李波 張偉溪 丁密 余金金 丁昌俊 黃秦軍

(國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)，北京，100091)

蒙古櫟(Quercusmongolica)是殼斗科(Fagaceae)櫟屬樹種，極為耐寒，耐旱[1-3]。主要分布于我國(guó)東北地區(qū)、內(nèi)蒙古東部、北京、河北等地[4]，朝鮮半島、俄羅斯遠(yuǎn)東、蒙古及日本北海道等地亦有分布。蒙古櫟是我國(guó)主要用材樹種之一，且具有良好的生態(tài)利用價(jià)值[5]。蒙古櫟研究?jī)r(jià)值較高，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹種。近年來(lái)其空間分布格局、群落結(jié)構(gòu)特征、生長(zhǎng)形態(tài)特征等研究較多[6-9]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基于分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蒙古櫟遺傳多樣性的研究不斷深入，如張杰等[10]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)蒙古櫟多種群遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期為蒙古櫟早期選擇提供合理依據(jù)；有學(xué)者通過(guò)采用SSR標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)中國(guó)東北長(zhǎng)白山附近的遼東櫟種群是蒙古櫟的基因滲入的結(jié)果，證明了遼東櫟和蒙古櫟在該地區(qū)是有一定的歷史聯(lián)系[11]；有學(xué)者[12]利用SNP技術(shù)對(duì)蒙古櫟的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳距離和空間距離之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。

高通量測(cè)序技術(shù)的飛速進(jìn)步，由1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)的DNA序列的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)得到了廣泛的挖掘和開發(fā)。不同物種的EST序列和基因組等數(shù)據(jù)的飛速增加，使開發(fā)SSR引物的來(lái)源更加豐富。如貫春雨等[13]通過(guò)NCBI庫(kù)下載落葉松屬、黃杉屬、冷杉屬和松屬合計(jì)共EST序列40 608條，設(shè)計(jì)EST-SSR引物132對(duì)；楊青松和趙艷[14]基于川滇高山櫟(Quercusaquifolioides)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其SSR位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，SSR類型主要為單核苷酸重復(fù)；石曉蒙等[15]通過(guò)利用櫟屬62對(duì)SSR引物，對(duì)栓皮櫟(Quercuspetraea)的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中17對(duì)引物具有高多態(tài)性；孫靜靜[16]利用遼東櫟(Quercuswutaishansea)和蒙古櫟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)出92對(duì)引物，其中77對(duì)能在櫟屬槲櫟組(Quercusaliena)中成功擴(kuò)增；Ueno et al.[17]以蒙古櫟內(nèi)側(cè)樹皮為試驗(yàn)材料，構(gòu)建了cDNA庫(kù)，發(fā)現(xiàn)274個(gè)SSR位點(diǎn)。而通過(guò)蒙古櫟EST數(shù)據(jù)庫(kù)中開發(fā)SSR并對(duì)群體遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)下載蒙古櫟EST序列及其葉綠體基因組，對(duì)其進(jìn)行處理后查找SSR位點(diǎn)信息并進(jìn)行特征分析，設(shè)計(jì)SSR引物后進(jìn)行有效篩選，并對(duì)不同種源蒙古櫟群體進(jìn)行遺傳變異分析，以期為蒙古櫟遺傳多樣性研究提供有效的分子標(biāo)記技術(shù)支持。

1 研究區(qū)概況

2018年收集8個(gè)不同種源的蒙古櫟種子，種植于遼寧省楊樹研究所苗圃地，2020年9月進(jìn)行取樣?；厩闆r見(jiàn)表1。

表1 研究樣地基本概況

2 研究方法

2.1 DNA的提取

每個(gè)種源至少10株，選擇其新鮮、完整、無(wú)病害的葉片，采用TaKaRa公司DNA提取試劑盒提取蒙古櫟基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，提取基因組DNA于-20 ℃保存，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

