趙 璐，張慧玲，劉佳雯，達(dá) 哇，張永棟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 公共衛(wèi)生和醫(yī)院感染管理部； 2. 血液透析中心，青海 西寧 810001)

透析用水易受微生物污染，常見為革蘭陰性桿菌。革蘭陰性桿菌死亡后會產(chǎn)生、釋放內(nèi)毒素，機(jī)體反復(fù)暴露于內(nèi)毒素會誘發(fā)炎癥反應(yīng)，其特征是脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致血透患者機(jī)體長期受到慢性炎癥等影響[1-2]。近年來很多研究通過改進(jìn)透析器膜，解決患者感染風(fēng)險，如國外開發(fā)由聚醚砜、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭組成的混合基質(zhì)膜(MMM)，體外試驗(yàn)結(jié)果表明對細(xì)菌過濾效果優(yōu)良[3]。而透析用水的質(zhì)量才是杜絕細(xì)菌熱原污染的根源所在。透析用水消毒方式以熱消毒和化學(xué)消毒為主。熱消毒通過短時間將水溫提高并進(jìn)行熱沖洗，達(dá)到恒溫后熱循環(huán)在管路中達(dá)到消毒作用，而化學(xué)消毒主要使用過氧乙酸等消毒劑，有效阻止細(xì)菌在水中增殖生長[4-5]。雖然消毒可以有效阻菌，但是不能徹底消滅透析用水水路中的微生物及相關(guān)物質(zhì)，如洋蔥伯克霍爾德菌易在供水系統(tǒng)、濾膜和消毒劑中生長[6]。同時日常監(jiān)測僅定期監(jiān)測透析用水的污染情況，相關(guān)規(guī)范對于透析水路管理中細(xì)菌及內(nèi)毒素均有采樣檢測時間和限值要求。但不同消毒模式下透析用水中細(xì)菌和內(nèi)毒素含量動態(tài)變化缺少監(jiān)測和分析。

本研究基于水路消毒系統(tǒng)模式下不同的物理參數(shù)及溫度，確定透析用水動態(tài)監(jiān)測的溫度和時間間隔。預(yù)測微生物學(xué)是一門交叉學(xué)科，利用微生物和計算機(jī)方法預(yù)測微生物在系列環(huán)境條件中消長的情況。通過Origin軟件的數(shù)據(jù)擬合，應(yīng)用微生物模型曲線描述透析用水微生物指標(biāo)存活和變化規(guī)律[7]，了解透析用水中細(xì)菌和內(nèi)毒素含量在消毒過程中動態(tài)變化和持續(xù)情況，旨在細(xì)化消毒監(jiān)測管理，優(yōu)化水質(zhì)安全控制。

1 材料與方法

1.1 材料 封閉式薄膜過濾器，硝酸纖維素濾膜(孔徑0.22 μm，直徑50 mm)， 胰化蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(TGEA)(HBPM8573-1，規(guī)格9 cm×10 cm)，BIOBASE多功能恒溫箱(型號BJPX-100)，革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒(喜諾生物醫(yī)藥)(EKT-13M、25M)，細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀(IGL-800)，一次性無熱原采樣試管(PSB210104，規(guī)格：9 mm×65 mm)，鱟試劑(喜諾生物醫(yī)藥)，脂多糖標(biāo)準(zhǔn)品(購于SIGMA-ALDRICH，成份LPS fromEscherichiacoliO111∶B4，蛋白含量小于3%)。

1.2 水樣采集方法

1.2.1 采樣點(diǎn) 透析用水采樣點(diǎn)為回水口(輸水管路末端)或混合室入口處(透析機(jī)與輸水回路連接部位U型采樣口)。因熱消毒的加熱和PHD循環(huán)程序、化學(xué)消毒的消毒劑浸泡程序運(yùn)行時回水口閥門關(guān)閉，兩個消毒程序過程均采集了整個輸水管路三個不同部位的混合室入口處，即首機(jī)(使用頻率低的1床過渡透析機(jī))、中間機(jī)(管路中間并第二個加熱組件部位對應(yīng)透析機(jī)位)、尾機(jī)(最后一臺透析機(jī)),見圖1。

