張開創(chuàng) 梁黎黎 張惠文 王瑞芳 楊 奕 孫宇寧 韓連書 余永國 邱文娟

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所 兒內(nèi)分泌遺傳代謝科（上海 200092）

糖尿病是以血糖升高為基本特征，由環(huán)境、遺傳及自身易感等多種因素共同參與造成的一組胰島素絕對或相對不足的疾病，是威脅兒童身心健康的慢性疾病之一。兒童期糖尿病主要分為1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）、2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）及特殊類型糖尿病[1]。三種糖尿病臨床表現(xiàn)可有重疊容易被誤診[2]，影響糖尿病的治療方案選擇、長期預(yù)后判斷及遺傳咨詢，因此對糖尿病作出準(zhǔn)確的分型及病因診斷具有重要的意義。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，二代測序在探尋分子遺傳學(xué)病因中發(fā)揮了巨大優(yōu)勢，但既往多為應(yīng)用基因靶向測序技術(shù)研究特殊類型糖尿病[3-4]，應(yīng)用全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）技術(shù)全面探尋糖尿病分子遺傳學(xué)病因的研究較少。本研究對疑似單基因糖尿病患兒行WES 以明確該疾病的臨床特點及分子遺傳學(xué)病因。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2020 年8 月至2021 年12 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒內(nèi)分泌遺傳代謝科確診的76 例糖尿病患兒的臨床資料。所有患兒符合糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。本研究獲上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（No.XHEC-D-2022-027）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集納入患兒的人口學(xué)資料、起病年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、臨床表現(xiàn)等資料。

1.2.2 常規(guī)實驗室檢查 包括初診時血糖、C 肽、胰島素、糖化血紅蛋白（HbA 1 c）、胰島自身抗體（GADA、IAA、IAB、IA-2A、ZnT8A）等實驗室數(shù)據(jù)。1.2.3 全外顯子高通量測序（whole exome sequencing，WES）WES 檢測的入組標(biāo)準(zhǔn)：①家族中有高血糖或糖尿病史；②6 月齡前發(fā)??；③合并有胰腺外癥狀，包括肝酶持續(xù)升高、智力低下等臨床表型；④輕度非進展的高血糖。患兒符合上述4 個條件之一者行全外顯子高通量測序[5]。首先提取患兒及父母外周血DNA，經(jīng)DNA 片段打碎、捕獲、富集及建庫等步驟之后利用Illumina HiSeq 4000測序平臺進行高通量測序，篩選出可疑變異，查閱該變異在1000 Genomes Project、Genome Aggregation Database（GnomAD）和Exome Variant Server（EVS）等數(shù)據(jù)庫中正常人群的分布頻率，利用SIFT、PolyPhen 2及Variant Taster 等在線軟件分析蛋白功能危害性，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)和指南（American college of medical genetics，ACMG）對所發(fā)現(xiàn)的變異進行致病性評級，對可疑變異進行患兒及父母來源的Sanger測序驗證。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；非正態(tài)分布的以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WES檢測結(jié)果

76 例患兒中符合WES 檢測入組條件的有21例。經(jīng)WES 檢測，9 例發(fā)現(xiàn)遺傳性致病病因，其中7 例為單基因糖尿病（表1），且均為青少年的成人起病型糖尿?。╩aturity-onset diabetes of the young，MODY）；2 例為糖尿病合并其他遺傳性致病病因（1例合并18p缺失綜合征，1例合并Wilson?。?。

表1 7例MODY患兒全外顯子測序結(jié)果

7 例MODY 共有3 個基因受累：3 例為GCK變異所致的MODY 2、3 例為HNF 1 A變異所致的MODY 3，1 例為INS變異所致的MODY 10。7 例MODY 患兒中除INS變異為新發(fā)變異外，其他6 例所攜帶變異均來自患有糖尿病的父親或母親。共發(fā)現(xiàn)了2個未報道的MODY相關(guān)新變異，分別為GCK基因的c.1124T＞G(p.V375G)和INS基因的c.110A＞T(p.E 37 V)，依據(jù)ACMG 評級標(biāo)準(zhǔn)均為致病性變異。

2.2 患兒臨床特點及初診時實驗室檢查

76 例DM 患兒分為MODY 組7 例、T 2 DM 組7例和T 1 DM 組62 例。三組之間年齡、BMI，初診時空腹血糖、C肽、胰島素、HbA1c差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MODY組血糖及HbA1c較T1DM組低；C 肽水平較T 1 DM 組高，較T 2 DM 組低；胰島素水平低于T1DM組和T2DM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。T2DM及MODY組患兒的胰島自身抗體均為陰性。

表2 不同型糖尿病患兒臨床資料比較[M(P25～P75)，()]

表2 不同型糖尿病患兒臨床資料比較[M(P25～P75)，()]

注：1)與T1DM組比較，P＜0.05；2)與T2DM組比較，P＜0.05

7 例MODY 患兒中5 例起病時無典型糖尿病癥狀，以偶然發(fā)現(xiàn)的血糖升高入院，2例表現(xiàn)為糖尿病“三多一少”癥狀，但無糖尿病酮癥酸中毒表現(xiàn)。7例患兒的父親或母親均有一方為糖尿病患者。

T 1 DM 患兒中1 例臨床表現(xiàn)有弓形眉和招風(fēng)耳等特殊面容及智力低下，WES 檢測提示染色體18p11.32-p11.21存在14 963kb缺失，該缺失包含與糖尿病表型無關(guān)的57個OMIM基因，后經(jīng)全基因組芯片檢測驗證為18 p 缺失綜合征。1 例T 2 DM 患兒因合并肝功能異常及銅藍(lán)蛋白降低，WES檢測發(fā)現(xiàn)其攜帶ATP7B基因的c.3089G＞A（p.Gly1030Asp）和c.1592A＞G（p.Lys531Arg）復(fù)合雜合變異，提示其合并Wilson病。