2.2 EST序列的獲得及處理

在NCBI下載蒙古櫟EST序列和蒙古櫟葉綠體基因組(NC_043858.1)(截至至2019年8月27日)。利用perl腳本est-trimmer，僅用于去除EST序列中過(guò)短的序列(<100 bp)以及mRNA的“帽子”和“尾巴”(A或T)。下載CAP3對(duì)est-trimmer處理后的序列進(jìn)行聚類和拼接，以獲得無(wú)冗余和盡可能長(zhǎng)的重疊序列。CAP3的參數(shù)取默認(rèn)值，其中，折疊一致百分比域值N>80，重疊長(zhǎng)度域值N>40。

2.3 SSR位點(diǎn)的查找

利用perl腳本misa程序(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)對(duì)CAP3拼接后的序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索。SSR位點(diǎn)重復(fù)單元為單核苷酸、雙核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸，搜索標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)應(yīng)為，單核苷酸重復(fù)數(shù)至少為10；雙核苷酸重復(fù)數(shù)至少為6；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸為重復(fù)單位時(shí)，重復(fù)數(shù)均至少為5；以及中間間隔不超過(guò)100 bp的復(fù)合型SSR。

2.4 SSR引物的設(shè)計(jì)及篩選

基于Linux(版本bio-linux)Primer3批量設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)為:SSR位點(diǎn)上下游100 bp之內(nèi)；引物長(zhǎng)度18～23 bp，20 bp最佳；GC所占比例40%～60%;擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段為100～300 bp，上下游引物解鏈溫度Tm值差異不超過(guò)5 ℃。用Electronic PCR去除有多處比較的引物,保證引物擴(kuò)增的特異性。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DNA30～50 ng、正反引物各1.0、9.5 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 5 s；95 ℃變性30 s，最佳退火溫度45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 SSR遺傳多樣性

基于選擇的引物進(jìn)行合成，在樣品上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。將所有樣品Index PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，并經(jīng)割膠回收獲得最終的FastTargetTM測(cè)序文庫(kù)，文庫(kù)的片段長(zhǎng)度分布經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer驗(yàn)證。文庫(kù)摩爾濃度精確定量后，最終于Illumina Hiseq平臺(tái)，以(2×150)bp與(2×250)bp的雙端測(cè)序模式進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得Fast Q數(shù)據(jù)。通過(guò)比對(duì)讀取片段和序列數(shù)據(jù)計(jì)算SSR等位基因的數(shù)量。兩步校正后列出了SSR基因序列和重復(fù)數(shù)，包括滑移調(diào)整和擴(kuò)增效率調(diào)整。利用軟件GenALEX6.501計(jì)算等位基因數(shù)、期望雜合度、多態(tài)性信息含量等指標(biāo)，采用MEGA version5.0進(jìn)行群體間UPGMA聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 蒙古櫟EST-SSR分布特點(diǎn)

下載的蒙古櫟3 385條EST序列，共1 855 072 bp，平均長(zhǎng)度548.03 bp，平均GC含量45.90%。其經(jīng)est-trimmer和CAP3處理后得到418條無(wú)冗余EST序列，全長(zhǎng)309 802 bp。共檢索出含有SSR位點(diǎn)的序列132條，SSR位點(diǎn)總數(shù)為163個(gè)；僅含有1個(gè)SSR位點(diǎn)的有103條，占78.03%；而含有1個(gè)以上SSR位點(diǎn)有29條序列，占21.97%。這些序列中含有18個(gè)重疊復(fù)合型SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)的11.04%。

3.2 蒙古櫟EST-SSR的類型和頻率

蒙古櫟EST序列中發(fā)現(xiàn)的SSR位點(diǎn)共有5種類型，如表2。其中處理后的EST序列未查找到五核苷酸類型的SSR位點(diǎn)。SSR位點(diǎn)的數(shù)量隨著核苷酸的數(shù)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)重復(fù)類型為二核苷酸的時(shí)候，SSR位點(diǎn)有80個(gè)，達(dá)到總SSR位點(diǎn)數(shù)的49.08%。而出現(xiàn)頻率最低的五核苷酸數(shù)量為0，其次就是六核苷酸僅占比0.61%。

