尹家琪，康明麗，韓敏義,, ，李凌云，王曉明，徐幸蓮

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；2.農(nóng)業(yè)部肉品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210095；3.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050018；4.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東云浮 527400）

我國(guó)是僅次于美國(guó)的世界第二大肉類生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，肉雞出欄量和消費(fèi)量一直呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。根據(jù)中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)公布的數(shù)據(jù)，2019年我國(guó)出欄白羽肉雞44億羽，黃羽肉雞49億羽，淘汰蛋雞11億羽，817肉雜雞18億羽?！?020年白羽肉雞聯(lián)盟成員企業(yè)屠宰量排名》顯示2020年屠宰白羽肉雞35.5億羽[1?2]。雞肺作為肉雞屠宰加工過(guò)程中的副產(chǎn)品，每只雞平均雞肺重量為10～12 g，目前主要作為低值飼料供應(yīng)給養(yǎng)殖戶或直接作為廢棄物處理，未能得到高值化和產(chǎn)業(yè)化利用，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于雞肺利用的文獻(xiàn)極少，國(guó)內(nèi)關(guān)于雞肺的研究主要集中在膠原蛋白的提取、穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)、凝膠乳化性研究方面[3–5]。國(guó)外報(bào)道多為禽流感病毒感染雞肺的全基因組宿主基因表達(dá)分析[6]、細(xì)胞分離鑒定及敏感性[7]等方面。目前國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于雞肺提取生物活性物質(zhì)并加以利用的案例，因此選擇合適的方式對(duì)雞肺實(shí)現(xiàn)綜合利用十分迫切。

研究表明機(jī)體產(chǎn)生的自由基會(huì)對(duì)核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能造成氧化損傷，引起老年癡呆癥等衰老疾病的產(chǎn)生[8]。同時(shí)在食品加工過(guò)程中產(chǎn)生的自由基會(huì)促使脂質(zhì)氧化過(guò)程的進(jìn)行[9]，產(chǎn)生丙二醛等脂肪氧化產(chǎn)物，造成食品風(fēng)味、感官品質(zhì)的劣變，降低食用價(jià)值的同時(shí)還會(huì)對(duì)人體造成不利影響。目前工業(yè)用抗氧化劑主要是VC、VE等物質(zhì)以及二丁基羥基甲苯（butylated hydroxyltoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）等，前者屬于天然抗氧化劑，來(lái)源較為廣泛；但是光、熱穩(wěn)定性較差易分解，后者抗氧化效果好，但是長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用[10]。利用蛋白質(zhì)含量較高的屠宰副產(chǎn)物雞肺制備天然來(lái)源的抗氧化肽是一種良好的選擇，目前抗氧化肽的制備主要集中于酶解法、微生物發(fā)酵法以及化學(xué)合成法、基因重組法[11]處理天然動(dòng)植物原料，其中酶解法由于反應(yīng)條件溫和、效率高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于副產(chǎn)物制備生物活性肽，該方法制備的抗氧化肽在肉制品保鮮與自由基清除方面已顯示出良好效果[12]。

本研究首先測(cè)定了雞肺的化學(xué)組成，從基本營(yíng)養(yǎng)成分和含量較高的金屬元素等角度補(bǔ)充了目前關(guān)于雞肺基本成分資料的空白。針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于副產(chǎn)物制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化過(guò)程主要局限于關(guān)注自由基清除率變化的問(wèn)題，本文提出了采用DPPH·清除率和粗肽含量雙指標(biāo)，從自由基清除能力和肽產(chǎn)率兩個(gè)角度共同評(píng)價(jià)酶解過(guò)程。此外，通過(guò)比較酶解前后游離氨基酸的組成和含量，從較深層面分析酶解后抗氧化能力較強(qiáng)的原因。在取得的優(yōu)化工藝基礎(chǔ)上，采用超濾對(duì)抗氧化肽進(jìn)行純化，選擇自由基清除能力較強(qiáng)的部分進(jìn)行分子量分布與肽序列測(cè)定，利用熱圖進(jìn)行肽段末端氨基酸殘基出現(xiàn)頻率分析。本文研究將為雞肺生物活性肽的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)際參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞肺 取自818肉雜雞，0.9～1.1 kg，公雞，日齡40～45 d，屠宰掏膛后立即收集，新興縣溫氏佳豐食品有限公司；胃蛋白酶（1.5×105U/g）、木瓜蛋白酶（8×105U/g）、堿性蛋白酶（2×105U/g）、復(fù)合蛋白酶（1.2×105U/g）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽） 上海源葉生物科技有限公司；細(xì)胞色素C（MW12384）、抑肽酶（MW6500）、桿菌肽（MW1422）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）均為標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；總抗氧化能力測(cè)試試劑盒（FRAP法） 碧云天公司；其他試劑 均為分析純。