1.2.2 采樣方法 用75%乙醇棉簽先消毒采樣口內(nèi)外表面后放水60 s，采集至無菌無熱源容器中，過程遵循無菌操作原則。每份供試液水樣采集80 mL，所需用量細(xì)菌培養(yǎng)50 mL，內(nèi)毒素測定10 mL。

1.3 采樣時機(jī) (1)熱消毒程序前管路的基礎(chǔ)情況、熱消毒程序(程序啟動開始、加熱升溫沖洗、PHD熱循環(huán)、冷卻排放、系統(tǒng)關(guān)閉)、持續(xù)消毒完成后共20 h。熱消毒設(shè)備在加熱期間管路的不同位置有熱敏顯示器監(jiān)測水溫，初始水溫作為動態(tài)溫度的起始點(diǎn)20℃，采樣溫度為20～90℃，每間隔10℃。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)采集、檢測同采樣點(diǎn)同溫條件下3個單獨(dú)水樣(n=9)，試驗(yàn)結(jié)果計算取平均值。(2)化學(xué)消毒程序前管路的基礎(chǔ)情況、化學(xué)消毒程序(程序啟動開始、沖洗加入消毒劑、循環(huán)、浸泡、沖洗、反復(fù)沖洗、系統(tǒng)關(guān)閉)、持續(xù)消毒完成后共20 h。水溫基本穩(wěn)定17～20℃，采樣時間為0～195 min，每間隔15 min。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)采集檢測同采樣點(diǎn)同時間點(diǎn)3個單獨(dú)水樣(n=9)，試驗(yàn)結(jié)果計算取平均值。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)方法 參照YY 0572—2015標(biāo)準(zhǔn)，采用濾膜過濾法富集，水樣取量50 mL，富集在濾膜上。富集時保持液體全部覆蓋濾膜表面，過程中保證濾膜在過濾前后的完整性，避免污染，同時設(shè)立陰性對照。將濾膜放在TGEA培養(yǎng)皿上20℃恒溫培養(yǎng)7 d后進(jìn)行菌落計數(shù)，單位為CFU/mL[8]。

1.5 內(nèi)毒素測定 依據(jù)《中國藥典》動態(tài)比濁細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。檢測反應(yīng)混合物的濁度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需要的反應(yīng)時間，可準(zhǔn)確測定透析用水中細(xì)菌內(nèi)毒素含量。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及可靠性試驗(yàn)，將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品用純水溶解，稀釋成5個不同濃度，消除干擾，用真菌/細(xì)菌動態(tài)檢測儀進(jìn)行檢測，以稀釋度為自變量，以每個濃度測定結(jié)果均值為因變量繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回收率為75%～125%。

1.6 數(shù)據(jù)擬合分析 通過Origin(2017版)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)模型擬合，兩種消毒模式下不同時間或溫度下細(xì)菌含量變化使用logistic模型擬合，logistic模型是典型的預(yù)測模型，描述微生物數(shù)量隨著時間變化的情況[9]。用于微生物生長和失活情況擬合效果良好。采用細(xì)菌存活率描述透析用水中細(xì)菌含量變化[10]，計算公式如下：ηh=Nt/N0(ηh細(xì)菌的存活率，Nt為不同時間對應(yīng)的水中細(xì)菌含量，N0為消毒前初始水中細(xì)菌含量)，對存活率與各時間進(jìn)行對數(shù)非線性logistic模型擬合。不同消毒模式下內(nèi)毒素隨著時間或溫度變化的情況使用高斯(Gauss)函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。

2 結(jié) 果

2.1 兩種消毒模式下透析用水中細(xì)菌存活率對數(shù)與觀察時間關(guān)系 消毒前透析用水中細(xì)菌初始含量：熱消毒、化學(xué)消毒分別為2.46、3.06 CFU/mL。兩種消毒模式觀察時間均選擇為180 min。消毒處理對透析用水中細(xì)菌存活影響顯著，兩種消毒模式細(xì)菌存活率對數(shù)與消毒程序時間的關(guān)系呈現(xiàn)相似曲線特征，細(xì)菌存活率隨著消毒程序時間的增加而減少，在50～160 min時，細(xì)菌存活情況變化幅度大，熱消毒細(xì)菌含量減少的變化比化學(xué)消毒平緩，見圖2。