表2 不同SSR重復(fù)類型的數(shù)量

在蒙古櫟的EST序列中，共發(fā)現(xiàn)19種SSR重復(fù)類型。單核苷酸僅有A與T一種，共有32個(gè)，占總SSR重復(fù)類型的19.632%。二核苷酸有4種類型，分別是AC與GT、AG與CT、AT與AT、CG與CG，其中AG與CT類型在整個(gè)SSR類型中出現(xiàn)頻率最多，數(shù)量為72個(gè)，占比為44.172%。三核苷酸有10種類型，主要是AAC與GTT、AAG與CTT、ACC與GGT、AGG與CCT這4種，而其它6種類型，合計(jì)15個(gè)，僅占9.201%。四核苷酸僅出現(xiàn)3種類型，AAAC與GTTT、AAAG與CTTT及ATCC與ATGG各出現(xiàn)2次，均占總SSR重復(fù)類型的1.227%。六核苷酸AAGCAG與CTGCTT僅出現(xiàn)1次，占總SSR重復(fù)類型的0.613%(表3)。

表3 主要SSR重復(fù)類型的比例

3.3 葉綠體基因組的SSR特點(diǎn)

下載的蒙古櫟葉綠體全基因組共161 194 bp，MISA位點(diǎn)查找SSR位點(diǎn)88個(gè)，平均1831.75出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。88個(gè)位點(diǎn)中含有9個(gè)重疊復(fù)合型SSR位點(diǎn)，占10.230%。葉綠體基因組中SSR類型較為單一，僅有單核苷酸、二核苷酸及三核苷酸。而重復(fù)類型為單核苷酸，SSR位點(diǎn)有82個(gè)，達(dá)到葉綠體基因組總SSR位點(diǎn)數(shù)93.18%。二核苷酸重復(fù)類型有5個(gè)，三核苷酸所占比例極低，僅出現(xiàn)1個(gè)，占比1.136%。

從葉綠體基因組SSR的重復(fù)次數(shù)來(lái)看，重復(fù)10次和11次數(shù)量最多，分別為44個(gè)和20個(gè)；最多重復(fù)次數(shù)為15次，共2個(gè)。根據(jù)MISA查找發(fā)現(xiàn)共有4種SSR重復(fù)類型。單核苷酸A與T出現(xiàn)頻率最高，達(dá)81次，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的92.045%；而單核苷酸C與G僅在重復(fù)次數(shù)為11次時(shí)，出現(xiàn)1個(gè)。二核苷酸中出現(xiàn)類型為AT與AT，在重復(fù)次數(shù)為5、6、7，分別為2個(gè)、2個(gè)、1個(gè)。三核苷酸AAT與ATT出現(xiàn)頻率極低，僅在重復(fù)6次時(shí)，出現(xiàn)1個(gè)(圖1)。

圖1 蒙古櫟葉綠體SSR的基序類型數(shù)量分布

3.4 蒙古櫟SSR引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

基于perl腳本，整合了MISA(查找SSR位點(diǎn))、Primer3.0(批量設(shè)計(jì)引物)和Electronic PCR進(jìn)行批量SSR引物設(shè)篩選計(jì)，利用EST序列共設(shè)計(jì)篩選出引物63對(duì)，占總的已鑒定出SSR位點(diǎn)的38.65%；葉綠體全基因組設(shè)計(jì)篩選30對(duì)引物，占總?cè)~綠體鑒定出SSR位點(diǎn)的34.09%(表4)。

對(duì)已設(shè)計(jì)出的引物，進(jìn)行合成，并在來(lái)自不同種源的蒙古櫟種源進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于EST序列設(shè)計(jì)的SSR引物在8份來(lái)源不同的DNA上均能擴(kuò)增出單一條帶且擴(kuò)增效果好，共12對(duì)，而擴(kuò)增出至少6個(gè)清晰條帶的共有33對(duì)(如圖2)。基于葉綠體全基因組設(shè)計(jì)的SSR引物均能擴(kuò)增出條帶且擴(kuò)增清晰單一，共有13對(duì)引物，而能在8個(gè)種源DNA中擴(kuò)增出至少6個(gè)清晰條帶的有19對(duì)。部分引物瓊脂糖凝膠電泳圖如。

3.5 驗(yàn)證蒙古櫟SSR多態(tài)性檢測(cè)

