和CPT，表現(xiàn)出致敏跡象。而帕瑞昔布鈉治療能夠恢復(fù)關(guān)節(jié)炎小鼠疼痛閾值的升高或降低。骨關(guān)節(jié)炎小鼠中，軟骨退化評分和OARSI評分顯示與QST參數(shù)高度相關(guān)。這些結(jié)果可能有助于優(yōu)化那些評分最差的骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛治療。

IL-6與IL-10一起被證明可促進(jìn)Treg遷移至某些腫瘤，因此可能在Treg信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用〔15〕。研究表明，CD4+CD127-Treg的百分比與血漿IL-6呈正相關(guān)〔16〕。來自小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞顯示促進(jìn)未定型的幼稚T細(xì)胞向叉頭框蛋白(Fox)P3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，該研究〔16〕表明，IL-6可能是調(diào)節(jié)T細(xì)胞平衡的關(guān)鍵介質(zhì)。

關(guān)節(jié)滑膜中的炎性細(xì)胞浸潤是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的突出特征之一。這些活化的炎癥細(xì)胞不斷分泌IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α等促炎因子。這些過度表達(dá)的炎癥介質(zhì)可能導(dǎo)致炎癥加重，導(dǎo)致軟骨和骨骼的破壞。在炎癥反應(yīng)中，IL-10是由活化的巨噬細(xì)胞表達(dá)的重要細(xì)胞因子，在許多細(xì)胞活動如細(xì)胞增殖、分化甚至細(xì)胞凋亡中起重要作用〔17〕。IL-6被認(rèn)為是一種內(nèi)源性熱原，特別是在發(fā)熱和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的初始免疫反應(yīng)中普遍存在〔18〕。TNF-α已經(jīng)被鑒定為失調(diào)的免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，并且發(fā)現(xiàn)它的產(chǎn)生對于LPS處理的巨噬細(xì)胞中一氧化氮(NO)合成的協(xié)同誘導(dǎo)是至關(guān)重要的〔19〕。在滑液和血清中產(chǎn)生過量的炎癥標(biāo)記后，可以同時檢測到炎癥信號的擴(kuò)增及水腫、疼痛和關(guān)節(jié)活動受損的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，帕瑞昔布鈉治療通過抑制大多數(shù)炎癥介質(zhì)改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，并增加了氧化應(yīng)激，阻斷了COX-2在疾病進(jìn)展中表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化。因此，帕瑞昔布鈉治療可以對促炎因子及其在慢性炎性疾病中的級聯(lián)反應(yīng)具有廣泛而深刻的抑制作用。

IFN-γ是膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎起始和進(jìn)展中的關(guān)鍵介質(zhì)之一，它通過加速Bcl-2表達(dá)來加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞和膠原合成的減少〔20〕。同時，IL-6炎癥信號參與Bcl-2依賴性細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)節(jié)。Bcl-2主要由間充質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生，過度表達(dá)與關(guān)節(jié)的病理生理變化密切相關(guān)。

綜上，帕瑞昔布鈉減輕骨關(guān)節(jié)炎模型應(yīng)激誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)性升高和疼痛閾值。帕瑞昔布鈉可以限制關(guān)節(jié)破壞并逆轉(zhuǎn)病理生理改變，包括促炎性細(xì)胞因子減少，Bcl-2抑制，炎癥標(biāo)志物減弱，炎癥細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激降低。帕瑞昔布鈉可能是骨關(guān)節(jié)炎治療的新型補(bǔ)充劑。