隋鳳翔 鄭義 楊芷怡 李曉巖 牛犇

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

松樹(shù)枯梢病是一種世界范圍內(nèi)分布最廣泛的松樹(shù)病害，其病原菌為松杉球殼孢(Sphaeropsissapinea)，該菌主要侵害樟子松、黑松、油松、紅松、馬尾松等針葉樹(shù)，影響范圍大，發(fā)展速度快，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致林木大面積枯死，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前防治松樹(shù)枯梢病的方法主要是化學(xué)防治，然而，化學(xué)藥劑的頻繁使用不僅會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，還會(huì)導(dǎo)致越來(lái)越嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞[2-3]。因此，開(kāi)展松樹(shù)枯梢病的生物防治十分必要?；谖⑸镛卓箘┑纳锓乐尉哂协h(huán)境友好且耐藥性低等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)對(duì)松樹(shù)枯梢病綠色防控的重要選項(xiàng)之一。

瓦雷茲芽孢桿菌(Bacillusvelezensis，曾用名B.amyloliquefacienssubsp.plantarum)FZB42是重要的植物促生根際細(xì)菌(plant growth promoting rhizobacterium，PGPR)[4]。此外，基因組測(cè)序結(jié)果分析顯示，菌株FZB42含有11個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇，能夠通過(guò)非核糖體途徑及核糖體途徑合成多種脂肽類(lèi)(bacillomycin D，fengycin，surfactin)、聚酮類(lèi)(bacillaene，difficidin，macrolactin)及多肽類(lèi)(plantazolicin，amylocyclicin)抑菌活性物質(zhì)，具有顯著的生防潛力[4-6]。研究表明，F(xiàn)ZB42可抑制尖孢鐮刀菌等多種病原菌的生長(zhǎng)，但其對(duì)松杉球殼孢的潛在影響尚未被充分評(píng)價(jià)[7]。本研究利用瓦雷茲芽孢桿菌FZB42對(duì)松杉球殼孢的抑菌效果進(jìn)行了研究，并對(duì)其抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行了初步分離及抑菌效果驗(yàn)證，以期深入解析其防治機(jī)理，為瓦雷茲芽孢桿菌FZB42作為松樹(shù)枯梢病生防制劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌：瓦雷茲芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)FZB42，松杉球殼孢(Sphaeropsissapinea)，均為實(shí)驗(yàn)室保存。

LB液體培養(yǎng)基：10 g NaCl、5 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨，1 000 mL蒸餾水。

PDA培養(yǎng)基：46 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、1 000 mL蒸餾水。

Landy培養(yǎng)基：5 g L-谷氨酸、0.5 g KCl、0.15 mg FeSO4·6H2O、5.0 mg MnSO4·H2O、0.16 mg CuSO4·5H2O，加入超純水使終體積為940 mL，調(diào)節(jié)pH=7.0，分裝至三角瓶中，121 ℃高壓滅菌鍋滅菌20 min；40%葡萄糖50 mL、10% KH2PO410 mL，分裝至三角瓶，115 ℃高壓滅菌15 min，將兩瓶液體混合均勻，待用。

MSGG培養(yǎng)基：50 mL 0.1 mol/L Pot. phosphate buffer、100 mL 1 mol/L MOPS、10 mL 5 mmol/L FeCl3、10 mL 200 mmol/L MgCl2、5 mL 10 mmol/L MnCl2、0.1 mL 10 mmol/L ZnCl2、1 mL 2 mmol/L硫胺素、5 mL 10 g/L色氨酸、5 mL 10 g/L苯基丙氨酸、5 mL 10 g/L蘇氨酸、25 mL 20%丙三醇、25 mL 20%谷氨酸鹽、700 μL 1 mol/L CaCl2、758.2 mL ddH2O。

硫酸銨、胃蛋白酶、PBS等購(gòu)于天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42體外抑菌活性測(cè)定