上述由logistic模型擬合結(jié)果的方程及其參數(shù)，方程為：

(1)

式中t為消毒處理時間(min)，A1、A2、t0、p為模型的參數(shù)，見表1。熱消毒和化學(xué)消毒的曲線決定系數(shù)(R2)分別為0.982 84、0.988 37。R2越接近1，擬合效果越好，圖1模型曲線擬合效果均良好。

表1 兩種消毒模式下細(xì)菌存活率對數(shù)與觀察時間關(guān)系擬合方程的相關(guān)參數(shù)

2.2 熱消毒程序過程中透析用水中內(nèi)毒素含量與溫度變化關(guān)系 采集輸水管路首尾、中間分布的三個混合室入口部位的透析用水中內(nèi)毒素與溫度的關(guān)系曲線特征變化基本一致。內(nèi)毒素含量隨著溫度不斷上升而增加，隨著冷卻溫度下降而減少。在70、80℃時整個管路水中內(nèi)毒素含量最高。首機(jī)處(第一臺透析機(jī))內(nèi)毒素含量整體水平高于中間機(jī)和尾機(jī)，中間機(jī)和尾機(jī)處的內(nèi)毒素含量高峰對應(yīng)的溫度略低于首機(jī)處溫度。尾機(jī)處內(nèi)毒素含量在冷卻后30～20℃趨于平穩(wěn)。見圖3。

上述擬合結(jié)果的方程及其參數(shù)，方程為：

(2)

式中x為消毒程序中的溫度變化對應(yīng)標(biāo)值，A、w、y0、xc為模型的參數(shù)，見表2。首機(jī)、中間機(jī)、尾機(jī)混合室入口處內(nèi)毒素曲線的決定系數(shù)(R2)分別為0.968 59，0.812 31、0.795 24。R2越接近1，擬合效果越好，圖3函數(shù)曲線擬合效果均良好。

表2 熱消毒模式下透析用水內(nèi)毒素含量與溫度變化擬合方程的相關(guān)參數(shù)

2.3 化學(xué)消毒程序過程中透析用水中內(nèi)毒素含量與時間變化關(guān)系 采集輸水管路首尾、中間分布的三個混合室入口部位的透析用水中內(nèi)毒素與時間的關(guān)系曲線特征變化基本一致。內(nèi)毒素含量集中升高在中間時段，之后隨著時間的延長內(nèi)毒素含量下降并趨于平穩(wěn)。在80～120 min消毒程序中的消毒劑浸泡沖洗時間段，整個管路水中內(nèi)毒素含量最高，其中首機(jī)處內(nèi)毒素值最高。中間機(jī)內(nèi)毒素含量整體水平高于尾機(jī)，中間機(jī)和尾機(jī)處的內(nèi)毒素含量高峰對應(yīng)的時間略早于首機(jī)處。三處內(nèi)毒素含量在沖洗階段后趨于平穩(wěn)。見圖4。

上述擬合結(jié)果的方程及其參數(shù)，方程同2.2中方程(2)，式中x為消毒程序時間(min),A、w、y0、xc為模型的參數(shù)，見表3。首機(jī)、中間機(jī)、尾機(jī)三條曲線的決定系數(shù)(R2)分別為0.819 30、0.521 38、0.947 61。R2越接近1，擬合效果越好，圖4中間機(jī)的函數(shù)曲線擬合稍差，其余兩條曲線擬合效果良好。

表3 化學(xué)消毒模式下透析用水內(nèi)毒素含量與時間變化擬合方程的相關(guān)參數(shù)

2.4 兩種消毒程序下20 h內(nèi)透析用水中內(nèi)毒素含量變化 兩種模式下內(nèi)毒素在消毒程序內(nèi)均隨時間增加而升高，隨后下降到較低的值趨于平穩(wěn)，熱消毒后到15 h時稍有上升后下降，化學(xué)消毒后水中內(nèi)毒素到12 h時有逐漸上升趨勢。見圖5。

