魏卓昕，石賢文，張文雙，徐凌云

(武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023)

黃芩苷微乳凝膠是我院研發(fā)的皮膚外用制劑，活性成分為黃芩苷。黃芩苷是從黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用[1]。根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020版(ChP2020)中微生物限度檢測方法有關(guān)規(guī)定，皮膚外用半固體制劑不得檢測出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，需氧菌數(shù)目應(yīng)小于100 cfu/mL[2-3]。由于黃芩苷具有抑菌作用，常規(guī)法不能真實(shí)反映該藥物制劑的微生物污染情況。本研究采用中和劑法及薄膜過濾法進(jìn)行漸進(jìn)式研究，建立黃芩苷微乳凝膠微生物限度檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑

黃芩苷微乳凝膠(自制[4]，規(guī)格為每支10 g，黃芩苷含量為50 mg/10 g，批號：21040705)，吐溫80(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20210301)，大豆卵磷脂(河南四維生物科技有限公司，批號：20210201)，0.9%無菌氯化鈉溶液(山東科倫藥業(yè)有限公司，批號：B21011301B)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司，批號：20210326)，0.45 μm無菌濾膜(天津津騰實(shí)驗設(shè)備有限公司，批號：20210329)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司，批號：20201012)，瓊脂粉(北京索萊寶科技有限公司，批號923H022)，溴化烷基十六烷三甲胺培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司，批號：20210402)。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.3 儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司，型號：DHG-90170A)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號：YXQ-50SⅡ)、生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號：SPX-300BSH-Ⅱ)、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-1FD)、微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司，型號：P70D17TL-D5)、振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司，型號：ZQLY-300F)和紫外分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司，型號：WFJ7200)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備

參照ChP2020(四部)1105項下規(guī)定，采用傳代次數(shù)不超過5代的菌株。取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌分別接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，作為新鮮培養(yǎng)物；取各試驗菌新鮮培養(yǎng)物1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液進(jìn)行梯度稀釋，直至得到含菌量為100 cfu/mL及1 000 cfu/mL菌懸液，備用[5-6]。

1.2.2 微生物計數(shù)法適應(yīng)性試驗

1.2.2.1 中和劑法

含中和劑的稀釋液配制：稱取0.75 g大豆卵磷脂與10.00 g吐溫80，加0.9%無菌氯化鈉溶液至250 mL，得到含0.3%大豆卵磷脂和4.0%吐溫80的稀釋液。取黃芩苷微乳凝膠10 g加中和劑稀釋液至100 mL，得到1∶10的供試液a。以供試液a為母液，稀釋得到1∶20的供試液b以及1∶50的供試液c。試驗組：取供試液a，b，c各9 mL和含菌量為1 000 cfu/mL的各試驗菌液1 mL，混勻后，取1 mL注入平皿中，使得各試驗組最終含菌量為100 cfu。對照組：取中和劑稀釋液1 mL，注入平皿中。菌液組：取0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL和含菌量為1 000 cfu/mL的各試驗菌液1 mL，混勻后取1 mL注入平皿中[7]，最終含菌量為100 cfu。各組平皿分別加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基約20 mL搖勻，凝固后，規(guī)定的條件下培養(yǎng)24 h，計數(shù)。每種試驗菌平行制備2個平皿，計算回收比值，回收比值=(試驗組菌落數(shù)-對照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)，回收比值為0.5～2.0符合ChP2020微生物限度檢查方法適應(yīng)性檢查的規(guī)定。

1.2.2.2 薄膜過濾法

取黃芩苷微乳凝膠10 g，加入0.9%無菌氯化鈉溶液至100 mL，順同一方向充分振搖，制成1∶10的供試液A。以供試液A為母液，依次用0.9%無菌氯化鈉稀釋制備成1∶20的供試液B及1∶50的供試液C。試驗組：取供試液B和供試液C各1 mL，加入100 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，用0.45 μm薄膜過濾，用0.9%無菌氯化鈉沖洗2次，每次100 mL[8]。在最后一次沖洗液中分別加入含菌量不大于100 cfu/mL的“1.2.1”下各菌液1 mL。對照組：取制備好的供試液B和供試液C各1 mL，不加試驗菌，其余操作同試驗組。菌液組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。過濾完畢后，將制備好的濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，按規(guī)定條件倒置培養(yǎng)，計數(shù)。每個試驗菌平行制備2個平皿，按1.2.2.1項下方法計算回收比值。

