王紅玲 黃瑞芳 施士爭(zhēng)

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，南京，211153)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，來自工業(yè)、農(nóng)業(yè)及市政的污水排放量不斷增加，大量營(yíng)養(yǎng)元素被釋放到環(huán)境中。過量營(yíng)養(yǎng)元素，尤其是氮和磷，加速地表水體富營(yíng)養(yǎng)化過程，造成水環(huán)境污染，已成為全球最關(guān)注的水環(huán)境問題之一。近些年中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào)顯示，河湖富營(yíng)養(yǎng)化已成為我國(guó)水環(huán)境的普遍現(xiàn)象，七大水系總體為重度污染，且都存在銨態(tài)氮指標(biāo)過高的問題[1-2]。目前，控制水體富營(yíng)養(yǎng)化的研究快速發(fā)展，其中植物修復(fù)技術(shù)對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體的治理起到重要作用，一些具備生長(zhǎng)快速且有高效去除養(yǎng)分能力等特性的水生植物是研究的重點(diǎn)，其建設(shè)運(yùn)營(yíng)成本低，非常適合中國(guó)國(guó)情[3-4]。

楊樹(Populusspp.)是一種重要的造林樹種，其生長(zhǎng)快、應(yīng)用范圍廣，廣泛栽植于我國(guó)東北和西北部地區(qū)。由于楊樹生長(zhǎng)快，所需水分與養(yǎng)分較多，其根系深且龐大，可以持續(xù)不斷地從土壤中吸收水分與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等污染物，而且楊樹的根系活力高，可以蒸發(fā)大量水分并吸收土壤中的污染物，這些污染物被楊樹吸收凈化的同時(shí)，能夠促進(jìn)楊樹的生長(zhǎng)。因此，楊樹具備高生物量、高蒸發(fā)量和對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的高效吸收，被稱為富營(yíng)養(yǎng)化水體修復(fù)的有效植物材料[5-6]。此外楊樹具備遺傳多樣性、無性繁殖方便、基因組小、分子生物學(xué)手段可適性等特點(diǎn)，是林木研究的模式植物[7-8]。南林3412楊(Populusdeltiodescv.“3412”)是南京林業(yè)大學(xué)培育的“不飄絮”雄性速生美洲黑楊新品種，具有速生、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)勁等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前關(guān)于南林3412楊響應(yīng)銨態(tài)氮脅迫的機(jī)理研究還鮮有報(bào)道。

蛋白質(zhì)組學(xué)是一項(xiàng)系統(tǒng)分析生物體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)變化和規(guī)律的方法學(xué)[10]。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法主要包括雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)、同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)、雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)技術(shù)和同位素親和標(biāo)簽(ICAT)技術(shù)等[11-12]。近些年來，蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于研究鹽脅迫和銨態(tài)氮脅迫等逆境脅迫下植物的響應(yīng)機(jī)理[13]，包括水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、黃瓜(Cucumissativus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、紫花苜蓿(Medicagosativa)和番茄(Solanumlycopersicum)等[14-18]。Cheng et al.[15]利用蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定到18個(gè)水稻蛋白在鹽脅迫下差異表達(dá)，其中大多數(shù)為膜相關(guān)蛋白，參與膜穩(wěn)定、離子平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，并鑒定到一個(gè)富含亮氨酸的受體激酶(OsRPK1)是鹽脅迫響應(yīng)蛋白。Xun et al.[19]通過蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在銨態(tài)氮脅迫下，番茄體內(nèi)參與氨同化的蛋白表達(dá)量上調(diào)，細(xì)胞壁代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)量也發(fā)生了改變，導(dǎo)致番茄生長(zhǎng)受到抑制。上述這些研究說明蛋白質(zhì)組學(xué)可以解析植物在受到逆境脅迫后的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，進(jìn)而幫助深入了解植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的代謝和調(diào)控機(jī)理。

