何亞娟，王 飛，姚耐娟，吳宇超，田 臻

乙型肝炎病毒相關(guān)性慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure， HBV-ACLF)是肝衰竭的主要類型[1，2]。慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV再激活是HBV-ACLF的主要誘因[3]。在多種肝臟疾病發(fā)病過程中，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)被激活促進了疾病進展。特異性清除小鼠HSCs能有效抑制肝癌和自身免疫性肝病疾病進程[4, 5]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能抑制線粒體自噬，同時激活HSCs的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，參與肝衰竭的發(fā)病過程[6]。HBV DNA和HBx能夠誘導HSCs活化，活化的HSCs分泌多種細胞外基質(zhì)，參與肝纖維化發(fā)病過程[7, 8]。本課題組在前期對HBV基因組進行系統(tǒng)性研究時發(fā)現(xiàn)，在HBx 基因序列前存在一段序列(AY455709)，被稱為HBV的前x(pre-x)序列。Pre-x全長為168 bp，編碼56個氨基酸(AAR20696.1)。Pre-x基因與經(jīng)典x基因共同表達全x蛋白(hepatitis B whole x，HBwx)[9, 10]。HBwx是否參與、如何參與了HBV-ACLF的發(fā)病過程并無相關(guān)研究。本研究向LX2細胞轉(zhuǎn)染HBwx質(zhì)粒，檢測LX2細胞自噬和炎癥反應(yīng)，同時檢測HSCs炎癥對HL-7702細胞凋亡的影響，旨在探究HBwx和HSCs在HBV-ACLF發(fā)病過程中的作用，為HBV-ACLF的治療研究提供新的思路和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 LPS購于美國Sigma公司，Annexin V-PI凋亡試劑盒購于美國BD公司，抗-p62、抗-LC3、抗-NLRP3和抗-pro-IL抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，抗-HBwx多克隆抗體由本課題組構(gòu)建[8, 9]，檢測IL-1β的 ELISA試劑盒購于美國R&D SYSTERM公司。

1.2 LX2細胞和HL7702細胞培養(yǎng) 取人肝星狀細胞系LX2細胞和人肝細胞系HL7702細胞，接種于含10%胎牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、95%濕度的孵育箱中傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞接種于6孔板。將LX2細胞分為對照組、LPS處理組、轉(zhuǎn)染HBwx組和LPS聯(lián)合轉(zhuǎn)染HBwx組。在HBwx組和LPS聯(lián)合HBwx組，轉(zhuǎn)染HBwx質(zhì)粒。在LPS處理組和LPS聯(lián)合HBwx組細胞，用1 μg/mL LPS作用4 h。采用Western blot法檢測各組細胞p62、LC3、NLRP3和pro-IL1表達，采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清IL-1β。重復上述實驗，LPS作用LX2細胞4 h，用PBS洗滌細胞3次，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收取培養(yǎng)基備用；將HL7702細胞分為對照組、LPS組、HBwx組和LPS聯(lián)合HBwx組，各組分別加入收取的培養(yǎng)基作用12 h，收集HL7702細胞，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 HBwx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX2細胞 HBwx質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建[9, 10]。利用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入LX2細胞，按2×104cells/每孔密度將生長良好的LX2細胞接種于6孔板，待其生長密度達到 50%～70%融合度時，進行轉(zhuǎn)染。將X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent、HBwx質(zhì)粒和DMEM培養(yǎng)基室溫放置10 min，平衡至15℃～25℃，向200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入1.5 μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent和0.5 μg HBwx質(zhì)粒，混合均勻，室溫孵育20 min。向每孔加入450 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，將上面的混合物50 μL加入孔中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.4 細胞凋亡檢測 用0.25%胰蛋白酶消化HL7702細胞，制成單細胞懸液，用PBS漂洗，重懸在1×結(jié)合緩沖液中，調(diào)細胞密度為1×106個/mL，用5 μL Annexin V-FITC和1×結(jié)合緩沖液室溫孵育15 min。加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液和5 μL PI工作液，置于冰上，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5 細胞HBwx表達檢測 將已爬好LX2細胞(轉(zhuǎn)染HBwx)的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min，用4%多聚甲醛固定15 min；PBS浸洗3次，每次3 min，用0.5% TritonX-100室溫通透20 min；PBS浸洗3次，每次3 min，用吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；用吸水紙吸干封閉液，滴加足量的抗-HBwx(1: 50)并放入濕盒，4 ℃孵育過夜；PBST 浸洗3次，每次3 min，用吸水紙吸干PBST，滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37 ℃孵育1 h；PBST浸洗3次，每次3 min，滴加DAPI避光孵育5 min；PBST 浸洗3次，每次5 min，用吸水紙吸干PBST，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。然后，在熒光顯微鏡下觀察和采集圖像。