瓦雷茲芽孢桿菌FZB42抑菌活性測(cè)定采用平板對(duì)峙法[8]。將瓦雷茲芽孢桿菌FZB42從冰箱(-80 ℃)取出，使用平板劃線(xiàn)法接種于LB固體培養(yǎng)基中，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。將松杉球殼孢接種于固體PDA培養(yǎng)基，放置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，待用。挑取瓦雷茲芽孢桿菌FZB42單菌落，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，放置于搖床中30 ℃培養(yǎng)16 h，測(cè)定菌液在600 nm處的吸光度，并將其調(diào)整至OD600=1(以L(fǎng)B液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照)。利用5 mm打孔器在上述松杉球殼孢菌落邊緣打菌柄，并將菌絲面向下接種至PDA培養(yǎng)基中央。取上述FZB42菌液2 μL分別接種于距中央菌餅3.5 cm處的4個(gè)方向。設(shè)定3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)4 d后觀(guān)察拮抗結(jié)果，通過(guò)測(cè)量抑菌圈大小，根據(jù)下述公式計(jì)算抑制率：

抑制率=((對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑)×100%。

1.3 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液的制備及抑菌活性測(cè)定

采用Landy培養(yǎng)基制備瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液。選取500 mL三角瓶，按照器皿體積與培養(yǎng)液以體積比10∶1的比例加入50 mL Landy培養(yǎng)液，將瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液1 mL(OD600=1)接種于Landy培養(yǎng)液中，置于搖床中30 ℃培養(yǎng)60 h，設(shè)定空白Landy培養(yǎng)液作為對(duì)照。發(fā)酵結(jié)束后，將瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液離心(6 000 r/min，30 min)取上清，重復(fù)上述操作，直至肉眼觀(guān)察無(wú)菌液沉淀后，取上清液，利用0.22 μm注射器驅(qū)動(dòng)過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)菌，得到瓦雷茲芽孢桿菌FZB42的發(fā)酵濾液。

將制備好的瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵濾液與PDA培養(yǎng)基按照體積比1∶5的比例混合測(cè)定發(fā)酵濾液的抑菌活性。將5 mL FZB42發(fā)酵濾液與PDA培養(yǎng)基混合液分別加入到6孔板中，待其凝固后，取直徑5 mm的松杉球殼孢菌餅接種于每孔中央，設(shè)定空白PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)1 d，觀(guān)察抑菌結(jié)果，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的測(cè)量菌落半徑，并計(jì)算抑制率。

在PDA培養(yǎng)基中央接種直徑8 mm的松杉球殼孢菌餅，并在菌餅周?chē)嗑炏嗤睆教幰?5°插入蓋玻片若干，放置于培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)5 d，使松杉球殼孢菌絲生長(zhǎng)至蓋玻片上。將表面有松杉球殼孢菌絲的蓋玻片浸泡在FZB42 Landy發(fā)酵濾液中培養(yǎng)2 d，利用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察菌絲形態(tài)的變化，設(shè)定空白對(duì)照。

1.4 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液抗菌肽的粗提及抑菌活性測(cè)定

采用硫酸銨沉淀法分離提取FZB42發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)[9]。分別向20 mL FZB42發(fā)酵濾液中加入固體硫酸銨，直至最終飽和度達(dá)到60%和90%，置于冰箱4 ℃過(guò)夜沉淀，次日離心(10 000 r/min，4 ℃，30 min)，去上清，收集沉淀。用5 mL PBS(10 mmol/L，pH=7.5)將上述沉淀物充分溶解，并將其放入分子質(zhì)量為10 ku的透析袋中進(jìn)行透析脫鹽24 h，然后用10 mmol/L PBS (pH7.5)稀釋至20 mL，得到FZB42發(fā)酵液肽類(lèi)粗提物。將上述粗提取物與PDA培養(yǎng)基以體積比1∶5的比例混合，測(cè)定其對(duì)松杉球殼孢的抑菌效果，設(shè)定空白對(duì)照(PBS，10 mmol/L pH=7.5)。