本研究通過iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理下的楊樹苗根系的整體蛋白質(zhì)表達(dá)變化進(jìn)行分析，并進(jìn)一步分析差異蛋白涉及的生物學(xué)功能，旨在深入揭示其響應(yīng)銨態(tài)氮脅迫的機(jī)理，為將來?xiàng)顦涞目鼓嬖耘嗉夹g(shù)及富營(yíng)養(yǎng)化水體修復(fù)的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本試驗(yàn)選取楊樹“南林3412楊”無菌苗，在江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院的溫室中進(jìn)行充氧水培，水培盒容積為10 L，初始水培溶液為1/8 Hogland營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度為(10～25)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間為06:00—18:00。水培20 d后，水培苗株高達(dá)15～20 cm，挑選其中生長(zhǎng)一致的水培苗開始脅迫處理。設(shè)置3種處理方式：低質(zhì)量濃度(2 mg/L NH4Cl溶液)銨態(tài)氮脅迫、高質(zhì)量濃度(20 mg/L NH4Cl溶液)銨態(tài)氮脅迫和對(duì)照(無銨態(tài)氮脅迫)，在3種處理中分別放入10株水培苗，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每周更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)5周后同時(shí)收割不同處理下的水培苗根部，液氮保存。

1.2 藥品與試劑

本試驗(yàn)用到的藥品和試劑為：3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、IPG Buffer、甲酸銨，均購(gòu)自GE公司；尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羧基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、三氯乙酸(TCA)、碳酸鈉、過硫酸銨(APS)、四甲基二乙胺(TEMED)，均購(gòu)自Amresco公司；甲酸(Formic acid)、碘乙酰胺(Iodacetamide,IAA)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)，均購(gòu)自Sigma公司；胰蛋白酶(Trypsin Gold)購(gòu)自Promega公司；乙腈(CAN)、色譜水等購(gòu)自Thermo Fish公司；iTRAQ 8 plex試劑盒(SCIEX)；Tris-HCl(pH=6.8、8.5、8.8)、考馬斯亮藍(lán)G-250、溴酚藍(lán)(Bromophenol blue)、丙酮、甲醇、乙醇、Bradford蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

本試驗(yàn)用到的主要儀器設(shè)備為：冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；分光光度儀(Evolution 200，賽默飛世爾科技)；超純水裝置(密理博公司)；真空冷凍干燥機(jī)(Thermo)；水浴鍋；天平；Eksigent nanoLC-UltraTM2D系統(tǒng)(SCIEX)；分析型液相色譜Agilent 1200(Agilent)；TripleTOF 5600系統(tǒng)(SCIEX)；Protein Pilot 5.0軟件(SCIEX)；渦旋振蕩器。

1.4 蛋白質(zhì)提取

將3種處理下取得的楊樹水培苗根系組織用超純水沖洗干凈、紙巾輕輕擦干，采用TCA-丙酮法提取蛋白，大致步驟如下：用液氮將樣品研磨成粉末，用充分預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)10% TCA-丙酮溶液(含0.1% DTT和1 mmol/L PMSF)溶解，-20 ℃沉淀過夜；離心(15 000 r/min，4 ℃，20 min)、棄上清；沉淀物用丙酮溶液(含0.1% DTT和1 mmol/L PMSF)溶解，-20 ℃靜置2 h后，離心(15 000 r/min，4 ℃，20 min)、棄上清，重復(fù)本步驟2次；沉淀物冷凍干燥成粉末后，用裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF、0.5%載體兩性電解質(zhì))充分溶解；離心(15 000 r/min，4 ℃，20 min)取上清(3次)。采用Bradford法蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

1.5 ITRAQ標(biāo)記試驗(yàn)

根據(jù)ITRAQ試劑盒配套說明書進(jìn)行標(biāo)記定量試驗(yàn)，大致步驟：8份(對(duì)照取2份、低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理各取3份)樣品均取100 μg蛋白，按試劑盒配套方法進(jìn)行蛋白質(zhì)還原、烷基化修飾，再按照m(酶)∶m(蛋白)=1∶40的比例向各份樣品中加入胰蛋白酶，37 ℃酶解過夜(14 h)，得到肽段后，進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物與肽段充分反應(yīng)(2 h)，再用超純水中止(0.5 h)。然后將所有標(biāo)記后的混合到一起，充分混勻后冷凍干燥成粉末，等待液相色譜—質(zhì)譜檢測(cè)平臺(tái)上機(jī)檢測(cè)。