上述擬合結(jié)果的方程及其參數(shù)，方程同2.2中方程(2)，式中x為消毒程序時間(min)、A、w、y0、xc為模型的參數(shù)，見表4。熱消毒和化學(xué)消毒曲線的決定系數(shù)(R2)分別為0.976 97，0.720 97。R2越接近1，擬合效果越好，圖5函數(shù)曲線擬合效果良好。

表4 兩種消毒模式下透析用水內(nèi)毒素含量與時間變化擬合方程的相關(guān)參數(shù)

3 討 論

臨床上使用的透析用水雖經(jīng)過反滲處理，但多數(shù)研究證明存在不同程度的污染情況，如細(xì)菌、內(nèi)毒素、細(xì)菌來源的DNA短片段等大中分子物質(zhì)，并且這些片段及分子物質(zhì)可能通過透析器膜，從而誘導(dǎo)患者炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致慢性炎癥及并發(fā)癥發(fā)生及進(jìn)展[11-12]。透析用水的質(zhì)量保障在于水路系統(tǒng)的消毒維護(hù)。日常按有關(guān)規(guī)范對透析用水的微生物指標(biāo)定期抽樣監(jiān)測，對管路中消毒前后微生物及產(chǎn)物的動態(tài)特征定量觀察也是監(jiān)測工作中的重要部分。

細(xì)菌含量變化規(guī)律初級模型擬合顯示，雖熱消毒比化學(xué)消毒的程序時間長，但細(xì)菌存活率與消毒程序時間的關(guān)系呈現(xiàn)相似曲線特征，說明兩種消毒處理對透析用水中細(xì)菌存活影響均較為顯著。兩條曲線50～160 min時間段細(xì)菌含量變化幅度較大。在不同消毒程序下，化學(xué)消毒比熱消毒使細(xì)菌存活率略低。絕大部分細(xì)菌死亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使消毒完畢無法達(dá)到100%除菌。

本研究結(jié)果顯示，內(nèi)毒素含量變化對溫度和過氧乙酸浸泡敏感，但兩種消毒過程中內(nèi)毒素變化規(guī)律存在明顯不同。熱消毒機(jī)組有2個加熱組件，通過將水溫逐漸加熱并沖洗，后至恒溫85～90℃，管路在程序升溫和冷卻環(huán)節(jié)熱敏顯示溫度是不均衡的，所以使用管路中3個部位的水樣擬合，綜合說明整個管路真實(shí)情況。高斯函數(shù)擬合結(jié)果顯示，3個部位的內(nèi)毒素與溫度的關(guān)系曲線特征變化基本一致。內(nèi)毒素含量隨著溫度不斷上升而增加，水溫?zé)釠_擊短時間可殺死細(xì)菌，同時釋放大量內(nèi)毒素，在升溫過程中50、60℃仍有細(xì)菌存活，一些細(xì)菌存活溫度稍高并且細(xì)菌死亡率的倒數(shù)(D值)高，如乳桿菌、假單胞菌等[13]。在70、80℃時整個管路水中內(nèi)毒素含量最高。首機(jī)處內(nèi)毒素含量整體水平高于中間機(jī)和尾機(jī)，因?yàn)檫^渡機(jī)使用頻率低，微生物污染情況相對較重。中間機(jī)和尾機(jī)處的內(nèi)毒素含量高峰對應(yīng)的溫度略低于首機(jī)處溫度，是因?yàn)闊崴攘髦潦讬C(jī)，溫度監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)中間和尾機(jī)的溫度上升比首機(jī)慢，同時也說明內(nèi)毒素釋放對溫度敏感?；瘜W(xué)消毒擬合3個采樣部位內(nèi)毒素與時間的變化關(guān)系曲線特征，結(jié)果顯示隨著消毒劑作用時間內(nèi)毒素先達(dá)到釋放峰值后下降。在80～120 min消毒程序中的過氧乙酸浸泡沖洗時間段，整個管路水中內(nèi)毒素含量最高，其中首機(jī)處內(nèi)毒素值最高釋放晚于中間和尾部管路部位，但在短期集中快速釋放。再次證明過渡機(jī)的污染情況可能嚴(yán)重。中間機(jī)和尾機(jī)處的內(nèi)毒素含量高峰對應(yīng)的時間略早于首機(jī)處，因浸泡完沖洗管內(nèi)水流速約為1 400 L/H，沖流積累可使管路后端內(nèi)毒素含量略高于首機(jī)，并且在沖洗階段后3處內(nèi)毒素含量均趨于平穩(wěn)。化學(xué)消毒程序中浸泡沖洗環(huán)節(jié)對內(nèi)毒素釋放影響明顯。