1.6 細胞蛋白檢測 采用Western blot 法，用蛋白質(zhì)抽提劑按步驟提取LX2細胞總蛋白，行SDS凝膠電泳，采用半干法轉(zhuǎn)膜50 min轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別加入兔抗大鼠p62、LC3、NLRP3和pro-IL1單克隆抗體或抗HBwx多克隆抗體，4℃孵育過夜，應(yīng)用羊抗兔IgG孵育1.5 h，用ECL發(fā)光液孵育1 min后壓X光片，顯影。

2 結(jié)果

2.1 LX2細胞轉(zhuǎn)染并表達HBwx 用HBwx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX2細胞，在轉(zhuǎn)染48 h后分別以免疫熒光和Western Blot法檢測HBwx表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBwx定位于LX2細胞細胞質(zhì)，如圖中綠色熒光所示(圖1A)；Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比，HBwx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX2細胞表達HBwx蛋白(圖1B)。

圖1 LX2細胞表達HBwxA：免疫熒光檢測LX2細胞HBwx表達，經(jīng)HBwx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX2細胞48 h，結(jié)果HBwx定位于細胞質(zhì)，表現(xiàn)為綠色熒光；B：經(jīng)HBwx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48 h，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)LX2細胞表達HBwx蛋白

2.2 HBwx抑制LX2細胞自噬和促進細胞NLRP3炎癥小體活化情況 與正常組比，LPS組、HBwx組和LPS聯(lián)合HBwx組自噬相關(guān)蛋白LC3表達顯著減低，而p62表達顯著增強(P<0.05)；與LPS組或HBwx組比，LPS聯(lián)合HBwx組自噬相關(guān)蛋白LC3表達進一步減低，而p62表達進一步增強(P<0.05，圖2A、圖2B)；與正常組比，LPS組、HBwx組和LPS聯(lián)合HBwx組炎癥相關(guān)蛋白NLRP3和pro-IL1表達顯著增強(P<0.05)；與LPS組或HBwx組比，LPS聯(lián)合HBwx組炎癥相關(guān)蛋白NLRP3和pro-IL表達進一步增強(P<0.05，圖2A、圖2C)；與正常組比，LPS組、HBwx組和LPS聯(lián)合HBwx組IL-1β分泌顯著增多(P<0.05)；與LPS組或HBwx組比，LPS聯(lián)合HBwx組IL-1β分泌進一步增多(P<0.05，圖2D)。

2.3 HBwx促進HSCs炎癥反應(yīng)和促進HL-7702細胞凋亡 與正常組比，LPS、HBwx和LPS聯(lián)合HBwx處理HL-7702細胞凋亡水平顯著增強(P<0.05)；與LPS組或HBwx組比，LPS聯(lián)合HBwx處理HL-7702細胞凋亡水平進一步增強(P<0.05，圖3A、圖3 B)。