1.6 高pH-RP液相分離

冷凍干燥后得到的標(biāo)記好的肽段混合物，用100 μL流動(dòng)相A(體積分?jǐn)?shù)2%乙腈，體積分?jǐn)?shù)98% H2O，pH10)復(fù)溶，混勻后，14 000 g離心20 min，取上清液，在Agilent 1200 HPLC上進(jìn)行高pH反相色譜分離，色譜柱主要參數(shù)：Poly-SEA 5 μ 300 ?(2.0×150.0)mm，檢測(cè)波長(zhǎng)：紫外215 nm和280 nm。流速0.6 mL/min，梯度為0～30 min，由5%的乙腈增至35%；30～32 min，由35%的乙腈增至95%；32～37 min，保持95%的乙腈不變；37～39 min，乙腈由95%降至5%；39～45 min，保持5%的乙腈。色譜分離樣品收集方法：0～5 min收集1管，6～44 min每4 min收集1管，45～50 min收集1管，共計(jì)12管樣品溶液，然后將所有溶液徹底冷凍干燥。

1.7 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用平臺(tái)檢測(cè)

用Nano-RPLC Buffer A重新溶解凍干的多肽樣品。溶解后的樣品以2 μL/min的流速上樣到Eksigent nanoLC-UltraTM2D系統(tǒng)(SCIEX)的C18預(yù)柱上(100 μmol/L×3 cm，C18，3 μmol/L，150 ?)，沖洗脫鹽10 min。分析柱采用C18反相色譜柱(75 μmol/L×15 cm，C18，3 μmol/L，120 ? ChromXP Eksigent)，梯度為70 min內(nèi)流動(dòng)相B由5%升高至35%。質(zhì)譜分析采用TripleTOF5600系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧III離子源，具體參數(shù)：掃描模式為信息依賴型、母離子掃描范圍為400～1 250 m/z、一級(jí)質(zhì)譜分辨率≥30 000、質(zhì)譜信號(hào)積累時(shí)間為250 ms、每個(gè)母離子最多觸發(fā)20個(gè)二級(jí)碎片離子掃描、二級(jí)碎片的前體離子積累時(shí)間≥100 ms、二級(jí)碎片離子分辨率≥15 000、動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為20 s。

1.8 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及蛋白鑒定

采用Protein Pilot Software v.5.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫(kù)來源于公共的Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。在錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(RFD)<1%的標(biāo)準(zhǔn)下共鑒定到2 961個(gè)蛋白。差異蛋白鑒定標(biāo)準(zhǔn)：未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)值(Unused)<1.3、肽段數(shù)(95%)≥1且差異倍數(shù)>1.3。

1.9 生物信息學(xué)

在得到差異蛋白之后，進(jìn)一步做了生物信息學(xué)分析，主要包括：GO功能分類和富集分析、KEGG途經(jīng)注釋和富集分析、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，用于挖掘差異蛋白的生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 銨態(tài)氮脅迫處理下差異蛋白的鑒定

基于質(zhì)譜鑒定一共獲得2 961個(gè)蛋白，按照差異倍數(shù)>1.30或者<0.77且P<0.05進(jìn)行篩選，共得到266個(gè)差異蛋白(圖1)。對(duì)獲得的差異蛋白進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理和對(duì)照相比有98個(gè)差異蛋白，包括62個(gè)上調(diào)和36個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白；高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理和對(duì)照相比有219個(gè)差異蛋白，包括139個(gè)上調(diào)和80個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白(圖1)。此外，有51個(gè)蛋白在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理的條件下都差異表達(dá)(表1)，而47個(gè)和168個(gè)蛋白只在低質(zhì)量濃度或高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理中差異表達(dá)。以上結(jié)果說明在銨態(tài)氮脅迫下，楊樹會(huì)誘導(dǎo)一些響應(yīng)蛋白表達(dá)量的上升或下降。

圖1 銨態(tài)氮脅迫下差異蛋白的分布

續(xù)(表1)

