白 亮，王寶太，高志峰，蔣 安，梁金強(qiáng)

慢性肝病導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化，進(jìn)而可進(jìn)展為肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。作為肝纖維化細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)的增殖和活化是肝纖維化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[2-4]。因此，了解HSC激活的分子機(jī)制對于抗纖維化治療至關(guān)重要。配對盒基因6(paired box gene 6，PAX6)屬于配對盒基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)多種信號通路，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、分化和細(xì)胞周期[5]。有證據(jù)表明，PAX6與肝纖維化Hedgehog信號通路間存在密切的關(guān)聯(lián)[6，7]。HSC活化由幾種有絲分裂原酶促進(jìn)，包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MEK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)等。MEK與ERK結(jié)合導(dǎo)致酪氨酸殘基二聚化，進(jìn)而激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路[8，9]，而阻斷MEK/ERK信號傳導(dǎo)將阻斷MAPK和PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而抑制HSC激活并減弱了實(shí)驗(yàn)性肝纖維化進(jìn)展[10]。但目前關(guān)于PAX6在肝星狀細(xì)胞活化和增殖過程中的作用尚不清楚。本研究探討了在MEK/ERK信號通路活化抑制HSCs活化和增殖過程中PAX6的作用，為抗肝纖維化治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 LX2肝星狀細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海典型培養(yǎng)物保藏中心。10%胎牛血清(FBS，Thermo Fisher Scientific，Inc.，批號：403296)、DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham USA，批號：B5362.3)、Lipofectamine 2000(美國Invitrogen，批號：W-96512.32)、細(xì)胞計(jì)數(shù)8(CCK-8)試劑盒(日本Vazyme，批號：S856.63)、異60%油紅O(德國默克生物科技，批號：415963.3)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑(中國碧云天生物科技，批號：N54123.3)、RNA TRIzol? (美國Thermo Fisher Scientific Inc.，批號：UI-5415363)、QIAGEN OneStep RT-PCR試劑盒(Qiagen中國有限公司，批號：415363.3)、TaqMan MRNA Assay 試劑盒(美國Applied Biosystems，批號：D-4153.3)、Assay Lysis 緩沖液(Beyotime Institute of Biotechnology，中國，批號：51423.3)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(EMD Millipore，美國，批號：4152.36)、兔抗MEK、抗ERK抗體(1：200，貨號，F(xiàn)1555、65412，Sigma-Aldrich，美國)、兔抗GAPDH 抗體(1：200，貨號，G9545，Sigma-Aldrich，美國)、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1：10000，目錄號，R0881，Sigma-Aldrich，美國)、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(EMD 密理博，美國，批號：W41526)。SC-74酶標(biāo)儀(Molecular Devices)、SD-96流式細(xì)胞儀(美國賽默飛世)、7500實(shí)時(shí) PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems)、Image J軟件(美國馬里蘭州國立衛(wèi)生研究院)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取10 mL LX2細(xì)胞(5×106/mL)，在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，5% CO2、37℃、20% O2培養(yǎng)。設(shè)對照組、PAX6 inhibitor組(PAX6低表達(dá))、PAX6 mimics組(PAX6過表達(dá))；人LX2肝星狀細(xì)胞株P(guān)AX6 inhibitor、PAX6 mimics(均為100 nm)由Sigma-Aldrich(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)提供；PAX6開放閱讀框(ORF)質(zhì)粒來自Amspring Biological Technology Co Ltd(中國長沙)。將細(xì)胞接種在24孔板(1×105個細(xì)胞/孔)中，并根據(jù)制造商的說明使用100nM稀釋的Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。隨后，將細(xì)胞在含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)染后72 h收獲，用于進(jìn)一步分析。

1.3 細(xì)胞增殖測定 使用CCK-8試劑盒檢測，在各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將LX2肝星狀細(xì)胞以每孔5000個細(xì)胞的密度接種在96孔板中，72 h后，將10μL CCK-8溶液添加到每個孔中。在37℃下孵育1.5 h后，在SC-74酶標(biāo)儀上于450 nm處測量吸光度。存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD - LX2肝星狀細(xì)胞組OD)/(實(shí)驗(yàn)組OD-蒸餾水空白調(diào)零組OD)×100%。

1.4 細(xì)胞分化水平測定 將LX2肝星狀細(xì)胞以每孔5000個細(xì)胞的密度接種在96孔板。將細(xì)胞保持在1%瓊脂包被上，分化18 d。將細(xì)胞用福爾馬林固定1 h，隨后用60%油紅O染色10 min。以油紅O陽性細(xì)胞的比例/總細(xì)胞數(shù)為分化。

