孫穎 孟儒 苗林琦 高東菊 張鳳娥

( 東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)( 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

近年來土壤污染問題日益嚴(yán)重。自然界中的一些重金屬離子難以被微生物分解掉，存留下來會(huì)對植物生長造成嚴(yán)重危害。因此重金屬污染作為土壤污染中較為嚴(yán)重的問題備受人們關(guān)注。銅、鋅是植物體所必需的微量營養(yǎng)元素，廣泛參與植物體內(nèi)的多種生理生化代謝過程[1]，對植物發(fā)育和機(jī)體代謝有重要作用。但是，銅積累過量，植物體會(huì)產(chǎn)生大量的自由基和丙二醛，使離子平衡遭到破壞，引起生理反應(yīng)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致銅毒害[2]；鋅過量則會(huì)抑制光合作用，造成植物缺鐵性失綠等問題，影響植物正常的生長發(fā)育[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年釋放到環(huán)境中的銅、鋅高達(dá)14.7、27.6萬t[4]，如果形成更復(fù)雜的重金屬復(fù)合污染，通過相加、拮抗、協(xié)同、獨(dú)立作用等[5]，會(huì)大大增加重金屬污染的治理難度，嚴(yán)重影響人們正常的生產(chǎn)生活以及生態(tài)環(huán)境質(zhì)量。

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物對外界環(huán)境適應(yīng)的開始，該時(shí)期也是植物對外界環(huán)境條件反應(yīng)最敏感的時(shí)期。研究重金屬污染對萌發(fā)期種子的影響可以篩選重金屬超富集植物，監(jiān)測土壤環(huán)境污染情況，為重金屬污染的環(huán)境治理構(gòu)建植物資源庫[6-8]。木槿(HibiscussyriacusL.)是錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)的落葉灌木，夏秋開花，朝開暮謝，花大，有淡紫、紅、白等多種顏色，單瓣或重瓣等品種，適宜庭園觀賞[9]。木槿對土壤的要求不高，較耐貧瘠及干旱，對SO2和氯化物等有害氣體有極強(qiáng)抗性。木槿還有很強(qiáng)的滯塵能力，是治理污染環(huán)境的優(yōu)選綠化樹種。目前有關(guān)木槿的研究主要集中在栽培技術(shù)[10-11]、親緣關(guān)系[12]、物質(zhì)合成[13]等方面，關(guān)于其抗重金屬污染能力方面的報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)。本研究旨在通過研究銅單一脅迫、鋅單一脅迫、銅鋅復(fù)合脅迫在木槿種子發(fā)育階段對其發(fā)芽指標(biāo)、生長指標(biāo)、生理指標(biāo)的影響，探討木槿種子對3種脅迫的適應(yīng)能力及范圍，為重金屬污染土壤修復(fù)的植物篩選和擴(kuò)大木槿的園林綠化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成熟的木槿種子于2019年10月采于上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)。挑選長勢一致、種粒飽滿、無病蟲害的種子取出后晾干。試驗(yàn)前先將種子用去離子水浸泡24 h，后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%高錳酸鉀溶液浸泡1 h，最后用去離子水沖洗5次，用于脅迫試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

Cu2+溶液以分析純的CuSO4·5H2O配制，Zn2+溶液以分析純的ZnSO4·7H2O配制。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)設(shè)置Cu2+單一脅迫(50、100、150、200、250、300 mg·L-1)、Zn2+單一脅迫(50、100、150、200、250、300 mg·L-1)、，Cu2+/Zn2+復(fù)合脅迫(50/50、100/100、150/150、200/200、250/250、300/300 mg·L-1)3組處理，以等量的去離子水處理作為對照(CK，表1)。采用紙上發(fā)芽法進(jìn)行種子萌發(fā)脅迫試驗(yàn)。分別向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入等量的不同質(zhì)量濃度處理液將濾紙浸至飽和，除處理液不同外其他因素保持一致。培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，空氣相對濕度75%，光照14 h·d-1、光強(qiáng)6 000 lx。萌發(fā)培養(yǎng)期間根據(jù)實(shí)際情況增加相應(yīng)的處理液，使濾紙始終保持濕潤狀態(tài)。每日定時(shí)觀察種子的萌發(fā)情況。每個(gè)處理30粒種子，3個(gè)重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 發(fā)芽指標(biāo)的測定

以種子胚根露白作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組種子的發(fā)芽指標(biāo)[14]。

發(fā)芽率=(發(fā)芽試驗(yàn)終期(8 d)正常發(fā)芽種子粒數(shù)/試驗(yàn)種子總粒數(shù))×100%；

發(fā)芽勢=(發(fā)芽試驗(yàn)初期(5 d內(nèi))正常發(fā)芽種子粒數(shù)/試驗(yàn)種子總粒數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(Gi)=∑Gt/Dt。