1.2.3 控制菌適用性試驗

控制菌檢查法系在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。黃芩苷微乳凝膠屬于非無菌局部皮膚給藥制劑，根據(jù)ChP2020(四部)1106和1107項下規(guī)定，不得檢測出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。參照“1.2.2.2”實(shí)驗結(jié)果，取1∶20供試液B以薄膜過濾法進(jìn)行控制菌實(shí)驗。試驗組：取供試液A(相當(dāng)于1 g或1 mL供試品的供試液)，加入100 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，薄膜過濾，用0.9%無菌氯化鈉沖洗2次，每次100 mL。陽性對照組：用0.9%無菌氯化鈉沖洗無菌濾膜2次，每次100 mL，在最后一次沖洗液中分別加入含菌量不大于100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌菌液1 mL。陰性對照組：取0.9%無菌氯化鈉溶液1 mL，加入100 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，薄膜過濾，用0.9%無菌氯化鈉沖洗2次，每次100 mL。

上述各組制得的濾膜置入裝有100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃培養(yǎng)24 h，分別取各組培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板或溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察各平皿是否長菌。若試驗組和陰性對照組不長菌，陽性對照組長菌，則記為未檢出。若試驗組長菌，培養(yǎng)結(jié)束后，對銅綠假單胞菌進(jìn)行氧化酶試驗：將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取試驗組平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺試液，在30 s內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性[2]。

2 結(jié) 果

2.1 中和法適用性試驗結(jié)果

中和劑法的各試驗菌回收比值結(jié)果見表1，黃芩苷微乳凝膠10倍稀釋、20倍稀釋及50倍稀釋試驗組的三種細(xì)菌的回收比值均低于0.5，表明黃芩苷微乳凝膠的抑菌效果未完全清除。各試驗菌菌液組細(xì)菌生長良好，如圖1所示。

表1 中和劑法黃芩苷微乳凝膠各稀釋組三種細(xì)菌的回收比值

(a) (b) (c)

2.2 薄膜過濾法適用性試驗結(jié)果

黃芩苷微乳凝膠在20倍稀釋時，各試驗菌回收比值分別為0.73，1.00，0.96(見表2)，均符合ChP2020的要求，后續(xù)選用黃芩苷微乳凝膠20倍稀釋和薄膜過濾法進(jìn)行控制菌試驗。黃芩苷微乳凝膠20倍稀釋時薄膜過濾法的三種細(xì)菌培養(yǎng)見圖2，各試驗組均有細(xì)菌生長，且回收比值在正常范圍。

表2 薄膜過濾法黃芩苷微乳凝膠各稀釋組三種細(xì)菌的回收比值

(a) (b) (c)

2.3 控制菌適用性試驗

黃芩苷微乳凝膠微生物限度檢查結(jié)果見表3。在各菌種控制菌檢測中，各試驗組均未檢測出試驗菌。

表3 控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果

3 討 論

黃芩苷抗菌效果顯著，能通過影響DNA的合成、酶的活性以及線粒體膜電位，抑制白色念珠菌的生長，并通過影響細(xì)胞信號通路、酶活性及干預(yù)生物膜的形成與發(fā)展對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌作用。黃芩苷在干預(yù)銅綠假單胞菌生物膜生成、減少多糖蛋白復(fù)合物產(chǎn)量及抑制mRNA的表達(dá)效果方面也有明顯作用[9-12]。鑒于黃芩苷的廣譜抑菌作用，黃芩苷微乳凝膠中潛在的微生物可能處于失活狀態(tài)。局部給藥時，藥物在患者體內(nèi)釋放后，這些菌株可能會恢復(fù)活性，從而對機(jī)體健康造成威脅。黃芩苷微乳凝膠作為一種非無菌制劑，諸多生產(chǎn)環(huán)節(jié)和外部因素均可能造成污染，因此，進(jìn)行微生物限度檢測是必要的[13]。由于不具備白色念珠菌和黑霉菌微生物限度檢測的實(shí)驗環(huán)境和設(shè)備，本文未對這兩種試驗菌進(jìn)行檢測。