為驗(yàn)證60%和90%飽和度的硫酸銨得到的沉淀為粗蛋白，在上述發(fā)酵液肽類(lèi)粗提物中加入胃蛋白酶(終質(zhì)量濃度為1 g/L,pH=2.0)37 ℃處理2 h。將上述胃蛋白酶水解液pH調(diào)至8，將胃蛋白酶水解液與PDA培養(yǎng)基以體積比1∶5的比例混合，測(cè)定其對(duì)松杉球殼孢的抑菌效果，設(shè)定空白對(duì)照(PBS，10 mmol/L pH=7.5)。

1.5 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42定殖相關(guān)生物學(xué)性狀檢測(cè)

將瓦雷茲芽孢桿菌FZB42單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，將OD600調(diào)至0.5，備用。

在96孔板中分別加入198 μL的MSGG液體培養(yǎng)基和2 μL上述瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液，設(shè)定200 μL MSGG液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，使用蒸餾水清洗96孔板3次后將其吸出，加入0.1%的結(jié)晶紫溶液染色30 min。染色結(jié)束后，吸去培養(yǎng)板中的結(jié)晶紫溶液，加入10%的醋酸溶液處理30 min，溶解與生物膜結(jié)合的結(jié)晶紫，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在570 nm處的OD值[9]。

在24孔板中分別加入495 μL LB液體培養(yǎng)基和5 μL上述瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液，設(shè)定500 μL LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。用牙簽將24孔培養(yǎng)板上每個(gè)孔的懸浮型生物膜挑起并移至2 mL離心管中，晾干后稱(chēng)量每個(gè)孔中的生物膜質(zhì)量。

用高壓滅菌后的牙簽蘸取瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液(OD600=0.5)菌液，使用牙簽穿刺法分別接種于含0.2%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基(swimming運(yùn)動(dòng)性檢測(cè))和含0.7%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基(swarming運(yùn)動(dòng)性檢測(cè))，避光靜置于培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)8～24 h，培養(yǎng)結(jié)束后拍照并測(cè)量菌落半徑[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42體外抑菌活性

如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液處理組的松杉球殼孢平板出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，松杉球殼孢的生長(zhǎng)受到顯著抑制，F(xiàn)ZB42對(duì)松杉球殼孢的抑制率為43.6%，說(shuō)明瓦雷茲芽孢桿菌FZB42在體外具有較強(qiáng)的抑制松杉球殼孢生長(zhǎng)的活性。

A為空白對(duì)照；B為B. velezensis FZB42處理組。

2.2 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液的體外抑菌活性評(píng)價(jià)

如圖2所示，未經(jīng)FZB42發(fā)酵液處理的松杉球殼孢生長(zhǎng)良好，F(xiàn)ZB42發(fā)酵液(Landy培養(yǎng)基，60 h)可顯著抑制松杉球殼孢生長(zhǎng)，抑制率高達(dá)98%。由此推測(cè)，F(xiàn)ZB42可通過(guò)合成分泌某些代謝物抑制松杉球殼孢生長(zhǎng)。

通過(guò)顯微鏡觀(guān)察瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵濾液對(duì)松杉球殼孢菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)良好，經(jīng)發(fā)酵濾液處理1 d，松杉球殼孢菌絲內(nèi)部出現(xiàn)較小較疏松的空泡，處理2 d后的菌絲表面出現(xiàn)了較明顯密集的突起和囊泡，菌絲形態(tài)受到嚴(yán)重破壞。