式中：Dt為發(fā)芽時(shí)間；Gt為與Dt相對應(yīng)的每天的發(fā)芽種子數(shù)。

相對發(fā)芽率=(處理種子發(fā)芽率/對照種子發(fā)芽率)×100%。

種子耐重金屬脅迫的半致死質(zhì)量濃度為種子發(fā)芽率達(dá)到相對發(fā)芽率的50%時(shí)重金屬溶液質(zhì)量濃度；種子耐重金屬脅迫的極限質(zhì)量濃度為種子發(fā)芽率達(dá)到相對發(fā)芽率的10%時(shí)重金屬溶液質(zhì)量濃度。

表1 銅、鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 形態(tài)指標(biāo)的測定

發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，依次在已經(jīng)發(fā)芽的各處理中隨機(jī)選取10株幼苗，用游標(biāo)卡尺測量幼苗的胚根長度。

1.3.3 生理指標(biāo)的測定

取0.2 g幼苗，放置于5 mL的離心管后在球磨機(jī)內(nèi)研磨成勻漿，加入4 mL的0.05 mol·L-1(pH=7.8)磷酸緩沖液于離心管中，于4 ℃下10 000 r·min-1冷凍離心20 min，取上清液立即放入4 ℃冰箱儲(chǔ)存待測。丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性的測量參考王學(xué)奎[15]的測量方法。

1.3.4 耐銅鋅能力評價(jià)

采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)值的方法進(jìn)行抗逆性綜合評定[16]。

R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。

式中：Xij為第j個(gè)材料第i項(xiàng)綜合指標(biāo)的值；Xjmax為各處理的最大測定值；Xjmin為各處理的最小測定值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，SPSS 22.0檢驗(yàn)樣本間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅鋅單一及復(fù)合脅迫對木槿種子發(fā)芽能力的影響

由表2可知，隨著銅、鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫質(zhì)量濃度的提高，木槿種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，在質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，3種脅迫處理的發(fā)芽率均顯著高于CK(P<0.05)，表明低質(zhì)量濃度的銅、鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫在一定程度上促進(jìn)了木槿種子的萌發(fā)。在質(zhì)量濃度不低于100 mg·L-1的銅、鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫時(shí)，木槿種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)不同程度的下降。銅單一脅迫質(zhì)量濃度為100、150、200、250、300 mg·L-1時(shí)，木槿種子發(fā)芽率分別降低了25.59%、48.83%、90.69%、97.67%、100.00%；鋅單一脅迫質(zhì)量濃度為100、150、200、250、300 mg·L-1時(shí)，木槿種子發(fā)芽率分別降低了30.24%、41.09%、58.14%、84.50%、98.45%；銅鋅復(fù)合脅迫質(zhì)量濃度為100/100、150/150、200/200、250/250、300/300 mg·L-1時(shí)，木槿種子發(fā)芽率分別降低了27.17%、50.40%、78.29%、90.69%、98.45%。綜合比較，在質(zhì)量濃度為250 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，木槿種子發(fā)芽率極低；在質(zhì)量濃度為300 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，木槿種子發(fā)芽率幾乎為0。

表2 銅、鋅單一及復(fù)合脅迫下木槿種子的萌發(fā)情況

木槿種子發(fā)芽勢的變化趨勢和發(fā)芽率基本一致，即隨著脅迫質(zhì)量濃度的升高先升后降(表2)。在質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，木槿種子的發(fā)芽勢均高于CK，其中銅單一脅迫時(shí)發(fā)芽勢最高，為70.00%，銅鋅復(fù)合脅迫時(shí)發(fā)芽勢最低，為65.33%。在質(zhì)量濃度高于50 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，隨著溶液質(zhì)量濃度的提高，發(fā)芽勢依次下降。在質(zhì)量濃度為200 mg·L-1的銅單一脅迫時(shí)，發(fā)芽勢降低至5.00%，在質(zhì)量濃度為250 mg·L-1的鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫時(shí)，發(fā)芽勢分別降至6.67%、1.11%。在質(zhì)量濃度為300 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，發(fā)芽勢均為0。

在質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，3種脅迫對木槿種子的發(fā)芽指數(shù)均具有一定的促進(jìn)作用。隨著處理液質(zhì)量濃度的提高，3種脅迫下的發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(表2)。

由表3可知，3種脅迫的處理液質(zhì)量濃度與木槿種子相對發(fā)芽率之間呈顯著負(fù)相關(guān)。根據(jù)回歸方程預(yù)測，銅單一脅迫時(shí)的半致死質(zhì)量濃度、極限質(zhì)量濃度最低，分別為159.88、242.13 mg·L-1；鋅單一脅迫時(shí)的半致死質(zhì)量濃度、極限質(zhì)量濃度最高，分別為174.69、270.57 mg·L-1；銅鋅復(fù)合脅迫時(shí)的半致死質(zhì)量濃度、極限質(zhì)量濃度居于兩者之間。

