張麗美 劉云平 邱 麗 劉 瑾 鐘曉玲▲

1.深圳市中醫(yī)院婦科，廣東深圳 518033；2.深圳市中醫(yī)院超聲科，廣東深圳 518033；3.深圳市中醫(yī)院生殖健康科，廣東深圳 518033

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）臨床表現(xiàn)為經(jīng)量過少、閉經(jīng)腹痛、不孕或反復(fù)胚胎丟失等[1]。 宮腔手術(shù)的女性繼發(fā)IUA 的占比為25%～30%[2]。 西醫(yī)治療IUA 通常采用宮腔鏡下IUA 分離術(shù)及口服雌孕激素等方法，但中重度IUA 仍有一定的復(fù)發(fā)率[3]。 近年來， 許多文獻(xiàn)均報(bào)道，IUA 術(shù)后中西醫(yī)結(jié)合治療可明顯降低其IUA 復(fù)發(fā)率，且已有學(xué)者對該類文獻(xiàn)中核心處方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘[4-5]，但對中醫(yī)藥防治IUA 的具體機(jī)制及作用靶點(diǎn)仍不明確。 本研究選取治療IUA 的高頻中藥作為研究對象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其防治IUA 的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步解析， 期望能為臨證配伍和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 高頻中藥的統(tǒng)計(jì)

本研究以“宮腔粘連”“數(shù)據(jù)挖掘”或“組方規(guī)律”或“用藥規(guī)律”或“處方分析”作為檢索詞，收集建庫至2021年6月公開發(fā)表在中國知網(wǎng)、維普網(wǎng)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫有關(guān)中醫(yī)藥治療IUA 的數(shù)據(jù)挖掘類文獻(xiàn)。 全文均有明確的藥物累計(jì)頻次信息，統(tǒng)計(jì)文獻(xiàn)中高頻次中藥。

1.2 高頻中藥化學(xué)成分及靶點(diǎn)預(yù)測

從文獻(xiàn)研究中獲得治療IUA 的高頻中藥，設(shè)置生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（Traditional Chinse Medicine Systerms Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）篩選高頻中藥的全部化學(xué)成分及靶點(diǎn)蛋白，將去重后的藥物靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入通用蛋白數(shù)據(jù)庫Uniprot（https://www.uniprot.org）中，獲得高頻中藥對應(yīng)的人源基因靶點(diǎn)名稱。

1.3 IUA 疾病靶點(diǎn)篩選及靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

以“intrauterine adhesion”作為檢索詞，通過人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（https://www.genecards.org/）獲得IUA 疾病靶點(diǎn)，作為IUA 疾病基因數(shù)據(jù)庫。將藥物、藥物有效成分及疾病基因?qū)隒ytoscape 3.7.2 軟件中將其關(guān)系可視化。

1.4 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

通過Venny2.1 軟件獲得藥物與疾病的交集靶點(diǎn)，將其輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），來源設(shè)置為“Homo sapiens”，選擇minimum required interaction score 為high confidence 0.9，并勾選hide disconnected nodes in the network，獲取高頻中藥治療IUA 潛在作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 中進(jìn)行可視化顯示。同時(shí)在該軟件的CytoNVA 插件中篩選核心靶標(biāo)， 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選條件為：degree centrality（DC）、betweenness centrality（BC）、closeness centrality（CC）均大于中位數(shù)。

1.5 核心靶標(biāo)基因本體富集分析及基因組百科全書通路分析

通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霁@得的核心靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），種屬和背景選擇 “Homo sapiens”， 分別進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 通路富集分析，兩者均設(shè)定P＜0.01，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.01 作為篩選條件。 其中GO 富集內(nèi)容包括：生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）三個(gè)內(nèi)容，GO 富集分析結(jié)果采用R4.1.0 軟件輸出直方圖，KEGG 分析以氣泡圖形式體現(xiàn)。

1.6 分子對接驗(yàn)證

利用PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載Degree 值排列前3 位的核心靶點(diǎn)的3D 蛋白結(jié)構(gòu)文件，設(shè)置以下選擇條件：①Homo sapiens 來源；②分辨率≤2.5 A；③小分子配體信息詳細(xì)，蛋白結(jié)構(gòu)完整；④pH 值在人體正常生理范圍；⑤通過X-ray 方法解析。 將篩選后的蛋白結(jié)構(gòu)通過PyMol 2.3.0 軟件進(jìn)行預(yù)處理。 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載Degree 值排名前3位的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)文件。 將處理后核心蛋白結(jié)構(gòu)和小分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Autodock 1.5.6 軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 高頻中藥篩選結(jié)果