FOSS Kjeltec8400凱氏定氮儀 瑞典福斯公司；DH-9240A烘箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SX-G30103馬弗爐 天津中環(huán)電爐股份有限公司；PE900T原子吸收光譜儀 美國(guó)珀金埃爾默公司；HH-6孔電熱恒溫水浴鍋 紹興市蘇珀儀器有限公司；PD 500高速均質(zhì)機(jī) 英國(guó)普律瑪儀器有限公司；S2-Food Kit型pH計(jì) 瑞士梅特勒托得多公司；Vortex-2渦旋混勻儀 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；MS304TS/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；INFINITE 200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；Allegar-64R型離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；7310全自動(dòng)氨基酸分析儀 賽卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；Thermo Scientific QE HF質(zhì)譜儀 美國(guó)賽默飛公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞肺抗氧化肽酶解工藝 參考文獻(xiàn)方法[13]并稍作修改，雞肺清水浸泡5 min瀝水后剪去氣管和大體積脂肪塊，沖洗3次去除表面雜質(zhì)并絞碎，加入去離子水調(diào)料液比為1:3（w:w），倒入燒杯勻漿（10000 r/min，20 s，重復(fù)3次），調(diào)pH后放入水浴鍋預(yù)熱10 min后加蛋白酶保持恒溫水解（水解過(guò)程中用1 mol/L的稀鹽酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH），酶解完成后將反應(yīng)液pH調(diào)至7.0隨后沸水浴10 min滅酶，酶解液冰浴、離心取上清液（10000 r/min，15 min），取上清測(cè)DPPH·清除率與肽含量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 酶的選擇 參考表1，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在酶解程度較為完全的條件下，將四種蛋白酶：復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶在其最適pH和溫度下[14]按照酶添加量6000 U/g，料液比1:3（w/w），酶解時(shí)間6 h進(jìn)行酶解，結(jié)束后取離心（10000 r/min, 15 min）上清液測(cè)定DPPH·清除率和粗肽含量，選擇DPPH·清除率和粗肽含量均最高的蛋白酶進(jìn)行后續(xù)的單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)。

表1 不同蛋白酶最適pH和溫度Table 1 Optimal pH and temperature for different proteases

1.2.2.2 pH的選擇 以料液比1:3（w:w）、溫度37 ℃、酶添加量6000 U/g、酶解時(shí)間4 h為基本條件，分別研究不同的pH（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5）對(duì)雞肺抗氧化肽的DPPH·清除率、粗肽含量的影響。

1.2.2.3 酶添加量的選擇 以料液比1:3（w:w）、溫度37 ℃、pH3.5、酶解時(shí)間4 h為基本條件，分別研究不同的酶添加量（2000、4000、6000、8000、10000 U/g）對(duì)雞肺抗氧化肽的DPPH·清除率、粗肽含量的影響。

1.2.2.4 酶解時(shí)間的選擇 以料液比1:3（w:w）、溫度37 ℃、pH3.5、酶添加量6000 U/g為基本條件，分別研究不同的酶解時(shí)間（1、2、4、6、8 h）對(duì)雞肺抗氧化肽的DPPH·清除率、粗肽含量的影響。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取pH（A）、酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）為試驗(yàn)因子，以DPPH·清除率和粗肽含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)中因素及水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Response surface design factors and levels

1.2.4 抗氧化肽超濾分離 分別采用3和10 kDa的超濾管對(duì)雞肺抗氧化肽粗品進(jìn)行超濾分離，將肽粗品溶解于去離子水中，配制濃度為10 mg/mL的溶液。15 mL超濾管上樣10 mL，4000 r/min離心15 min，分別收集分子量>10 kDa，3～10 kDa和<3 kDa的組分冷凍干燥，并稀釋成2 mg/mL的溶液進(jìn)行抗氧化指標(biāo)的測(cè)定，選擇抗氧化能力最強(qiáng)的組分進(jìn)行分子量分布測(cè)定和肽序列測(cè)定。