表3 Cu2+、Zn2+質(zhì)量濃度與木槿種子相對萌發(fā)率的相關(guān)性

2.2 銅鋅單一及復(fù)合脅迫對木槿種子胚根的影響

由表4可知，銅、鋅單一及復(fù)合脅迫對木槿種子的胚根生長具有抑制作用。脅迫處理液質(zhì)量濃度越高，對胚根的抑制作用越強(qiáng)。其中，在質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的銅單一脅迫時(shí)，該脅迫顯著抑制了木槿胚根的生長；在質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫時(shí)，這2種脅迫才對木槿胚根的生長產(chǎn)生顯著的抑制作用。在質(zhì)量濃度為100、150、200 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，各處理組間的胚根長度均呈顯著差異(P<0.05)。在質(zhì)量濃度為250、300 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，胚根生長受到極其嚴(yán)重的抑制。

2.3 銅鋅單一及復(fù)合脅迫對木槿幼苗MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

如表5所示，隨著3種脅迫質(zhì)量濃度的提高，木槿幼苗的MDA質(zhì)量摩爾濃度呈逐漸上升的趨勢。在質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，MDA質(zhì)量摩爾濃度與CK之間無顯著差異(P>0.05)；在質(zhì)量濃度為50～250 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，各處理組間MDA質(zhì)量摩爾濃度均呈顯著差異(P<0.05)。在質(zhì)量濃度為300 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，MDA質(zhì)量摩爾濃度分別是CK的2.95、2.75、2.83倍?？傮w來看，在相同質(zhì)量濃度脅迫條件下，銅單一脅迫對木槿幼苗MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響大于鋅單一脅迫。

表4 不同脅迫處理對木槿種子胚根的影響

表5 不同脅迫處理對木槿幼苗MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

2.4 銅鋅單一及復(fù)合脅迫對木槿幼苗POD、SOD活性的影響

由表6可知，木槿幼苗的POD活性隨著脅迫質(zhì)量濃度的提高呈先升后降的趨勢。銅單一脅迫條件下，處理液質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)POD活性達(dá)到最大值，是CK的1.24倍，與CK間差異顯著(P<0.05)；鋅單一脅迫時(shí)POD活性較銅單一脅迫時(shí)變化幅度小，其在處理液質(zhì)量濃度為150 mg·L-1時(shí)POD活性達(dá)到最大值，是CK的1.19倍；銅鋅復(fù)合脅迫下POD活性的變化趨勢與銅單一脅迫類似，POD活性的高峰值也出現(xiàn)在處理液質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，此時(shí)POD活性是CK的1.23倍。在處理液質(zhì)量濃度為100～150 mg·L-1時(shí)，3種脅迫下木槿幼苗出現(xiàn)POD活性高峰值，之后POD活性顯著下降；在處理液質(zhì)量濃度為300 mg·L-1時(shí)，銅、鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫時(shí)的POD活性分別為CK的0.71、0.77、0.73倍。

表6 不同脅迫處理對木槿幼苗POD活性的影響

木槿幼苗的SOD活性隨3種脅迫處理質(zhì)量濃度的升高亦呈先升后降的趨勢(表7)。銅、鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫的SOD活性高峰值分別出現(xiàn)在處理液質(zhì)量濃度為100、50、100 mg·L-1時(shí)。除銅單一脅迫外，另2種脅迫的高峰值與CK相比差異不顯著。SOD活性在小幅度上升后逐漸下降，在處理液質(zhì)量濃度為200 mg·L-1時(shí)SOD活性降低十分顯著，至處理液質(zhì)量濃度為300 mg·L-1時(shí)，銅、鋅單一脅迫及銅鋅復(fù)合脅迫的SOD活性僅為CK的0.81、0.88、0.85倍。

2.5 銅鋅單一及復(fù)合脅迫下木槿種子萌發(fā)和幼苗生長的抗逆性綜合評定

如表8、表9、表10所示，3種脅迫處理下木槿測定指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值從大到小依次為：Zn2+單一脅迫、Cu2++Zn2+復(fù)合脅迫、Cu2+單一脅迫，表明木槿種子在萌發(fā)時(shí)期耐重金屬脅迫的能力由大到小依次為耐鋅單一脅迫、耐銅鋅復(fù)合脅迫、耐銅單一脅迫。