基于上述篩選的結(jié)果合成6對(duì)引物，從前人對(duì)蒙古櫟SSR遺傳多樣性研究中挑選一對(duì)引物[18]進(jìn)行合成。對(duì)8個(gè)種源群體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用以檢測(cè)這8個(gè)種源群體的遺傳多樣性以及引物多態(tài)性，引物信息見(jiàn)表4。哈溫平衡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)7個(gè)位點(diǎn)在8個(gè)種源蒙古櫟群體上均未偏離平衡(表5)。7對(duì)SSR引物在8個(gè)種源的蒙古櫟群體中共檢測(cè)到37對(duì)等位基因，這些位點(diǎn)的觀測(cè)等位基因數(shù)目為2.5(SH-21)～7.625(Qden05011)，平均每個(gè)位點(diǎn)有5.286個(gè)等位基因(Na)。有效等位基因(Ne)的變化范圍為1.637(SA-23)～5.118(SA-43)，平均有效等位基因數(shù)為3.643。從Shannon多樣性指數(shù)看，SH-21的值最小(I=0.64)，Qden05011的值最大(I=1.801)，平均Shannon多樣性指數(shù)為1.291。觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的變化范圍分別為0.315(SH-21)～0.847(SA-39)、0.381(SA-23)～0.799(Qden05011)，均值分別為0.605和0.622。多態(tài)性信息含量的變化范圍為0.371(SA-23)～0.893(SA-49)，均值為0.692，從多態(tài)性看，SA-39、SA-43、SA-49與Qden05011的多態(tài)性水平相差不大。

表4 多態(tài)性SSR引物信息

引物SA47、SA48、SA49分別對(duì)應(yīng)1～8、9～16、17～24。

引物SC24、SC25、SC26分別對(duì)應(yīng)1～8、9～16、17～24。

表5 7個(gè)SSR位點(diǎn)在蒙古櫟群體中的遺傳多樣性參數(shù)

8個(gè)種源蒙古櫟群體水平的遺傳多樣性見(jiàn)表6。不同種源群體的觀測(cè)等位基因(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍分別為4.571(M2和M66)～6(M63)、2.976(M67)～4.373(M63)，平均值分別為5.286和3.643。Shannon多樣性指數(shù)的均值為1.291，其中M2的值最小(I=1.107)，M68的值最大(I=1.495)。觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的變化范圍為0.546(M63)～0.698(M68)、0.538(M2)～0.71(M68)，無(wú)偏期望雜合度(UHe)的均值為0.66，其變化范圍為0.57(M2)～0.752(M68)。M66的固定指數(shù)(F)最大，為0.167，且其期望雜合度高于觀測(cè)雜合度，說(shuō)明種源M66存在遺傳缺失現(xiàn)象。M11的固定指數(shù)最小，僅為-0.101，而它的期望雜合度低于觀測(cè)雜合度，說(shuō)明該種源內(nèi)部個(gè)體間存在遺傳分化的現(xiàn)象。

根據(jù)等位基因數(shù)據(jù)計(jì)算其群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)、群體間近交系數(shù)(Fit)、群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)，見(jiàn)表7。群體內(nèi)近交系數(shù)的均值為0.025，SA-25位點(diǎn)的值最小，為-0.11，SH-21位點(diǎn)的值最大，為0.192；群體間近交系數(shù)的均值為0.168，SH-21位點(diǎn)的值最大，為0.382，而最小值為0.015(SA-23)；群體間遺傳分化系數(shù)的均值為0.147，變化范圍為0.056(SA-23)～0.279(SA-25)，說(shuō)明蒙古櫟群體間具有中等水平的遺傳分化?；蛄鞯淖兓秶鸀?.647(SA-25)～2.264(Qden05011)，均值為1.933，說(shuō)明蒙古櫟群體間存在較大的基因流，減弱了基因遺傳漂變的作用，群體間發(fā)生遺傳分化的程度有所減弱。

表6 蒙古櫟群體水平的遺傳多樣性參數(shù)