1.2.5 基本化學(xué)成分測(cè)定 含水量：參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定總蛋白質(zhì)含量》第一法 直接干燥法；總蛋白：參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》第一法 凱氏定氮法；脂肪：參照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》第一法 索氏抽提法；灰分：參照GB 5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》第一法食品中總灰分的測(cè)定；鉀、鈉：參照GB 5009.91-2017《食品中鉀、鈉的測(cè)定》第一法 火焰原子吸收光譜法。

1.2.6 抗氧化指標(biāo)

1.2.6.1 DPPH·清除率的測(cè)定 參考Liu等[15]的方法進(jìn)行，將DPPH用95%的乙醇溶液溶解后，配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液。樣品組為1 mL DPPH溶液與1 mL粗肽液的混合液，對(duì)照組為1 mL DPPH溶液與1 mL 95%乙醇溶液的混合液，空白組為1 mL粗肽液和1 mL 95%乙醇溶液的混合液。室溫25 ℃避光反應(yīng)30 min后，測(cè)定其在517 nm處的吸光值，粗肽液的DPPH·清除能力計(jì)算見(jiàn)式（1）：

1.2.6.2 鐵離子還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP） 使用總抗氧化能力測(cè)試試劑盒（FRAP法）測(cè)定，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6.3 ABTS+·清除率的測(cè)定 參考Zakrys等[16]的方法，ABTS溶液與氧化劑等體積混合配制ABTS工作液，室溫避光放置12～16 h。用磷酸鹽緩沖液稀釋工作液，取200 μL上述工作液與10 μL樣品混勻，室溫反應(yīng)4 min，于734 nm處測(cè)定吸光度，以超純水作為空白對(duì)照。ABTS+·清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為超純水與ABTS工作液的吸光度；A1為樣品溶液與ABTS工作液的吸光度

1.2.7 肽含量的測(cè)定 參考Luan等[17]的方法并稍作改進(jìn)，采用鄰苯二甲醛法（OPA法）測(cè)定粗肽含量，鄰苯二甲醛混合溶液的配制方法為80 mg鄰苯二甲醛溶于1 mL甲醇中，依次加入50 mL四硼酸鈉溶液（0.1 mol/L）、5 mL十二烷基硫酸鈉（20%，w/w）、200 μLβ-巰基乙醇，去離子水定容至100 mL，試劑現(xiàn)用現(xiàn)配。取150 μL濃度為1 mg/mL的粗肽溶液，加入2.0 mL鄰苯二甲醛混合試劑，劇烈混勻后室溫避光反應(yīng)2 min后測(cè)定反應(yīng)液在340 nm波長(zhǎng)處的吸光值。用胰蛋白胨作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配制濃度為0～1 mg/mL梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定吸光值，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出雞肺粗肽粉中的多肽含量，計(jì)算方式見(jiàn)公式（3）：

1.2.8 酶解前后氨基酸組成分析 酶解前后樣品按照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測(cè)定》方法進(jìn)行氨基酸組成分析。其中表格數(shù)據(jù)雞肺列為根據(jù)酶解前液體的氨基酸含量與稀釋倍數(shù)折算而成，酶解前液體為雞肺勻漿處理后離心取上清液，酶解后上清液為酶解液離心取上清液進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 肽分子量分布測(cè)定 采用高效液相色譜儀測(cè)定雞肺抗氧化肽的肽分子量分布[18]。配制1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、桿菌肽（MW1422）、抑肽酶（MW6500）、細(xì)胞色素C（MW12384），上樣量10 μL，經(jīng)TSKgel凝膠色譜柱等度洗脫，流動(dòng)相組成：乙腈:水:三氟乙酸=40:60:0.1（v:v:v），柱溫30 ℃，流速0.5 mL/min，繪制標(biāo)準(zhǔn)品與洗脫時(shí)間之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品液經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，在與標(biāo)品同樣的條件下洗脫，參考標(biāo)曲計(jì)算樣品的分子量分布。

1.2.10 LC-MS/MS 鑒定肽段 肽粉用超純水復(fù)溶后采用3 kDa的超濾管進(jìn)行超濾，離心結(jié)束后收集濾液，進(jìn)行脫鹽、揮干，產(chǎn)物使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)（LC-MS/MS）進(jìn)行測(cè)定。LC-MS/MS系統(tǒng)由Thermo EASY nLc-Thermo scientific QE HF組成，色譜柱為PepMap RSLC C18。