1.5 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期測定 各組LX2肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞與雙重染色的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑混合，然后在室溫下孵育10 min，使用SD-96流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后在轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞周期檢測試劑盒說明操作，將收集的細(xì)胞在70%乙醇中固定過夜。將細(xì)胞與100 μL碘化丙啶(PI)在黑暗中于4℃孵育30 min，并使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

1.6 細(xì)胞PAX6、MEK、ERK mRNA水平測定 使用RNA TRIzol?分離細(xì)胞總RNA。使用QIAGEN OneStep RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用TaqMan MRNA Assay試劑盒測定PAX6、MEK、ERK水平。PAX6、MEK、ERK引物由Applied Biosystems(Thermo Fisher Scientific，Inc)設(shè)計(jì)合成。GAPDH用作標(biāo)準(zhǔn)化對照。PCR反應(yīng)在 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。引物序列如下：GAPDH正向5′-TCGCACGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGATGCTAC-3′；反向5′-TGCGATGCTAGCTGATCGATCGTAGCTAGCGGGCGCTAGCTGCA-3′，PAX6正向5′-TGCGCTAGCTAGCTAGTCGCTAGCTGATCGATCGATCGATCGATCGCTAC-3′；反向5′-TGCGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGC-3′；MEK正向5′-TGCGATCGATCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTGATCGCT-3′；反向，5′-TGCGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTGCTAGCTC-3′；ERK正向，5′-TGCTAGCTAGGCGATGCGAGCGTAGCTAGGGGGCTAGCTAGTGCATCGTA-3′。熱循環(huán)儀條件為：95℃ 5 min，然后是40個循環(huán)的95℃變性15 s和60℃退火/延伸步驟30 s。熔解曲線分析用于確認(rèn)特異性擴(kuò)增。使用2-ΔΔCq方法計(jì)算靶基因mRNA的相對倍數(shù)變化。實(shí)驗(yàn)設(shè)6個復(fù)孔。

1.7 細(xì)胞MEK和ERK蛋白表達(dá)測定 采用蛋白印跡法測定細(xì)胞MEK和ERK蛋白表達(dá)，各組LX2肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，使用Assay Lysis緩沖液裂解細(xì)胞。蛋白質(zhì)(50 μg/泳道)通過12%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜3 h。兔抗MEK、ERK抗體和兔抗GAPDH抗體與PVDF膜一起在4℃下孵育過夜。用PBS洗滌3次后，將PVDF膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗一起孵育，并使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。應(yīng)用Image J軟件量化條帶強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 各組LX2肝星狀細(xì)胞增殖和存活率比較 與LX2肝星狀細(xì)胞組比，PAX6 inhibitor組增殖和存活率顯著升高(P<0.05)，而PAX6 mimics組顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組LX2肝星狀細(xì)胞增殖和存活率比較

2.2 各組LX2肝星狀細(xì)胞分化率、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞G1期比較 與LX2肝星狀細(xì)胞組比，PAX6 inhibitor組分化率升高，而細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞G1期降低(P<0.05)，PAX6 mimics組分化率降低，而細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞G1期升高(P<0.05，表2、圖1、圖2)。

表2 各組LX2肝星狀細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞G1期比較

圖1 各組LX2肝星狀細(xì)胞凋亡率比較A:LX2肝星狀細(xì)胞;B:PAX6 inhibitor;C:PAX6 mimics圖2 各組LX2肝星狀細(xì)胞G1期比較A:LX2肝星狀細(xì)胞;B:PAX6 inhibito;C:PAX6 mimics

2.3 各組LX2肝星狀細(xì)胞PAX6、MEK和ERK mRNA水平比較 與LX2肝星狀細(xì)胞比，PAX6 inhibitor組細(xì)胞PAX6 mRNA降低，而MEK和ERK mRNA水平升高(P<0.05)，PAX6 mimics組細(xì)胞PAX6 mRNA升高，而MEK和ERK mRNA降低(P<0.05，表3)。

表3 各組LX2肝星狀細(xì)胞PAX6、MEK和ERK mRNA水平比較

2.4 各組LX2肝星狀細(xì)胞MEK和ERK蛋白水平比較 與LX2肝星狀細(xì)胞比，PAX6 inhibitor細(xì)胞MEK和ERK蛋白升高(P<0.05)，而PAX6 mimics組細(xì)胞MEK和ERK蛋白降低(P<0.05，表4、圖3)。