表7 蒙古櫟群體遺傳分化系數(shù)和基因流

對(duì)蒙古櫟群體的AMOVA分析結(jié)果(表8)表明：種源間的遺傳變異占10.216%，種群內(nèi)的變異占89.784%，與種源群體間遺傳分化系數(shù)相差不大，說(shuō)明了蒙古櫟的遺傳多樣性主要是由種源群體內(nèi)的遺傳差異導(dǎo)致的。根據(jù)Nei’s遺傳距離構(gòu)建蒙古櫟不同種源的UPGMA聚類圖，見(jiàn)圖3。

圖3 蒙古櫟群體UPGMA遺傳距離聚類圖

8個(gè)種源的蒙古櫟可分為3類，第1類：M22、M52、M66和M68；第2類：M11和M63；第3類：M2和M67?？梢钥闯?，蒙古櫟種源與地理位置可能存在較弱的相關(guān)性，對(duì)遺傳距離和地理距離進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩者沒(méi)有顯著相關(guān)性(R2=0.001 8，p=0.09)，結(jié)果表明：地理隔離不是導(dǎo)致蒙古櫟遺傳變異的主要因素。

表8 蒙古櫟種源群體的分子方差分析

4 結(jié)論與討論

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，SSR分子標(biāo)記的引物開發(fā)方法也隨之變多。費(fèi)時(shí)費(fèi)力構(gòu)建傳統(tǒng)文庫(kù)逐漸被新的技術(shù)方法取代，如通過(guò)改良文庫(kù)法，即構(gòu)建富集文庫(kù)測(cè)序開發(fā)SSR引物[19]；基于該物種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)或者通過(guò)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序進(jìn)行開發(fā)SSR引物的研究越來(lái)越多[20-21]。而隨著數(shù)據(jù)庫(kù)EST和全基因組的增加，開發(fā)SSR引物也越來(lái)越方便，即通過(guò)下載數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列，處理后通過(guò)軟件或腳本查找SSR位點(diǎn)信息，再使用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)篩選引物[22-24]。

而SSR位點(diǎn)查找軟件或腳本，大多研究使用perl腳本MISA進(jìn)行查找[24-26]。還有通過(guò)李強(qiáng)等[27]開發(fā)的本地SSR Hunter進(jìn)行本地SSR位點(diǎn)搜索查找。但二者一般搜索標(biāo)準(zhǔn)不同，MISA一般設(shè)置條件為：?jiǎn)魏塑账釣橹貜?fù)單位時(shí)，重復(fù)數(shù)至少為10；雙核苷酸為重復(fù)單位時(shí)，重復(fù)數(shù)至少為6；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸為重復(fù)單位時(shí)，重復(fù)數(shù)均至少為5。而本地軟件SSR Hunter的一般標(biāo)準(zhǔn)為：重復(fù)單位長(zhǎng)度為2～6 bp，最少重復(fù)次數(shù)為5次。搜索標(biāo)準(zhǔn)因人而異，但是SSRHunter的不同之處在于，對(duì)單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)不能進(jìn)行查找，不能對(duì)中間間隔不超過(guò)100 bp的復(fù)合型SSR進(jìn)行篩選，但是這款軟件查找位點(diǎn)信息可以給出位點(diǎn)上下游150 bp信息，便于逐一設(shè)計(jì)SSR引物。而MISA可通過(guò)perl腳本結(jié)合Primer3進(jìn)行批量設(shè)計(jì)引物，顯然更快捷方便。

本研究通過(guò)SSR Hunter 1.3查找SSR位點(diǎn)175個(gè)，逐一設(shè)計(jì)篩選比對(duì)得到引物22對(duì)，在8份種源不同的模版上有效擴(kuò)增達(dá)6份以上，且單一性良好、條帶清晰的有14對(duì)引物，達(dá)63.64%；而MISA查找位點(diǎn)163個(gè)，批量設(shè)計(jì)篩選引物63對(duì)，8份模版上有效擴(kuò)增達(dá)6份以上，且單一性良好條帶清晰的有33對(duì)，占比52.38%。因?yàn)閿?shù)據(jù)工作量的重復(fù)性和批量設(shè)計(jì)引物的需求，相比較MISA更方便。對(duì)比本研究結(jié)果，張?jiān)嗟萚28]對(duì)4種櫟屬的SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析，序列處理采用的軟件及SSR位點(diǎn)查找標(biāo)準(zhǔn)的不一致，會(huì)導(dǎo)致有明顯差異。