觀察剛消毒完后內(nèi)毒素的持續(xù)釋放情況，結(jié)果顯示內(nèi)毒素在兩種消毒程序內(nèi)均隨時間增加而升高，隨后下降趨于平穩(wěn)，而熱消毒后15 h時、化學(xué)消毒后12 h水中內(nèi)毒素有逐漸上升趨勢，出現(xiàn)小峰值。本研究中涉及機(jī)組基本情況為供水管路和消毒機(jī)組管路較新，使用年限僅一年十個月，輸水管路很長。消毒機(jī)組管路為316不銹鋼材質(zhì)，供水管路為交聯(lián)聚乙烯(PEX)材質(zhì)。雖標(biāo)準(zhǔn)YY 0572—2015中規(guī)定透析用水中的內(nèi)毒素含量應(yīng)不超過0.25 EU/mL，干預(yù)水平為0.125 EU/mL。但在臨床實(shí)踐中，因供水分配系統(tǒng)的復(fù)雜性和輸水熱損失、水流波動性，會造成熱消毒、化學(xué)消毒效果的不均衡性[14]。尤其是加熱組件遠(yuǎn)端水路、使用點(diǎn)的熱損失，還有出口、管路拐點(diǎn)消毒浸泡沖洗短暫或易停滯的情況發(fā)生。因管路較新，內(nèi)毒素沒有超過限值，但在消毒過程中個別點(diǎn)卻達(dá)到干預(yù)值。結(jié)合細(xì)菌存活率試驗(yàn)結(jié)果，可能與細(xì)菌系統(tǒng)再定植有關(guān)。在消毒剛完成的次日，需要關(guān)注患者上機(jī)前制水系統(tǒng)的管理和及時更換快超期透析機(jī)內(nèi)毒素過濾器是必要的。

透析用水的供水系統(tǒng)為相對封閉的環(huán)境，管道系統(tǒng)中的水流，以及系統(tǒng)本身的設(shè)計和性質(zhì)也可能影響微生物指標(biāo)，如管道系統(tǒng)很可能藏匿著以生物膜方式生活的病原體細(xì)胞等[15-16]。應(yīng)用模型擬合曲線描述透析用水中細(xì)菌失活和內(nèi)毒素釋放變化，模型基于函數(shù)方程，y因變量在研究中為(細(xì)菌存活率對數(shù)、內(nèi)毒素含量)而隨不同溫度和時間而變化。除化學(xué)消毒下中間機(jī)的內(nèi)毒素與時間曲線外，其余曲線估計的R2值為0.720 97～0.988 37，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計擬合基本良好。說明所選函數(shù)模型能夠充分描述透析用水中細(xì)菌和內(nèi)毒素動態(tài)變化特征。消毒全過程中溫度和時間是影響透析用水微生物指標(biāo)決定性的參數(shù)。

本研究利用微生物數(shù)據(jù)模型擬合數(shù)據(jù)，用于描述透析用水中細(xì)菌失活和內(nèi)毒素變化規(guī)律，補(bǔ)充細(xì)化透析用水監(jiān)測方法。但本研究存在一定的局限性，即模型基于一家醫(yī)療機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)擬合而成，雖然為本省規(guī)模大的血透中心，有一定的參考性，但是缺少多樣本完善數(shù)據(jù)。同時本研究建立的微生物預(yù)測模型為初級，而完善的模型需要長期、重復(fù)的過程，并且建立高級模型，在日后的研究準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本、豐富試驗(yàn)設(shè)計、完善修正數(shù)據(jù)模型。在日常感控工作中，可根據(jù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)血透中心的基本情況，摸底繪制自身消毒過程下管路水中微生物指標(biāo)變化規(guī)律曲線。在傳統(tǒng)監(jiān)測上增加方法，動態(tài)分析微生物指標(biāo)的變化有助于更好地達(dá)到透析用水消毒效果，細(xì)化預(yù)防與控制措施。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。