根據(jù)Xing等[19]的方法，流動(dòng)相設(shè)置如下：A相（0.1%甲酸），B相（0.1%甲酸，80%乙腈），樣品流速為350 nL/min，洗脫過(guò)程為：0～7 min（97% A，3%B），7～46 min（92% A，8% B），46～51 min（68% A，32% B），51～56 min（56% A，44% B），56～60.10 min（1% A，99% B），60.10～70 min（97% A，3% B）。選擇6個(gè)一級(jí)質(zhì)譜中的最高峰進(jìn)行碎片掃描，使用Peaks Studio X對(duì)肽段進(jìn)行從頭測(cè)序（De novo），選擇具有高置信度（95%～99%）的序列進(jìn)行分析。

進(jìn)行熱圖分析時(shí)，氨基酸肽端出現(xiàn)頻率用式（4）表示：

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用IBM SPSS Statistics 25軟件（IBM，USA）進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，如果方差分析效應(yīng)顯著，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，顯著水平設(shè)為P<0.05，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6（Stat-Ease，USA）進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，運(yùn)用Origin 2021b（OriginLab Co, Northampton, MA, USA）繪制柱狀圖、折線圖與熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肺基本化學(xué)組成分析

雞肺（濕樣）經(jīng)測(cè)定各組分含量見(jiàn)表3。由表3可以看出，通過(guò)與李小勇[20]研究得到的豬肺基本成分進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，雞肺中水分含量為81.45 g/100 g，與豬肺含水量（83.10 g/100 g）相比，兩者含量接近；雞肺蛋白質(zhì)含量較高，為14.00 g/100 g，脂肪和灰分含量較低，分別為2.50和0.94 g/100 g，是作為蛋白酶解提取生物活性肽的良好原料。雞肺蛋白質(zhì)含量高于豬肺（12.20 g/100 g）而脂肪含量低于豬肺（3.90 g/100 g），基本營(yíng)養(yǎng)成分較豬肺更適合進(jìn)行蛋白酶解。對(duì)于含量較高的礦物質(zhì)鉀和鈉元素，它們?cè)谛迈r雞肺中的含量均高于豬肺（分別為210和81.40 mg/100 g），整體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

表3 雞肺基本化學(xué)成分Table 3 Proximate chemical composition of chicken lung

2.2 酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶的選擇 不同蛋白酶有不同的酶切位點(diǎn)，在酶解過(guò)程中，不同蛋白酶的選擇會(huì)對(duì)酶解產(chǎn)物的氨基酸組成造成很大的影響，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的抗氧化能力和粗肽含量存在一定的差異[21]，因此需要選擇合適的蛋白酶對(duì)底物進(jìn)行酶解。如圖1所示，四種蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH·清除能力和粗肽含量為：胃蛋白酶>復(fù)合蛋白酶>木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶，其中胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH·清除能力顯著高于其他三種蛋白酶酶解產(chǎn)物（P<0.05），達(dá)到了92.20%，粗肽含量達(dá)到了74.15%。王璐莎等[8]在研究酶解鴨肉制備抗氧化肽時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶酶解產(chǎn)物擁有最高的肽含量和抗氧化能力，因此以胃蛋白酶作為酶解反應(yīng)中的酶進(jìn)行后續(xù)研究。胃蛋白酶作為內(nèi)源性蛋白酶，具有一定的氨基酸特異性，其酶切位點(diǎn)主要在氨基端或羧基端為Phe、Tyr、Trp和Leu的肽鍵部位[22]。研究表明Trp和Tyr因分別含有吲哚基和酚羥基作為電子供體，從而產(chǎn)生較好的自由基清除作用[23]。

圖1 不同蛋白酶酶解條件下的DPPH·清除率及粗肽含量Fig.1 DPPH· scavenging rate and peptide content under different enzymatic hydrolysis conditions