2.2 差異蛋白的GO富集分析

為了進(jìn)一步研究楊樹應(yīng)答銨態(tài)氮脅迫的機(jī)制，通過GO注釋和GO功能富集分析來解析差異蛋白的生物學(xué)功能。上述266個(gè)差異蛋白中有127個(gè)蛋白含有GO注釋信息，并依據(jù)GO功能分成以下3類：細(xì)胞組分、分子功能和生物過程(表2)。在細(xì)胞組分方面，差異蛋白主要富集在細(xì)胞、胞內(nèi)部分、細(xì)胞器、細(xì)胞膜等成分；在分子功能方面，主要有催化活性、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、結(jié)合等成分發(fā)生了顯著變化；生物過程方面發(fā)生顯著變化的成分為代謝過程、細(xì)胞過程、脅迫反應(yīng)、定位和生物過程調(diào)節(jié)(表2)。

2.3 差異蛋白的KEGG富集分析

通過KEGG途經(jīng)注釋和顯著性富集分析能夠確定差異蛋白參與的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究對(duì)不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫條件下鑒定到的差異蛋白進(jìn)行了KEGG途經(jīng)注釋，上述266個(gè)差異蛋白中的176個(gè)有KEGG注釋信息。進(jìn)一步進(jìn)行了KEGG富集分析，利用超幾何檢驗(yàn)方法p<0.05計(jì)算顯著性，發(fā)現(xiàn)富集主要與能量和碳水化合物相關(guān)，包括磷酸戊糖途徑、糖酵解、碳代謝、光合生物中的碳固定和氨基酸合成，另外還有一些和次生代謝相關(guān)，如苯丙素生物合成(圖2)。上述結(jié)果說明能量代謝、氨基酸代謝和次生代謝物質(zhì)合成等代謝途徑在楊樹響應(yīng)銨態(tài)氮脅迫的過程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。

2.4 細(xì)胞壁完整性的維持

作為應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫的第一道屏障，植物的細(xì)胞壁會(huì)快速響應(yīng)，調(diào)節(jié)自身的組成和結(jié)構(gòu)，從而應(yīng)對(duì)外界脅迫，因此植物細(xì)胞壁的完整性在應(yīng)對(duì)逆境脅迫的過程中扮演了重要的角色[20]。在本研究中，一共鑒定到11個(gè)細(xì)胞壁相關(guān)的蛋白在銨態(tài)氮脅迫下發(fā)生了顯著的差異表達(dá)(表3)。在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下，有5個(gè)差異蛋白參與了細(xì)胞壁的調(diào)節(jié)，其中2個(gè)果膠酶上調(diào)表達(dá)。在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下，有8個(gè)細(xì)胞壁相關(guān)的蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，其中大部分是上調(diào)表達(dá)，包括果膠酶、木質(zhì)素過氧化物酶和角質(zhì)酶。此外，也有纖維素和半纖維素酶在低質(zhì)量濃度或高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫條件下發(fā)生了下調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果表明，楊樹會(huì)通過細(xì)胞壁相關(guān)蛋白的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)來進(jìn)行細(xì)胞壁完整性的維持和調(diào)節(jié)，從而應(yīng)對(duì)外界的銨態(tài)氮脅迫。

表2 差異蛋白GO富集結(jié)果

圖2 差異蛋白KEGG富集結(jié)果

表3 差異蛋白主要參與的功能分類

2.5 碳和能量代謝的調(diào)節(jié)

在銨態(tài)氮脅迫下，植物體內(nèi)包括糖酵解、蔗糖代謝等在內(nèi)的多種碳和能量相關(guān)代謝會(huì)相應(yīng)地進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而有利于植物的持續(xù)生長(zhǎng)。本研究中鑒定到楊樹的8個(gè)差異蛋白參與了糖酵解代謝，其中7個(gè)蛋白在銨態(tài)氮脅迫下是上調(diào)表達(dá)，而且在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下上調(diào)表達(dá)的蛋白數(shù)量顯著多于低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下的蛋白(表3)，說明楊樹通過調(diào)節(jié)糖酵解代謝的活性來適應(yīng)銨態(tài)氮脅迫。此外，有12個(gè)差異蛋白參與了碳水化合物的代謝(表3)，其中只有2個(gè)蛋白在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下上調(diào)表達(dá)；而這12個(gè)蛋白在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下均發(fā)生了變化，且大多數(shù)都是上調(diào)表達(dá)，主要參與了蔗糖代謝、核苷酸糖代謝、淀粉代謝和氧化磷酸戊糖代謝，說明充足的能量是植物適應(yīng)銨態(tài)氮脅迫的條件之一。