A為CK;B為B. velezensis FZB42 Landy培養(yǎng)基發(fā)酵液處理組。

A為CK，400×;B為發(fā)酵液處理1 d，400×;C為CK，100×;D為發(fā)酵液處理2 d，100×)。

2.3 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液抗菌肽的分離純化及其抑菌活性

為明確瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)，采用硫酸銨沉淀法分離肽類(lèi)物質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果如圖4和表1所示。結(jié)果表明，飽和度為60%和90%的硫酸銨粗提蛋白均能有效抑制松杉球殼孢生長(zhǎng)，且兩種飽和度硫酸銨粗提蛋白對(duì)松杉球殼孢的抑菌率相差不大，60%硫酸銨粗提蛋白的抑菌率為63.7%，90%硫酸銨粗提蛋白抑菌率為62.8%，但均低于FZB42Landy培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的抑菌率(96.1%)。使用胃蛋白酶水解粗提蛋白后，60%和90%飽和度硫酸銨粗提蛋白液對(duì)松杉球殼孢的抑制作用顯著減弱，分別降至8.6%和8.7%(表1)，可證明硫酸銨粗提蛋白在體外可抑制松杉球殼孢的生長(zhǎng)。

2.4 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌株生物膜形成測(cè)定

FZB42在MSGG培養(yǎng)基中形成的生物膜如圖5所示。在96孔板中，未加入FZB42菌液的空白對(duì)照組為澄清、透明液體，證明試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有雜菌污染，加入FZB42菌液的每個(gè)孔中都形成了有褶皺并且結(jié)構(gòu)致密的細(xì)菌生物膜，利用結(jié)晶紫染色并通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量CK及試驗(yàn)組OD570分別為0.10和3.27，結(jié)果如圖5B所示，說(shuō)明FZB42具有較強(qiáng)的生物膜形成能力。用滅菌牙簽挑取FZB42在24孔板中形成的生物膜，烘干并稱(chēng)其質(zhì)量，生物膜總干質(zhì)量為1.189 0 g，平均每孔干質(zhì)量為0.066 g。

A.60%硫酸銨粗提蛋白對(duì)松杉球殼孢的抑制試驗(yàn)；B.90%硫酸銨粗提蛋白對(duì)松杉球殼孢的抑制試驗(yàn)；C.FZB42發(fā)酵液對(duì)松杉球殼孢的抑制試驗(yàn)；D.胃蛋白酶處理粗提蛋白物對(duì)松杉球殼孢的抑制試驗(yàn)。

表1 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液及粗蛋白對(duì)松杉球殼孢的抑制率

A.FZB42生物膜表面形態(tài)，B.FZB42生物膜吸光值。

2.5 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力與其定殖密切相關(guān)。如圖6所示，F(xiàn)ZB42培養(yǎng)12 h后，F(xiàn)ZB42在兩種不同瓊脂濃度的LB培養(yǎng)基中的菌落半徑均為4.25 cm，由此證明FZB42具有很好的swarming運(yùn)動(dòng)性和swimming運(yùn)動(dòng)性。

3 討論

芽孢桿菌作為生防細(xì)菌最常見(jiàn)的機(jī)制之一就是通過(guò)分泌次生代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長(zhǎng)[10-12]。瓦雷茲芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)FZB42是一株具有高效生防性能的土壤細(xì)菌。瓦雷茲芽孢桿菌FZB42能夠產(chǎn)生多種抑菌化合物，包括聚酮類(lèi)化合物(bacillaene、difficidin、macrolactin)、脂肽類(lèi)化合物(bacillomycin D、fengycin、durfactin)及多肽類(lèi)化合物(plantazolicin、amylocyclicin)等?；蚪M測(cè)序結(jié)果分析顯示，F(xiàn)ZB42含有11個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇，能夠通過(guò)非核糖體途徑及核糖體途徑合成脂肽及聚酮類(lèi)抑菌活性物質(zhì)[13-15]。