檢索得到2 篇中醫(yī)藥治療IUA 的數(shù)據(jù)挖掘類文獻(xiàn)[4-5]，分別統(tǒng)計(jì)兩篇文獻(xiàn)中排名靠前的高頻次中藥，結(jié)果見表1。 結(jié)果顯示，兩者的共同高頻中藥是當(dāng)歸、熟地黃、川芎、桃仁、紅花、牛膝，后文將以此作為研究對象。

表1 治療IUA 中藥復(fù)方中的藥物頻次統(tǒng)計(jì)

2.2 高頻中藥化學(xué)成分篩選

將高頻中藥當(dāng)歸、熟地黃、川芎、桃仁、紅花、牛膝分別作為檢索詞，運(yùn)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得全部化學(xué)成分， 去重并去除無對應(yīng)靶點(diǎn)成分后共納入50 個(gè)藥物活性化學(xué)成分，結(jié)果見表2。

表2 高頻中藥化學(xué)成分信息表

2.3 IUA 相關(guān)基因靶點(diǎn)及與藥物交集靶點(diǎn)

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取IUA 疾病靶點(diǎn)共3743 個(gè)。將“2.2”項(xiàng)下納入的50 個(gè)藥物化學(xué)活性成分導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫中，去重后獲得202 個(gè)人源基因靶點(diǎn)名稱。 運(yùn)用Venny 軟件選取交集，得到147 個(gè)高頻中藥治療IUA 的潛在作用靶點(diǎn)，結(jié)果見圖1。

圖1 藥物-疾病潛在作用靶點(diǎn)

2.4 藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中將其關(guān)系可視化。結(jié)果顯示， 按照Dgree 值排列前3 位的是豆甾醇、山奈酚、槲皮素，三者分別是高頻中藥治療IUA 的主要活性成分（圖2）。

圖2 藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 藥物-疾病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

將交集基因輸入STRING 數(shù)據(jù)庫， 得到藥物-疾病的PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3，包括138 個(gè)節(jié)點(diǎn)、492 條相互作用線，平均節(jié)點(diǎn)度為7.13，平均局部聚類系數(shù)為0.423。

圖3 高頻中藥治療IUA 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

采用CytoNCA 插件篩選核心靶標(biāo)， 其中各項(xiàng)中位數(shù)為：DC=5、BC=61.968、CC=0.174，共獲得64 個(gè)核心靶點(diǎn)。 按DC 排名前3 位的基因靶點(diǎn)是：TP53、STAT3、MAPK1， 提示這些靶點(diǎn)在高頻中藥治療IUA中尤為重要。 排名前5 位核心靶點(diǎn)結(jié)果見表3。

表3 按DC 排名前5 位的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

2.6 GO 富集分析

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示：BP92條，MF 22 條，CC 12 條，主要涉及凋亡過程、細(xì)胞增殖調(diào)控、藥物反應(yīng)等生物過程，胞質(zhì)、核漿、細(xì)胞外區(qū)域等細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能， 篩選排名前10 位的GO 富集進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖4。

圖4 排名前10 位GO 富集分析直方圖

2.7 KEGG 信號通路分析

核心靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫共獲得117 條富集通路，篩選后有83 條信號通路符合條件。 分析提示核心靶點(diǎn)與T 細(xì)胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll 樣受體信號通路等有關(guān)， 運(yùn)用微生信網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn）對篩選后的前30 條KEGG 通路結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見圖5。

圖5 核心靶點(diǎn)的KEGG 信號通路分析（前30 位）

2.8 分子對接結(jié)果

利用Autodock 軟件將主要成分豆甾醇、山奈酚、槲皮素與排名前3 位的核心靶點(diǎn)TP53、STAT3、MAPK1 進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表4，結(jié)果顯示，相互間的結(jié)合能均<-5.0 kcal/mol，提示核心靶點(diǎn)與化學(xué)成分間的對接均有較好的結(jié)合能力。并將結(jié)合活性強(qiáng)烈的豆甾醇與MAPK1 組輸入PyMol 軟件進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖6。