通過(guò)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載蒙古櫟EST序列，經(jīng)過(guò)處理組裝得到418條序列，全長(zhǎng)309 802 bp，含有SSR位點(diǎn)有132條序列，SSR位點(diǎn)163個(gè)。而蒙古櫟葉綠體基因組全長(zhǎng)161 194 bp，SSR位點(diǎn)88個(gè)。相比較其他物種，數(shù)據(jù)庫(kù)中蒙古櫟EST序列較少，可能與蒙古櫟研究較少有關(guān)?；诿晒艡礒ST序列發(fā)現(xiàn)的SSR類型，單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸較多，達(dá)到95%以上；而五核苷酸則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，六核苷酸重復(fù)類型僅占比0.61%?；谌~綠體基因組查找的SSR，僅存在單核苷酸，二核苷酸和三核苷酸，單核苷酸最多，88個(gè)SSR位點(diǎn)中出現(xiàn)82個(gè)單核苷酸位點(diǎn)。19種重復(fù)類型中，AG與CT和A與T，這二種類型占了總SSR重復(fù)類型的63%。二核苷酸AG與CT出現(xiàn)的比例最高，出現(xiàn)72次。這與王書珍等[29]的研究結(jié)果相似，二核苷酸最多，其次是單核苷酸。徐小彪等[30]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃EST-SSR中二核苷酸為主要類型，AG與CT出現(xiàn)次數(shù)最多，結(jié)果相似。在葉綠體基因組中，A與T出現(xiàn)比例最高，為81次。重復(fù)次數(shù)為10次和11次時(shí)，SSR位點(diǎn)出現(xiàn)最多。

設(shè)計(jì)合成的6對(duì)SSR引物，與前人研究的Qden05011引物相比較，在這8個(gè)種源群體上，SA-39、SA-43、SA-49與Qden05011的多態(tài)性水平一致，具有較高的多態(tài)性。有學(xué)者[31]利用9對(duì)SSR引物對(duì)蒙古櫟的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其多態(tài)性信息含量的變化范圍為0.487 2～0.848 3，均值為0.723 7，孫靜靜[16]設(shè)計(jì)的SSR引物PIC的變化范圍為0.49～0.95，均值為0.83。本研究開發(fā)的6對(duì)SSR引物的多態(tài)性信息含量為0.371～0.893，均值大于0.5，說(shuō)明了開發(fā)的SSR引物在蒙古櫟遺傳多樣性研究中起到的作用是顯著的。

7對(duì)引物在8個(gè)不同種源蒙古櫟上的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，每個(gè)SSR位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)(Na)為3.643，Shannon多樣性指數(shù)(I)為1.291，平均期望雜合度(He)為0.622，平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.692。張杰[32]利用ISSR技術(shù)分析蒙古櫟的遺傳多樣性，結(jié)果為Na=1.451 8、Ne=1.305 9和I=0.254 6；陳罡等[33]利用10對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)分布在遼寧省的蒙古櫟天然群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，Na=7.3、I=1.270、He=0.624，這說(shuō)明了蒙古櫟群體具有較高的遺傳變異和遺傳多樣性水平。對(duì)比櫟屬其他樹種，遼東櫟(Na=10.272 7、I=1.754 3、He=0.753 8)[34]、白櫟(Quercusfabri)(Na=5.41、He=0.542、I=1.151)[35]、短柄枹櫟(Quercusglandulifera)(Na=3.67、He=0.43、I=0.66)[36]、歐洲栓皮櫟(Quercusvariabilis)(He=0.65、Na=0.72)[37]，說(shuō)明蒙古櫟存在較為豐富的遺傳多樣性，在櫟屬樹種中具有中等程度的遺傳多樣性。