2.6 抗氧化系統(tǒng)的激活

銨態(tài)氮脅迫通常會(huì)刺激植物體內(nèi)的活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而影響植物的生長(zhǎng)和生理過程，而植物為了適應(yīng)脅迫環(huán)境，減少活性氧對(duì)其的損傷，會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)的抗氧化系統(tǒng)來進(jìn)行抵御[21]。本研究鑒定到17個(gè)差異蛋白參與了活性氧的解毒系統(tǒng)，包括11個(gè)抗壞血酸過氧化物酶(APX)、3個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、2個(gè)壞血酸還原酶(MDHAR)和1個(gè)超氧化物歧化酶(SOD)(表3)。在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下，只有2個(gè)過氧物酶差異表達(dá)；但在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下，有11個(gè)過氧物酶差異表達(dá)，且其中9個(gè)都是上調(diào)表達(dá)。此外，3個(gè)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和1個(gè)超氧化物歧化酶在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫條件下均上調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果說明在銨態(tài)氮脅迫條件下，楊樹會(huì)大量誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)中相關(guān)酶類蛋白的上調(diào)表達(dá)，從而抵御活性氧的負(fù)面作用。

2.7 熱激蛋白的響應(yīng)

在逆境條件下，植物會(huì)通過熱激蛋白來減少脅迫對(duì)自身造成的傷害[22]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，楊樹有5個(gè)熱激蛋白在銨態(tài)氮脅迫下發(fā)生了差異表達(dá)，包括2個(gè)HSP60蛋白、2個(gè)HSP70蛋白和1個(gè)HSP100蛋白(表3)。其中只有1個(gè)HSP70蛋白在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫時(shí)上調(diào)表達(dá)，而另外4個(gè)熱激蛋白在低質(zhì)量濃度或高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮處理時(shí)下調(diào)表達(dá)。此外，低質(zhì)量濃度或高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下各有3個(gè)熱激蛋白差異表達(dá)，表明楊樹的熱激蛋白在銨態(tài)氮脅迫下能快速響應(yīng)，從而協(xié)助抵御銨態(tài)氮脅迫的副作用。

2.8 差異蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了了解差異蛋白的互作關(guān)系，將本研究鑒定到的266個(gè)差異蛋白通過String在線軟件(http://string-db.org)構(gòu)建蛋白質(zhì)互作的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置為高置性度(>0.9)，且隱藏沒有互作的蛋白，據(jù)此得到56個(gè)差異蛋白間存在互作關(guān)系(圖3)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與POPTR_0002s10420.1(葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶)互作的差異蛋白數(shù)量最多，有15個(gè)。此外，有16個(gè)蛋白與至少5個(gè)其它蛋白互作，有31個(gè)蛋白與至少2個(gè)其它蛋白互作，說明楊樹通過調(diào)控復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)來應(yīng)對(duì)銨態(tài)氮脅迫。