2.2.2 pH的選擇 本研究探索了酶解過(guò)程中不同pH對(duì)雞肺酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率與粗肽含量的影響，由圖2可以看出，pH對(duì)兩者均具有顯著影響（P<0.05）。當(dāng)pH為1.5～3.5時(shí)，隨著pH的增加，DPPH·清除率和粗肽含量顯著增加，最高值分別為93.37%和84.59%，隨后兩者都有下降趨勢(shì)。其原因在于蛋白酶作為生物活性物質(zhì)，具有發(fā)揮作用的最適pH范圍，過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境會(huì)造成蛋白酶活性減弱或消失，基團(tuán)電離作用導(dǎo)致酶分子催化基團(tuán)和底物分子上有關(guān)基團(tuán)的改變，因此只有處在適宜的pH范圍內(nèi)才能有效切斷肽鍵，釋放出具有抗氧化能力的小分子肽段[24]。因此，綜合考慮選擇pH3.5作為響應(yīng)面0水平。

圖2 不同pH對(duì)DPPH·清除率和粗肽含量的影響Fig.2 Effects of different pH on DPPH· scavenging rate and peptide content

2.2.3 酶添加量的選擇 酶和底物的比例是影響酶促反應(yīng)的主要因素，因此酶添加量是影響底物酶解的重要條件。如圖3所示，隨著酶添加量的增加（2000～4000 U/g），DPPH·清除率和粗肽含量均顯著增加（P<0.05），最高分別達(dá)到93.24%和85.21%，在底物濃度一定時(shí)，隨著酶添加量的增加，分子中更多活性基團(tuán)與蛋白酶得到充分接觸，進(jìn)而加快反應(yīng)速率，蛋白質(zhì)被酶解為具有抗氧化能力的小分子多肽，從而使整個(gè)體系的肽含量與自由基清除能力增加。徐兆剛等[24]研究表明當(dāng)酶添加量到達(dá)一定程度時(shí)，繼續(xù)增加蛋白酶的用量，會(huì)導(dǎo)致底物飽和，具有抗氧化作用的肽段被進(jìn)一步水解為無(wú)活性的小分子肽或氨基酸，導(dǎo)致體系的自由基清除能力和粗肽含量均顯著下降。綜合上述分析，選擇4000 U/g作為響應(yīng)面0水平。

圖3 不同酶添加量對(duì)DPPH·清除率和粗肽含量的影響Fig.3 Effects of different enzyme dosage levels on DPPH·scavenging rate and peptide content

2.2.4 酶解時(shí)間的選擇 蛋白酶只有在適宜條件下進(jìn)行一定時(shí)間的酶解，才能充分釋放游離氨基酸和肽段，發(fā)揮產(chǎn)物應(yīng)有的生理功能。由圖4可知，不同酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率和粗肽含量均有顯著影響（P<0.05），且兩者趨勢(shì)一致。當(dāng)酶解1～6 h時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH·清除率和粗肽含量均顯著增加，在6 h時(shí)分別達(dá)到92.53%和74.15%，6 h后兩者均顯著下降。其原因可能在于反應(yīng)初期，底物質(zhì)量濃度較高，蛋白酶與底物蛋白有充足的位點(diǎn)相互結(jié)合，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露出較多的酶切位點(diǎn)有利于蛋白酶進(jìn)行酶切[25?26]。當(dāng)酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)過(guò)度水解，同時(shí)小分子多肽靈活性高，優(yōu)先成為蛋白酶切作用位點(diǎn)的選擇，導(dǎo)致具有抗氧化能力的多肽結(jié)構(gòu)遭到破壞，水解成為游離氨基酸[10,27]。綜上，選擇6 h作為響應(yīng)面0水平。

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率和粗肽含量的影響Fig.4 Effects of hydrolysis time on DPPH· scavenging rate and peptide content

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立和方差分析 利用Design Expert軟件對(duì)pH、酶添加量、酶解時(shí)間進(jìn)行三因素三水平Box Behnken試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到DPPH·清除率（Y1）與肽含量（Y2）對(duì)pH（A）、酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）的二次響應(yīng)曲面回歸方程如下：

表4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design program and experimental results of RSM

酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除率的回歸方程方差分析見(jiàn)表5。結(jié)果顯示回歸方程模型中因變量與自變量之間存在極顯著關(guān)系，模型整體P<0.0001，說(shuō)明該模型極顯著。根據(jù)回歸方程中一次項(xiàng)的均方可知，影響酶解過(guò)程中產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除率的因素重要性排序?yàn)椋簳r(shí)間（C）>pH（A）>酶添加量（B），且三者均對(duì)模型具有極顯著影響（P<0.01）。失擬項(xiàng)P=0.0588>0.05不顯著，表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較小，殘差主要來(lái)自于隨機(jī)誤差[28]。在本模型中，決定系數(shù)R2=0.9972，校正擬合度R2Adj=0.9936，期望擬合度R2pred=0.9628，校正擬合度和期望擬合度相差不大，且模型的信噪比為43.61，表明模型與試驗(yàn)擬合程度較好，可以用此模型來(lái)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)分析。