中和劑法可去除藥物本身的抑菌性[14]。ChP2020(四部)1105項下對中和劑的選用標(biāo)準(zhǔn)并不明晰，所以選用合適的中和劑是采用這種方法時首先要解決的問題[15]。牟建平等[16]分別采用硫酸錳、硫酸鎂、氯化鋇、氯化鈣和氯化鎂作為中和劑破壞林可霉素利多卡因凝膠的膠束結(jié)構(gòu)，并聯(lián)用薄膜過濾法比較這五種中和劑對微生物限度檢測結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以硫酸錳和硫酸鎂作為中和劑時，供試液中均產(chǎn)生黃色油狀不明物質(zhì)，無法通過薄膜。氯化鋇本身為劇毒物質(zhì)，氯化鈣容易與凝膠中的碳酸根離子反應(yīng)生成沉淀，不易過濾，故以上兩種中和劑亦不是最優(yōu)選擇。而氯化鎂作為中和劑時，能與輔料形成容易清除的絡(luò)合物，各菌株的回收率均符合要求。由此可見，中和劑的正確選用直接關(guān)系到實(shí)驗的最終結(jié)果。吐溫80和大豆卵磷脂合用可降低酚、醛、季銨類化合物的藥用活性[17]。張秀花等[18]以3%吐溫80和0.3%卵磷脂作為中和劑對十種中藥制劑進(jìn)行微生物限度檢測，各菌株回收比值均在0.94～1.03。黃芩苷為多羥基黃酮類單體化合物，本實(shí)驗選用含4.0%吐溫80和0.3%大豆卵磷脂的0.9%無菌氯化鈉溶液做稀釋劑，以期中和黃芩苷的抑菌效果。但實(shí)驗結(jié)果顯示，各試驗菌的回收比值均低于0.5，即這兩種中和劑在該比例下無法去除黃芩苷微乳凝膠的抑菌性。此外，黃芩苷微乳凝膠中本就以吐溫80作為表面活性劑，猜測吐溫80與卵磷脂的比例可能會影響實(shí)驗結(jié)果。

薄膜過濾法常用于去除藥物抑菌性成分[19]。本實(shí)驗采用0.45 μm的微孔濾膜截留微生物，再在適宜條件下培養(yǎng)，使其增殖并形成單菌落，通過肉眼計數(shù)并計算回收比值，從而定性或定量檢測微生物。此外，供試液過濾后，用稀釋液反復(fù)沖洗濾膜，可清除抑菌成分黃芩苷和焦亞硫酸鈉[20]。實(shí)驗結(jié)果表明，薄膜過濾法可有效去除黃芩苷微乳凝膠對3種試驗菌的抑菌作用，其中以20倍稀釋時效果最好，經(jīng)計算三種試驗菌回收比值分別為0.73，1.00和0.96，符合ChP2020的要求。當(dāng)稀釋倍數(shù)為50倍時，三種菌株的回收比值均降低。盡管薄膜過濾法適用于黃芩苷微乳凝膠微生物限度測定，但部分凝膠制劑因黏度過大經(jīng)稀釋后也無法通過薄膜，故此方法也并非適用于所有藥物。有研究采用中和劑法聯(lián)合薄膜過濾法進(jìn)行實(shí)驗[16，18]，雖然ChP2020并未明確兩法合用的檢測規(guī)定，但這也可為微生物限度測定提供新思路。

綜上所述，本實(shí)驗建立的薄膜過濾法能解決黃芩苷微乳凝膠中抗菌成分干擾的問題，適用于該制劑的微生物限度檢測。