表4 各組LX2肝星狀細(xì)胞MEK和ERK蛋白水平比較

圖3 各組LX2肝星狀細(xì)胞MEK和ERK蛋白表達(dá)比較A:LX2肝星狀細(xì)胞；B:PAX6 inhibitor；C:PAX6 mimics

3 討論

HSC細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和通過調(diào)節(jié)肝竇血流在維持肝臟結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在慢性肝損傷期間，HSC經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)化，活化的HSC在肝纖維化和肝硬化的發(fā)病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用?；罨腍SC具有增殖、合成細(xì)胞外基質(zhì)、分泌細(xì)胞因子以及遷移和收縮的能力。研究表明，PAX6調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動，如增殖、分化和成熟，并為影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，從而在視神經(jīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。PAX6表達(dá)在PDGF-BB誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中顯著下調(diào)。在HSC細(xì)胞，敲低PAX6顯著降低了α-SMA和COL1A1表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)了HSC的激活[11，12]。PAX6是皮質(zhì)祖細(xì)胞發(fā)育以控制細(xì)胞周期持續(xù)時(shí)間不可或缺的調(diào)控因子[13]。PAX6是體外HSC增殖和活化的抑制劑，PAX6是抑制肝纖維化進(jìn)展的有效靶點(diǎn)[14]。PAX6在肝纖維化過程中抑制Ras信號通路。眾所周知，Ras/MAPK信號通路參與肝纖維化和肝硬化期間HSC細(xì)胞生長、分化和遷移。此外，PAX6抑制PI3K-Akt信號通路進(jìn)而促進(jìn)HSC細(xì)胞凋亡來抑制細(xì)胞增殖和膠原基因表達(dá)[15]。PAX6抑制HSC細(xì)胞增殖和I型膠原基因表達(dá)。此外，應(yīng)用MEK抑制劑U0126和PI3K抑制PAX6可以減少PDGF誘導(dǎo)的靶向途徑激活，從而完全抑制HSC激活和膠原蛋白表達(dá)[16]。本研究結(jié)果顯示，與LX2肝星狀細(xì)胞組比，PAX6 inhibitor組細(xì)胞增殖、存活率和分化率升高，而PAX6 mimics組細(xì)胞增殖、存活率、分化率降低；與PAX6 inhibitor組比，PAX6 mimics組細(xì)胞增殖、存活率、分化率降低(P<0.05)，提示PAX6過表達(dá)可抑制肝星狀細(xì)胞活化和增殖，促進(jìn)其凋亡。

ERK/MAPK信號通路已顯示在肝纖維化和肝硬化發(fā)病過程中被激活并參與細(xì)胞生長、分化和遷移。許多不同的生長因子受體，包括血小板衍生生長因子受體和表皮生長因子受體，通過G蛋白Ras激活ERK/MAPK信號通路，結(jié)合Raf-1激酶，從而招募Raf-1到細(xì)胞膜的內(nèi)表面，而Raf-1磷酸化絲裂原活化MEK，后者又磷酸化并激活ERK。磷酸化的ERK易位到細(xì)胞核中，并通過與各種轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)，隨后導(dǎo)致纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)[17]。研究證明，PAX6是ERK/MAPK信號通路的抑制劑。PAX6是一種廣泛表達(dá)且高度保守的胞質(zhì)蛋白，在其非磷酸化形式中，PAX6干擾Raf-1的活性、破壞Raf/MEK相互作用并阻止MEK和下游組分的激活，對Raf/MEK/ERK通路進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。在磷酸化狀態(tài)下，PAX6從Raf-1解離并與G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的負(fù)調(diào)節(jié)因子GRK-2結(jié)合[18-20]?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，PKC對PAX6的磷酸化同時(shí)刺激Raf/MEK/ERK和GPCR途徑。本研究結(jié)果顯示，與LX2肝星狀細(xì)胞比，PAX6 inhibitor組細(xì)胞PAX6 mRNA降低，而MEK和ERK mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，PAX6 mimics組細(xì)胞PAX6 mRNA升高，而MEK和ERK mRNA和蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)，提示PAX6過表達(dá)可抑制肝星狀細(xì)胞MEK和ERK 表達(dá)，進(jìn)而抑制MEK/ERK通路的激活。

綜上所述，PAX6過表達(dá)可抑制肝星狀細(xì)胞活化和增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制了肝星狀細(xì)胞MEK和ERK基因表達(dá)，進(jìn)而抑制MEK/ERK通路的激活有關(guān)。