表5 DPPH·清除率試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 ANOVA for DPPH· scavenging rate

圖5能夠直觀反映當(dāng)固定一個(gè)因素為中心點(diǎn)水平時(shí)，其他各因變量的交互作用對(duì)DPPH·清除率的影響，從曲面圖結(jié)合投影可知，當(dāng)曲面彎曲程度越大，等高線越接近橢圓形時(shí)，說(shuō)明各因素之間的交互作用

圖5 DPPH·清除率模型中各因素交互響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of various factors in DPPH·scavenging mode

越強(qiáng)，各因素之間的等高線均呈橢圓形，說(shuō)明因素之間相關(guān)性較強(qiáng)，對(duì)模型具有極顯著的影響（P<0.01），與方差分析結(jié)果一致。從圖5中可知，固定酶解時(shí)間為中心點(diǎn)水平，當(dāng)酶添加量較少時(shí)，隨著pH的升高，產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量較多時(shí)，隨著pH的升高產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除率先上升后下降。固定pH、酶添加量為中心點(diǎn)時(shí)也能得到相同的結(jié)論。

酶解產(chǎn)物對(duì)粗肽含量的回歸方程方差分析見(jiàn)表6。結(jié)果顯示回歸方程模型中因變量與自變量之間存在極顯著關(guān)系，模型整體P<0.0001，說(shuō)明該模型極顯著。根據(jù)回歸方程中一次項(xiàng)的均方可知，影響酶解過(guò)程中肽含量的因素重要性排序?yàn)椋簆H（A）>酶解時(shí)間（C）>酶添加量（B），且pH和酶解時(shí)間對(duì)模型具有顯著影響（P<0.05）。失擬項(xiàng)P=0.0586>0.05不顯著，模型整體較為準(zhǔn)確。在本模型中，決定系數(shù)R2=0.9889，校正擬合度R2Adj=0.9747，預(yù)測(cè)擬合度R2pred=0.8518，且模型的信噪比為21.07，表明模型與試驗(yàn)擬合程度較好，可以用此模型來(lái)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)分析。

表6 肽含量試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 ANOVA for peptide content

圖6能夠直觀反映各因變量的交互作用對(duì)粗肽含量的影響，從3D曲面圖結(jié)合投影可知，pH和酶解時(shí)間橢圓坡度較陡，彎曲程度較大，因素之間相關(guān)性較強(qiáng)，對(duì)模型具有顯著影響（P<0.05）。從圖中可知，固定酶解時(shí)間為中心點(diǎn)水平，當(dāng)酶添加量較少時(shí)，隨著pH的升高，產(chǎn)物的粗肽含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量較多時(shí)，隨著pH的升高產(chǎn)物的粗肽含量先上升后下降。固定pH、酶添加量為中心點(diǎn)時(shí)也能得到相同的結(jié)論。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)羥自由基清除率隨著三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性蛋白含量增加而變大，原因在于隨著水解過(guò)程的進(jìn)行，蛋白水解生成的小肽暴露出能與氧化劑發(fā)生反應(yīng)的氨基酸殘基，進(jìn)而表現(xiàn)為抗氧化活性的增加，說(shuō)明體系的抗氧化能力與小肽含量呈正相關(guān)關(guān)系。

圖6 肽含量模型中各因素交互響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of various factors in peptide content model

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合兩套響應(yīng)曲面進(jìn)行優(yōu)化分析，得到在酶解參數(shù)為溫度37 ℃，料液比1:3（w:w）的條件下，以DPPH·清除率和粗肽含量均最大作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定胃蛋白酶的最優(yōu)酶解工藝為pH3.64，酶添加量4197.53 U/g，酶解時(shí)間5.01 h。為方便實(shí)際操作將其修正為pH3.60，酶添加量4200 U/g，酶解時(shí)間5 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得到DPPH·清除率及肽含量為94.96%±0.15%和88.42%±0.23%，與預(yù)測(cè)值95.27%和88.64%無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間擬合性較好，模型可行。