圖2 HBwx抑制LX2細胞自噬和促進NLRP3炎癥小體活化與正常組比，**P<0.01；與LPS聯(lián)合HBwx組比，*P<0.05A、B：與正常組比，LPS組、HBwx組和LPS聯(lián)合HBwx組LC3表達顯著減低，而p62表達顯著增強；與LPS組和HBwx組比，LPS聯(lián)合HBwx組LC3表達進一步減低，而p62表達進一步增強；A、C：與正常組比，LPS組、HBwx組和LPS聯(lián)合HBwx組NLRP3和pro-IL1表達顯著增強；與LPS組和HBwx組比，LPS聯(lián)合HBwx組NLRP3和pro-IL表達進一步增強；D：與正常組比，LPS組、HBwx組和LPS聯(lián)合HBwx組IL-1β分泌顯著增高；與LPS組和HBwx組比，LPS聯(lián)合HBwx組IL-1β分泌進一步增高

圖3 四組HL-7702細胞凋亡水平比較與對照組比，**P<0.01；與LPS聯(lián)合HBwx組比，*P<0.05

3 討論

HBV-ACLF是肝衰竭的主要類型。肝衰竭患者病死率仍然較高，探究肝衰竭發(fā)病機制對制定治療方案、提高患者生存率具有重要的意義[11, 12]。HBV可通過多種途徑參與HBV-ACLF的發(fā)病過程，如HBV能夠激活患者體內(nèi)細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，誘導肝細胞損傷[13]；HBV能夠直接激活肝細胞程序性死亡，誘導細胞凋亡[14]；HBx抑制肝細胞自噬，使細胞對損傷的耐受性降低，參與肝衰竭的發(fā)病進程[15]。HBwx是我們新近發(fā)現(xiàn)的HBV病毒蛋白， HBwx作為HBV病毒蛋白如何調(diào)節(jié)HSCs功能？本研究發(fā)現(xiàn)將LX2細胞轉(zhuǎn)染HBwx質(zhì)粒能激活NLRP3炎癥小體，同時HBwx能增強LPS誘導LX2細胞炎癥反應(yīng)的作用，即HBwx能夠增強LPS激活HSCs的NLRP3炎癥小體，促進HSCs炎癥反應(yīng)。

既往研究發(fā)現(xiàn)HBx通過激活PI3K-Akt-mTOR途徑誘導細胞自噬，研究同時證實自噬能夠有效抑制細胞的炎癥反應(yīng)進程[16-18]。Pre-x基因與經(jīng)典x基因共同表達HBwx，HBwx是否同樣經(jīng)由自噬調(diào)節(jié)HSCs炎癥反應(yīng)？本研究我們發(fā)現(xiàn)將LX2細胞轉(zhuǎn)染HBwx后能抑制LC3表達，而促進p62表達，表明HBwx能夠抑制LX2細胞自噬。研究同時發(fā)現(xiàn)HBwx能有效增強LPS抑制LC3表達和促進p62表達作用，表明HBwx增強了LPS抑制LX2細胞自噬，促進了細胞炎癥反應(yīng)。

HBwx作為新近發(fā)現(xiàn)的HBV病毒蛋白，如何通過HSCs參與肝衰竭發(fā)病過程？炎癥反應(yīng)在多種疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用。研究證實炎癥反應(yīng)參與肝衰竭發(fā)病過程中的肝細胞損傷過程，并貫穿肝衰竭的始終[19, 20]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)HSCs炎癥反應(yīng)參與肝衰竭的疾病進程，本研究發(fā)現(xiàn)LPS和HBwx處理組HL-7702細胞凋亡水平顯著高于對照組，而以LPS聯(lián)合HBwx處理組細胞凋亡水平最高，炎癥因子IL-1β促進HL-7702細胞凋亡可能參與了肝衰竭疾病進程。

本研究發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)LPS能夠誘發(fā)HSCs炎癥反應(yīng)，分泌炎癥因子IL-1β，誘導肝細胞凋亡。HBV病毒蛋白HBwx抑制細胞自噬、增強HSCs炎癥反應(yīng)，進而促進肝細胞凋亡，參與細胞凋亡過程。本研究豐富了肝損傷的發(fā)病機制，但還存在一些局限性。本研究只是發(fā)現(xiàn)HBwx抑制自噬、促進HSCs炎癥反應(yīng)，并未深入探究HBwx抑制自噬和促進HSCs炎癥反應(yīng)的分子學機制，后續(xù)實驗將著重深入探究其內(nèi)在的機制。