表7 不同脅迫處理對木槿幼苗SOD活性的影響

表8 不同銅單一脅迫下木槿測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

表9 不同鋅單一脅迫下木槿測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

表10 不同銅鋅復(fù)合脅迫下木槿測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

3 討論

種子萌發(fā)是植物體生長發(fā)育的初始階段，所以種子萌發(fā)的情況直接影響植物后期的生長發(fā)育狀況。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著銅、鋅單一脅迫及銅鋅復(fù)合脅迫質(zhì)量濃度的升高，木槿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均呈先升高后降低的趨勢，說明低質(zhì)量濃度的3種脅迫方式均刺激了木槿種子自身的抗逆性反應(yīng)，在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)發(fā)芽率、發(fā)芽勢短暫升高的現(xiàn)象。高質(zhì)量濃度的重金屬銅離子、鋅離子脅迫時(shí)，植物為了在脅迫條件下維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，必將消耗植物體的有效能量，從而使植物的生長發(fā)育受阻[17]，這與很多研究的結(jié)果一致[18-20]。在質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的銅、鋅單一及復(fù)合脅迫時(shí)，木槿種子發(fā)芽率均呈現(xiàn)顯著下降，說明此質(zhì)量濃度已經(jīng)開始破壞種子的自我防御機(jī)制。處理液質(zhì)量濃度為200 mg·L-1時(shí)，鋅單一脅迫時(shí)仍有30.00%的發(fā)芽率，此時(shí)銅單一脅迫、銅鋅復(fù)合脅迫時(shí)的發(fā)芽率僅為6.67%、15.56%。

種子萌發(fā)后，根最先突破種皮吸水，從而使根尖的重金屬積累量較多，受脅迫時(shí)間較長。因此，重金屬對植物根的抑制作用更顯著[21-23]。從3種脅迫處理后木槿種子胚根生長的情況來看，低質(zhì)量濃度(50 mg·L-1)的銅、鋅單一及銅鋅復(fù)合脅迫處理時(shí)即開始出現(xiàn)抑制胚根生長的現(xiàn)象，至處理液質(zhì)量濃度為300 mg·L-1時(shí)，種子幾乎完全致死，此時(shí)對胚根的抑制作用強(qiáng)烈，僅有的露白種子胚根也不再伸長，呈壞死狀態(tài)。結(jié)合發(fā)芽率分析，雖然低質(zhì)量濃度脅迫時(shí)木槿種子發(fā)芽率提高，但裸露的胚根對3種重金屬脅迫反應(yīng)更為敏感，因此在低質(zhì)量濃度脅迫時(shí)即出現(xiàn)抑制胚根生長的現(xiàn)象。

植物體內(nèi)抗氧化酶的活性及其正常的理化性質(zhì)會(huì)在植物遭受逆境脅迫時(shí)發(fā)生一系列改變。活性氧水平的上升會(huì)產(chǎn)生大量的丙二醛，造成膜脂過氧化，從而阻礙植物正常生長[24]。本研究中，木槿幼苗的MDA質(zhì)量摩爾濃度在處理液質(zhì)量濃度為50 mg·L-1時(shí)雖有小幅度的升高，但與CK差異不顯著，說明此時(shí)的細(xì)胞膜處于較穩(wěn)定狀態(tài)；當(dāng)處理液質(zhì)量濃度超過100 mg·L-1時(shí)，MDA質(zhì)量摩爾濃度開始大幅上升，說明細(xì)胞代謝逐漸紊亂。SOD和POD是防止植物細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇的重要的抗氧化酶[25]，木槿幼苗的POD和SOD活性變化情況均呈現(xiàn)“低升高降”趨勢，說明低質(zhì)量濃度脅迫時(shí)木槿幼苗體內(nèi)的POD和SOD活性發(fā)生了應(yīng)急性地提高，以幫助幼苗清除自由氧，穩(wěn)定細(xì)胞的防御系統(tǒng)。但當(dāng)處理液質(zhì)量濃度超過150 mg·L-1時(shí)，高質(zhì)量濃度的重金屬離子明顯抑制了抗氧化酶的活性，超過了保護(hù)酶的清除范圍，植物防御機(jī)制遭到嚴(yán)重破壞，因此二者活性急劇下降，造成一系列幼苗生長發(fā)育受阻的現(xiàn)象。

通過對3種重金屬脅迫下3項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)、1項(xiàng)生長指標(biāo)、3項(xiàng)生理指標(biāo)參數(shù)的隸屬函數(shù)綜合分析，得出木槿種子萌發(fā)和生長階段對3種重金屬脅迫的耐受能力強(qiáng)弱依次為：鋅單一脅迫、銅鋅復(fù)合脅迫、銅單一脅迫。本試驗(yàn)僅探討了銅單一脅迫、鋅單一脅迫、銅鋅復(fù)合脅迫對木槿種子的萌發(fā)特性、幼苗生長、抗氧化特征的影響，對于木槿在3種重金屬污染土壤中的生長情況、成年植株地上、地下部分產(chǎn)量、植物的富集轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律及分子水平上的影響還需進(jìn)一步細(xì)致、定量地探究。