圖3 差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖

3 結(jié)論與論討

氨氮加富是導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要因素之一，而且還存在逐年加重的趨勢(shì)，是目前水污染防治的關(guān)鍵控制因子。能否有效地控制氨氮污染，已成為遏制水污染形勢(shì)加劇的關(guān)鍵所在。通過研究楊樹對(duì)銨態(tài)氮的去除效果，探索能否利用種植楊樹提升水體中銨態(tài)氮污染物的削弱效果，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。因此，監(jiān)測(cè)楊樹響應(yīng)銨態(tài)氮脅迫的動(dòng)態(tài)變化、研究楊樹對(duì)銨態(tài)氮的耐受機(jī)理顯得尤為重要。本研究利用iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了南林3412楊的根系蛋白質(zhì)在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下的表達(dá)變化，一共鑒定出266個(gè)差異蛋白，而且高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下的差異蛋白數(shù)量顯著多于低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下的差異蛋白數(shù)量，表明楊樹根系的差異蛋白數(shù)量與銨態(tài)氮脅迫的質(zhì)量濃度成正相關(guān)，高質(zhì)量濃度的銨態(tài)氮脅迫可能對(duì)楊樹根系整體蛋白質(zhì)的影響更大，且楊樹也會(huì)通過調(diào)節(jié)更多蛋白質(zhì)的表達(dá)變化來應(yīng)對(duì)銨態(tài)氮脅迫。在這些差異蛋白中，有51個(gè)蛋白在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下共同差異表達(dá)，而另外的47個(gè)和168個(gè)蛋白只在低質(zhì)量濃度或高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理中差異表達(dá)，表明在銨態(tài)氮脅迫下，楊樹根系有一些蛋白是受影響的核心途徑蛋白，但楊樹也會(huì)根據(jù)外界銨態(tài)氮脅迫的程度調(diào)節(jié)其他相關(guān)的蛋白來維持自身的正常生長(zhǎng)。

在銨態(tài)氮脅迫逆境的條件下，植物會(huì)造成體內(nèi)代謝失衡，導(dǎo)致生成過多的活性氧，而過量的活性氧會(huì)導(dǎo)致植物的氧化損傷，進(jìn)而影響植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量傳遞等一系列重要的生命過程[23]。為了對(duì)抗過量的活性氧，植物進(jìn)化出一套相應(yīng)的抗氧化系統(tǒng)，包括一系列的解毒活性氧的抗氧化酶[24]。本研究中鑒定到17個(gè)楊樹根系的抗氧化酶在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下發(fā)生了顯著的差異表達(dá)，而且絕大多數(shù)蛋白是在銨態(tài)氮脅迫處理后上調(diào)表達(dá)，說明楊樹會(huì)誘導(dǎo)包括抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、壞血酸還原酶(MDHAR)和超氧化物歧化酶(SOD)在內(nèi)的一系列抗氧化酶的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而用于清除過量的活性氧。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下上調(diào)表達(dá)的抗氧化酶數(shù)量要顯著多于低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下的蛋白數(shù)量，推測(cè)有可能是高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫產(chǎn)生更多的活性氧，導(dǎo)致楊樹需要誘導(dǎo)更多的抗氧化酶來應(yīng)對(duì)。

熱激蛋白是一類參與非生物脅迫下受損蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和降解的分子伴侶蛋白，已有多個(gè)植物的熱激蛋白報(bào)道參與了植物應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境的過程。Chen et al.[25]發(fā)現(xiàn)在外界脅迫條件下，水稻線粒體HSP70上調(diào)表達(dá)，它可能是細(xì)胞程序性死亡的調(diào)節(jié)蛋白。此外，葡萄樹和蕎麥HSP70和HSP90的轉(zhuǎn)錄水平在逆境脅迫下顯著差異表達(dá)，可能參與調(diào)控不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[26]。在本研究中，一共鑒定到5個(gè)熱激蛋白在低質(zhì)量濃度或高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下差異表達(dá)，它們包括HSP60、HSP70和HSP100，結(jié)合已有的研究報(bào)道，推測(cè)這些熱激蛋白也參與了楊樹應(yīng)對(duì)銨態(tài)氮脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

本研究基于iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)，分析了不同質(zhì)量濃度的銨態(tài)氮脅迫條件下楊樹根系的蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下的差異蛋白數(shù)量顯著多于低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫下的差異蛋白數(shù)量。這些差異蛋白主要富集在能量代謝、氨基酸代謝和次生代謝物質(zhì)合成等代謝途徑。此外，差異蛋白參與了細(xì)胞壁完整性的維持、碳和能量代謝的調(diào)節(jié)、抗氧化系統(tǒng)的激活和熱激蛋白的響應(yīng)等重要生命過程。上述這些結(jié)果為深入揭示楊樹根系響應(yīng)銨態(tài)氮脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。