2.4 酶解前后氨基酸組成分析

根據(jù)表7數(shù)據(jù)對(duì)酶解前后樣品液的氨基酸組成進(jìn)行分析，雞肺樣品酶解后，絕大多數(shù)游離氨基酸含量均顯著上升（P<0.05），表明在胃蛋白酶的作用下，雞肺中蛋白質(zhì)在上述優(yōu)化得到的適宜條件下被水解，生成小分子多肽的同時(shí)釋放出了游離氨基酸。食物蛋白來(lái)源的生物活性肽其功能性與氨基酸的組成、序列及長(zhǎng)度有密切關(guān)系[30]。前人研究表明，抗氧化肽發(fā)揮抗氧化作用主要取決于分子較小的疏水性氨基酸[31]和芳香族氨基酸[32]，前者具有的親核側(cè)鏈以及后者具有的芳香族側(cè)鏈能夠作為電子供體提供氫原子，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，表現(xiàn)出一定的自由基清除能力。從表中可以看到酶解后樣品該類氨基酸含量均顯著高于酶解前樣品（P<0.05），疏水性氨基酸含量占氨基酸總量的44.88%，疏水性氨基酸的存在能夠增強(qiáng)小分子肽在脂肪體系中的溶解性，疏水與親水基團(tuán)使短肽分布在油水界面，加強(qiáng)肽與脂肪酸間的互相作用，對(duì)脂溶性的DPPH·顯示出清除作用。

表7 酶解前后樣品游離氨基酸組成Table 7 Free amino acid composition of samples before and after enzymatic hydrolysis

2.5 超濾法純化酶解液及其組分抗氧化活性評(píng)價(jià)

多肽不同分子量的組分具有不同的抗氧化能力，通常認(rèn)為分子質(zhì)量小的多肽相比于分子量大的肽具有更強(qiáng)的抗氧化能力[33]。為了獲得具有更高抗氧化活性的組分，有必要對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的純化。超濾技術(shù)利用膜的截留分子量不同，使得不同分子量范圍的組分分離，具有簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白的分離純化中[34]。不同分子量的超濾分級(jí)產(chǎn)物在濃度為2 mg/mL時(shí)的抗氧化能力見(jiàn)表8，由表可知分子量<3 kDa組分的DPPH·、ABTS+·清除能力和FRAP均顯著優(yōu)于其他兩個(gè)組分（P<0.05）。Onuh等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與大分子肽相比，小分子肽具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移電子或與自由基結(jié)合的能力，與本研究一致。鑒于<3 kDa的組分抗氧化能力最強(qiáng)，選擇該部分進(jìn)行肽分子量分布與肽序鑒定研究。

表8 超濾后不同組分的抗氧化活性Table 8 Antioxidant activities of different peptide fractions after ultrafiltration

2.6 肽分子量分布

肽分子量分布能夠反映多肽分子量的相對(duì)集中程度，是反映酶解與純化程度的重要指標(biāo)。采用高效液相系統(tǒng)配合凝膠色譜法相較于十二烷基硫酸鈉－聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法能夠更準(zhǔn)確地體現(xiàn)多肽在各個(gè)分子量范圍的相對(duì)含量[36]。圖7為液相色譜洗脫圖，經(jīng)過(guò)超濾后的雞肺抗氧化肽分子量范圍見(jiàn)表9，其中<3 kDa的組分分子量范圍及相對(duì)含量為：3000～2000 Da（2.48%）、2000～1000 Da（8.87%）、1000～500 Da（18.70%）、500～180 Da（55.44%）、<180 Da（12.56%）。從表中數(shù)據(jù)可知分子量<1000 Da的組分高達(dá)86.70%，表明酶解程度徹底，生成了較多低分子寡肽。Samaranayaka等[37]指出，大多數(shù)食物來(lái)源的抗氧化肽的分子量處于500～1800 Da之間。王璐莎在研究鴨肉蛋白源抗氧化肽時(shí)也表明分子量為500～2000 Da的寡肽擁有高于多肽的抗氧化能力[38]。由此可推斷雞肺肽抗氧化能力較強(qiáng)與其分子量較低密切相關(guān)。