圖6 豆甾醇與MAPK1 分子對接結(jié)果

表4 不同核心靶點(diǎn)與化學(xué)成分分子對接的結(jié)合能（kcal/mol）

3 討論

腎虛血瘀為IUA 最主要病機(jī)[6]，數(shù)據(jù)挖掘類文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)出中醫(yī)學(xué)者治療IUA 時(shí)選取當(dāng)歸、 熟地黃、川芎、桃仁、紅花、牛膝等藥物的用藥頻次高，與腎虛血瘀病機(jī)相呼應(yīng)。 其中，位居首位的當(dāng)歸為補(bǔ)血要藥，同時(shí)具有行血之效，熟地黃為“至陰之藥”，善于滋補(bǔ)肝腎陰血；兩者互用補(bǔ)而不滯。 川芎、桃仁、紅花、牛膝為血府逐瘀湯的重要組成部分， 該方為治療血瘀證的經(jīng)典名方，除心腦血管疾病外，婦科疾病的應(yīng)用亦頗多[7]，且活血類中藥具有促進(jìn)血管新生、改善血液流變學(xué)、促進(jìn)內(nèi)膜局部血液循環(huán)、阻止粘連再次發(fā)生的效果[8-9]。 現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者選取此類中藥防治IUA，臨床療效十分滿意[10]。

中藥配伍后防治IUA 的具體作用機(jī)制不明，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)高頻中藥治療IUA 的有效成分主要是豆甾醇、山柰酚、槲皮素等，三者主要涉及炎癥-免疫反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控。豆甾醇可明顯抑制白介素（interleukin，IL）-1、IL-6 等以達(dá)到抗炎作用，且可下調(diào)相關(guān)信號通路起到抑制腫瘤的作用[11]。 山柰酚可抑制蛋白激酶活性，影響細(xì)胞增殖周期[12]。 槲皮素是最有效的抗氧化劑，可穿過細(xì)胞膜發(fā)揮抗炎及抑制細(xì)胞周期的作用[13]。 主要化學(xué)成分與TP53、STAT3、MAPK1 等靶點(diǎn)基因的關(guān)系尤為密切， 且通過分子對接驗(yàn)證主要化學(xué)成分與前三者均有較好的結(jié)合能力。 其中TP53 可促進(jìn)DNA 修復(fù)、使細(xì)胞周期停頓或凋亡[14]，STAT3 可促進(jìn)促血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號的生成，介導(dǎo)細(xì)胞的生長、凋亡等過程[15]。激活MAPK 家族可促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖，改善子宮內(nèi)膜容受性[16-17]。 核心靶點(diǎn)基因亦涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控，與高頻中藥的主要化學(xué)成分藥效不謀而合。 而目前IUA 的治療方法中， 除了物理隔離外， 包括干細(xì)胞、透明質(zhì)酸鈉的宮腔注射及血管擴(kuò)張劑、雌激素的口服應(yīng)用等均可促進(jìn)內(nèi)膜細(xì)胞增殖分化、 抑制內(nèi)膜局部炎癥的作用[18]。 通過GO 富集分析可預(yù)測，這些核心靶標(biāo)主要在胞質(zhì)、核漿、細(xì)胞外區(qū)域等位置發(fā)揮作用，并通過藥物反應(yīng)、凋亡過程、細(xì)胞增殖調(diào)控等生物過程發(fā)揮蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。

KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，高頻中藥治療IUA 可能通過上述核心靶標(biāo)誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子，激活T 細(xì)胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll 樣受體信號通路等發(fā)揮作用。 其中T 細(xì)胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路均為炎癥-免疫反應(yīng)通路，Toll 樣受體信號通路不僅參與炎癥反應(yīng)，對內(nèi)源性損傷模式分子亦有識別作用，參與非特異性免疫[19]。 PI3K-Akt 信號通路生理狀態(tài)下表達(dá)低下，當(dāng)細(xì)胞損傷后，會(huì)迅速激活促進(jìn)細(xì)胞增殖[20]。

綜上所述， 現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者防治IUA 選取的高頻中藥可能通過調(diào)控內(nèi)膜細(xì)胞周期、 局部炎癥-免疫調(diào)節(jié)等生物環(huán)節(jié)起到預(yù)防IUA 復(fù)發(fā)的作用。 本研究為中醫(yī)藥治療IUA 臨證選藥及實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持，但本研究同時(shí)存在一定不足， 如未對文獻(xiàn)質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)、文獻(xiàn)中臨床藥方有限，研究樣本量少，尚處于理論層面， 對高頻中藥治療IUA 的作用機(jī)制仍需開展實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。