本研究以松樹(shù)枯梢病的生物防治為切入點(diǎn)，證實(shí)瓦雷茲芽孢桿菌FZB42可在體外有效抑制松樹(shù)枯梢病原菌松杉球殼孢的生長(zhǎng)。為確定FZB42的抑菌活性物質(zhì)，以FZB42 Landy培養(yǎng)基發(fā)酵液為研究對(duì)象，利用硫酸銨沉淀法分離發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，F(xiàn)ZB42發(fā)酵液中抑制松杉球殼孢生長(zhǎng)的活性物質(zhì)為肽類(lèi)物質(zhì)。目前，F(xiàn)ZB42抑菌活性物質(zhì)的研究主要集中于脂肽化合物的抑菌活性及機(jī)理研究。Gu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZB42產(chǎn)生的bacillomycin D可引起禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁的形態(tài)學(xué)改變，誘導(dǎo)菌體孢內(nèi)活性氧累積，最終導(dǎo)致菌絲和孢子死亡，而脂肽類(lèi)化合物表面活性肽能夠破壞或者溶解細(xì)胞膜，從而抑制菌體生長(zhǎng)。然而，在本研究中，通過(guò)鹽析法從FZB42 Landy培養(yǎng)基發(fā)酵液中分離獲得粗提蛋白(分子質(zhì)量>10 ku)，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，證實(shí)該蛋白粗提物對(duì)松杉球殼孢具有良好的抑菌活性。在后續(xù)試驗(yàn)中，利用胃蛋白酶水解上述蛋白粗提物并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，其抑菌活性顯著下降，證實(shí)FZB42發(fā)酵液中抑制松杉球殼孢生長(zhǎng)的物質(zhì)確為蛋白質(zhì)或肽類(lèi)物質(zhì)，但其結(jié)構(gòu)及氨基酸組成需要通過(guò)構(gòu)建突變株，破壞FZB42的多肽類(lèi)次生代謝物plantazolicin、amylocyclicin等的合成途徑，來(lái)判斷探究對(duì)病原菌松杉球殼孢的抑制作用的貢獻(xiàn)者，進(jìn)一步研究。

生防菌的定殖能力是影響其生防作用發(fā)揮的關(guān)鍵因素，生防菌生物膜的形成能力與其定殖能力密切相關(guān)[16-18]。生物膜是指細(xì)菌通過(guò)分泌多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)以連結(jié)細(xì)菌群體而形成的具有黏附性有組織的膜狀結(jié)構(gòu)[19-21]。生物膜能將細(xì)胞與細(xì)胞緊密連結(jié)起來(lái)，提高彼此之間的基因轉(zhuǎn)移與交換頻率，從而增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)能力，增加種群多樣性。同時(shí)，生物膜也是影響細(xì)菌定殖能力的關(guān)鍵指標(biāo)。大量研究表明，細(xì)菌的生物膜形成能力與其在寄主植物上的聚集與附著密切相關(guān)，且生物膜的形成是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程。細(xì)菌在物體表面的初始黏附是影響生物膜形成的關(guān)鍵因素，且細(xì)菌本身的特性及及鞭毛等結(jié)構(gòu)均會(huì)影響菌體生物膜的形成。此外，在細(xì)菌生物膜的發(fā)育過(guò)程中，菌體的運(yùn)動(dòng)性也發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，瓦雷茲芽孢桿菌FZB42可在培養(yǎng)液的表面與培養(yǎng)板的壁上形成生物膜。運(yùn)動(dòng)性測(cè)定試驗(yàn)證明FZB42具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力，這與其生物膜的形成具有密切的關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究從松杉球殼孢的生物防治入手，探索瓦雷茲芽孢桿菌FZB42對(duì)松杉球殼孢的抑菌活性，得到如下結(jié)論：瓦雷茲芽孢桿菌FZB42在體外可顯著抑制松杉球殼孢生長(zhǎng)，其Landy培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)松杉球殼孢的抑菌率為96.1%。瓦雷茲芽孢桿菌FZB42 Landy培養(yǎng)基中的有效抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)，且其分子質(zhì)量大于10 ku瓦雷茲芽孢桿菌FZB42具有較強(qiáng)的生物膜形成能力及運(yùn)動(dòng)能力，具有良好的定殖潛力。