圖7 雞肺抗氧化肽的凝膠色譜圖Fig.7 Gel chromatogram of the peptide from chicken lung

表9 雞肺抗氧化肽分子量分布Table 9 Molecular weight distribution of peptide from chicken lung

2.7 LC-MS/MS肽序測(cè)定與熱圖分析

為了進(jìn)一步明確雞肺抗氧化肽的氨基酸序列、肽序長(zhǎng)度、分子量等信息，探索抗氧化能力與其之間的相互關(guān)系，對(duì)超濾后的雞肺肽進(jìn)行LC-MS/MS序列測(cè)定，總質(zhì)子流圖和肽序信息見(jiàn)圖8和表10。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)食源性抗氧化肽的分子量介于500～1800 Da，由2～20個(gè)氨基酸組成[39]。從表10中數(shù)據(jù)可知，雞肺抗氧化肽的肽段絕大部分位于700～1800 Da，由5～17個(gè)氨基酸組成。除了較低的分子量以外，多肽的抗氧化活性還與疏水性氨基酸的比例密切相關(guān)。疏水性氨基酸主要包含Ala、Pro、Val、Leu、Ile、Trp、Met和Phe[40?41]。疏水性氨基酸在溶液體系中的存在能夠提高肽段在脂質(zhì)體系中的溶解度，加強(qiáng)肽段與脂溶性自由基如DPPH·的相互作用[42]。雞肺抗氧化肽片段整體疏水性較高，其中疏水殘基比≥50%的片段高達(dá)60.97%，與<3 kDa的組分具有最強(qiáng)的DPPH·清除能力相對(duì)應(yīng)。

圖8 雞肺抗氧化肽的總質(zhì)子流圖（TIC）Fig.8 Total ion chromatogram (TIC) of peptides from chicken lung

表10 雞肺肽組成分析Table 10 Analysis of peptide composition from chicken lung

氨基酸的排列順序也會(huì)對(duì)肽段的抗氧化能力產(chǎn)生影響[43–45]，當(dāng)疏水性氨基酸中的Val、Leu、Ile、Ala尤其是Val和Leu出現(xiàn)在N端時(shí)，肽段通常表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化能力[46]。從圖9可得到不同氨基酸殘基在肽段N端（C端）的出現(xiàn)頻率，N端出現(xiàn)頻率較高的氨基酸為：Leu、Val、Phe、Lys，C端僅出現(xiàn)兩種氨基酸殘基：Arg、Lys，值得注意的是共有20個(gè)肽段N端出現(xiàn)了Val和Leu，占到了N端總出現(xiàn)頻率的48.78%，說(shuō)明雞肺抗氧化肽具有良好的抗氧化潛力。Dong等[21]發(fā)現(xiàn)不同的氨基酸殘基具有不同的抗氧化能力，金屬離子的還原與螯合主要與≥15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽鏈和酸性氨基酸（Glu、Asp）、堿性氨基酸（His、Arg、Lys）相關(guān)，由此推測(cè)TSFGDAVKRADNLNK、VTNWDDMEKLWHGPCK、KMGDANLDNLGALQK等肽段賦予了雞肺肽一定的鐵還原能力。此外，Zheng等[47]發(fā)現(xiàn)ABTS+·的清除僅與Cys和Tyr有關(guān)，因此考慮雞肺的ABTS+·清除能力與肽段LYEETRRLVK、VTNWDDMEKLWHGPCK、KLTTPTYGDLAHR有關(guān)。

圖9 雞肺抗氧化肽N端（C端）氨基酸出現(xiàn)頻率熱圖Fig.9 Heat map of amino acid frequency of occurrence of N terminal (C terminal) of antioxidant peptide from chicken lung

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了雞肺的基本成分，其中蛋白質(zhì)含量為14.00 g/100 g，適合進(jìn)行酶解。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了影響胃蛋白酶酶解雞肺制備抗氧化肽自由基清除能力和粗肽含量的pH、時(shí)間和酶添加量。在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，最優(yōu)條件為pH3.60，酶添加量4200 U/g，酶解時(shí)間5 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)的DPPH·清除率和粗肽含量分別為94.96%和88.42%。雞肺酶解后疏水性氨基酸含量顯著增加（P<0.05）。超濾產(chǎn)物中<3 kDa的組分（主要分布于180～2000 Da）抗氧化能力最強(qiáng)。液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果顯示雞肺肽疏水性氨基酸殘基比>50%，Val、Leu占N端總出現(xiàn)頻率的48.78%。綜上所述，酶解制備的雞肺肽整體分子量較小，抗氧化效果好，研究結(jié)果希望為內(nèi)臟等副產(chǎn)品制備生物活性肽提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。