種源間的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示：不同種源間存在一定的差異性，種源間存在遺傳缺失或種源內(nèi)部間個(gè)體間遺傳分化等現(xiàn)象。李文英等[38]采用AFLP技術(shù)分析蒙古櫟群體遺傳變異，發(fā)現(xiàn)蒙古櫟天然群體間存在一定程度的遺傳分化(Gst=0.077)，且存在一定的基因交流，Nm為5.99；李文英和顧萬(wàn)春[39]利用等位酶分析蒙古櫟天然群體發(fā)現(xiàn)其群體間遺傳分化度Gst為0.107，群體內(nèi)變異量占89.27%，但其基因流Nm為2.08，處于較低水平；張杰等[10]利用ISSR分析蒙古櫟群體遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，種源內(nèi)的遺傳變異占總遺傳的73.43%，基因流Nm值較低，僅1.381 8；王越[18]利用SSR標(biāo)記分析蒙古櫟遺傳多樣性，結(jié)果顯示94.41%的遺傳多樣性存在于種群內(nèi)，基因流為4.222 1，蒙古櫟群組的遺傳分化程度處于中等水平；陳罡等[33]開發(fā)10對(duì)SSR引物對(duì)遼寧蒙古櫟8個(gè)天然群體分析發(fā)現(xiàn)，群體間遺傳分化系數(shù)為0.065 5，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，群體間存在的基因流達(dá)4.471。本研究發(fā)現(xiàn)蒙古櫟群體的基因流為1.933，處于較低的水平。其基因流較低的原因可能是風(fēng)媒傳粉的多年生蒙古櫟[40]，其種子主要依靠重力和小型嚙齒動(dòng)物傳播，因而較大的地理隔離可能會(huì)導(dǎo)致種源群體間的低基因流；生境片段化亦會(huì)影響基因流的強(qiáng)度。弱基因流僅在一定程度上弱化種間的遺傳差異，減少群體間的遺傳差異，因而本研究發(fā)現(xiàn)F統(tǒng)計(jì)顯示群體間的遺傳分化系數(shù)僅為0.147，相對(duì)較高，且AMOVA分析也發(fā)現(xiàn)群體間的遺傳變異占10.216%，種源內(nèi)的變異占89.784%。相較其他櫟屬的研究，舒瑪櫟(Quercusshumardii)群體間變異貢獻(xiàn)率達(dá)到15.12%[41]、意大利卡拉布里亞的栓皮櫟13%的變異存在于群體間[9]、意大利南部栓皮櫟20%的遺傳變異存在于居群間[9]、大果櫟(Quercusmacrocarpa)3%的遺傳變異發(fā)生在居群間[9]、川滇高山櫟居群間的變異為8.9%[42]、槲櫟11.45%的變異是發(fā)生在群體間的[16]，蒙古櫟種源間分化水平處于中等水平程度。利用Mantel檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蒙古櫟遺傳距離和地理距離之間沒(méi)有顯著相關(guān)性，且根據(jù)聚類分析發(fā)現(xiàn)蒙古櫟群體并非按照地理位置聚類，這與李文英和顧萬(wàn)春[39]的結(jié)果一致，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在其他櫟屬樹木中，栓皮櫟[43]、麻櫟(Quercusacutissima)[44]、白櫟[45]等，這可能跟其自身遺傳特性相關(guān)，且生存環(huán)境變化有關(guān)。

采用不同SSR位點(diǎn)查找軟件，因其不同的搜索標(biāo)準(zhǔn)，可能產(chǎn)生的結(jié)果有所不同。在大量轉(zhuǎn)錄組或者數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)下，快速便捷的MISA結(jié)合Primer3、Electronic PCR批量設(shè)計(jì)并篩選去除有多處比較的引物，明顯更適合研究的需求?；诿晒艡狄阎狤ST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行處理查找SSR位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)二核苷酸和單核苷酸發(fā)生頻率最高，而葉綠體基因組中單核苷酸發(fā)生頻率最高。設(shè)計(jì)合成的93對(duì)引物，其中有52對(duì)引物能在多種源中有效擴(kuò)增，為蒙古櫟遺傳多樣性研究和分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)，提供了構(gòu)建遺傳譜系的依據(jù)；基于7對(duì)SSR引物發(fā)現(xiàn)，蒙古櫟具有中等程度的分化水平，且主要的遺傳變異來(lái)源群體間，個(gè)體間存在遺傳分化或者缺失現(xiàn)象。蒙古櫟群體并非完全按照地理位置聚類，可能與其自身遺傳特性和生存環(huán)境變化有關(guān)。