3 討論

單基因糖尿病是糖尿病的罕見類型，多由影響胰島β 細(xì)胞發(fā)育、功能或作用的單基因變異所致，多起病隱匿。隨著WES 的廣泛應(yīng)用，越來越多的單基因糖尿病被早期診斷[6]。相關(guān)研究應(yīng)用MODY相關(guān)基因靶向測序技術(shù)對胰島自身抗體陰性的82 例T1DM患者進行檢測，確診18例（22.0%）單基因糖尿病[7]，另一項應(yīng)用WES 對60 例非T 1 DM 患者的研究發(fā)現(xiàn)，24例（40.0%）確診為單基因糖尿病[3]。本研究對21 例疑診為單基因糖尿病患兒應(yīng)用WES探尋其遺傳學(xué)病因，7例診斷為單基因糖尿病，且均為MODY。

MODY是最常見的單基因糖尿病[8]。該病是常染色體顯性遺傳，通常在25歲前發(fā)病，表現(xiàn)為β細(xì)胞功能或分泌障礙。MODY 的亞型疾病譜因不同地域而有所差別，歐美患者中以HNF1A變異最常見[8]，亞洲人群中GCK-MODY最常見[9]。無明顯糖尿病癥狀被認(rèn)為是GCK-MODY的主要特征，本研究中3例患兒為GCK-MODY，2例為偶然發(fā)現(xiàn)血糖偏高，1例攜帶c.562G＞A變異患兒有糖尿病“三多一少”癥狀。c.562 G＞A 變異攜帶者的臨床表現(xiàn)有較強異質(zhì)性，從無癥狀到典型糖尿病癥狀均有報道[10]。目前已有600余例GCK-MODY被報道，未發(fā)現(xiàn)熱點變異[11]。GCK-MODY患者通常無遠(yuǎn)期糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，除了孕期需要藥物治療外，僅需飲食控制和運動干預(yù)即可[12]。本組患兒診斷明確后僅給予飲食控制和運動干預(yù)后血糖得到良好控制，避免了過度治療。

MODY 3 是由肝細(xì)胞核因子HNF 1 A基因變異引起，臨床上可表現(xiàn)為餐后血糖升高，但僅少部分患者有典型糖尿病癥狀。文獻提示此類患兒疾病初始常需低劑量磺脲類藥物治療，隨著病情進展患者胰島β 功能可能逐漸變差[13]。本研究中兩例患兒為偶然發(fā)現(xiàn)血糖偏高，1 例患兒因反復(fù)尿路感染發(fā)現(xiàn)高血糖。3例患兒診斷明確后調(diào)整為磺脲類藥物，血糖控制較前明顯好轉(zhuǎn)。3例患兒攜帶的HNF1A致病變異均為已報道變異，其中1 例患兒攜帶無義變異c.685C＞T(p.R229*)，以往研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄提前終止或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常的無義變異或移碼變異患者，比錯義變異患者需要胰島素治療的概率大[13]，該患者要告知預(yù)后加強隨訪。

MOD10是由胰島素基因INS變異造成的。INSMODY 患者的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)明顯異質(zhì)性，無癥狀到合并有酮癥酸中毒均有報道[14-15]。本研究中攜帶INS變異的患兒7.5歲時出現(xiàn)糖尿病“三多一少”癥狀，但未發(fā)生酮癥酸中毒。該變異既往未見報道，經(jīng)ACMG 評級為致病性變異，結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)及初診時實驗室檢查可確診。該患兒雖然是單基因糖尿病，但由于病因系胰島素基因缺陷所致的胰島素缺乏，故應(yīng)該終身給予胰島素注射治療。目前已有MODY10患者眼底、神經(jīng)及腎臟病變相關(guān)并發(fā)癥報道[14-16]，提示應(yīng)對該病的長期隨訪予以足夠重視。

全外顯子測序不僅有助于評估糖尿病病因，而且有助于解釋糖尿病外的臨床表現(xiàn)。1 例T 1 DM患兒表現(xiàn)為高血糖及智力低下，行WES 后發(fā)現(xiàn)18p11.32-p11.21存在14 963kb缺失，故診斷18p缺失綜合征，從而對智力低下做出臨床解釋。1 例T2DM肥胖患兒（BMI 25.1kg/m2）因持續(xù)肝功能異常就診發(fā)現(xiàn)高血糖，雖然肥胖患兒常合并肝功能損害，但由于該患兒銅藍(lán)蛋白及血銅氧化酶均降低，提示有可能為Wilson ??；WES 提示患兒攜帶ATP 7 B基因復(fù)合雜合致病性變異，明確為Wilson 病，并進行青霉胺治療。

總之，本研究對21例疑診為單基因糖尿病的患兒行WES，共檢出單基因糖尿病（均為MODY）患兒7例，對1例智力發(fā)育落后的T1DM患兒行WES檢測，發(fā)現(xiàn)其合并18 p 缺失綜合征，對另1 例肝酶進行性升高的T2DM患兒行WES檢測，發(fā)現(xiàn)其合并Wilson病，提示早期針對性進行WES檢測有助于明確單基因糖尿病的診斷并可精準(zhǔn)指導(dǎo)患兒的治療和預(yù)后。本研究提示單基因糖尿病中以MODY常見，擴展了MODY 的基因變異譜，同時建議當(dāng)糖尿病伴發(fā)胰腺外表現(xiàn)時，需考慮其他遺傳性疾病的診斷。