周 爽 蘇小珊 林國福 劉怡飛 高宏志

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床分子診治研發(fā)中心，福建泉州 362000

肺癌對于當今世界來說，仍是一個嚴峻的挑戰(zhàn)，在臨床當中， 肺癌的發(fā)病率和病死率都高居癌癥首位，而且已經(jīng)呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[1]。 巨囊性病液體蛋白-15（gross cystic disease fluid protein 15，GCDFP-15）又名泌乳素誘導(dǎo)蛋白（prolactin-inducible protein，PIP），是一個約17 kDa 的蛋白， 由許多正常的大泌腺細胞分泌，存在于精漿、唾液、淚液、眼淚、汗腺中。GCDFP-15 在乳腺癌中廣泛表達， 作為該疾病的組織病理學(xué)診斷標志物[2-4]。 純化的GCDFP-15 可促進乳腺癌細胞的生長[3]。除了細胞增殖，GCDFP-15 介導(dǎo)了乳腺癌細胞的侵襲， 這一過程部分依賴于其天冬氨酸蛋白酶活性[5]。

GCDFP-15 雖然是一個小蛋白，但其生物功能多樣，已知其在免疫調(diào)節(jié)、生育力、抗菌活性、細胞凋亡和腫瘤進展中起著至關(guān)重要的作用。一方面它可與T 淋巴細胞、巨噬細胞和精子表面的CD4 受體結(jié)合[6]。另一方面，GCDFP-15 具有免疫調(diào)節(jié)功能，GCDFP-15缺乏的小鼠出現(xiàn)淋巴器官出現(xiàn)異常[7]。 GCDFP-15 與來自幾個屬的細菌結(jié)合，這表明這種糖蛋白也可能參與先天免疫和保護宿主免受微生物感染。 其次，GCDFP-15 具有天冬氨酸蛋白酶活性，可降解纖維連接蛋白，提示其在惡性腫瘤進展中的重要作用[3]。

在腫瘤研究中，GCDFP-15 乳腺癌和前列腺癌的增生和轉(zhuǎn)移過程起作用[8-10]，且在乳腺癌中的過表達與癌的預(yù)后有關(guān)。除了乳腺癌和前列腺癌，GCDFP-15在其他惡性腫瘤中也有異常的表達[11-13]。 GCDFP-15也被用于區(qū)分口腔、乳腺和結(jié)腸的原位腫瘤[14]。 研究顯示，GCDFP-15 提示胰腺癌、 肝癌與乳腺癌的轉(zhuǎn)移[3，13，15]。 免疫組織化學(xué)法顯示GCDFP-15 在腦的腺癌和肺上皮癌也有過表達[8，16]。 此外，GCDFP-15 還被用于識別來源于乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移癌[3，8]。GCDFP-15 在圓錐角膜中的潛在治療作用被確定[17-18]。 盡管如此，GCDFP-15 在乳腺癌以外的癌癥中的作用研究較少，在肺癌中更少。早期研究GCDFP-15 在正常支氣管黏膜下腺和支氣管上皮中表達，而在肺癌中的作用和表達情況并不清楚。本研究旨在檢測肺癌及正常對照組血漿中的GCDFP-15 蛋白水平以及肺癌細胞系、支氣管上皮細胞系中的GCDFP-15 mRNA 和蛋白水平，探討GCDFP-15 在肺癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2020年10月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的54 例肺癌患者作為研究對象，其中男34 例（62.96%），女20 例（37.04%）；年齡44～89 歲；鱗癌22 例（40.74%），腺癌32 例（59.26%）。納入標準： ①患者經(jīng)手術(shù)組織病理檢驗證實為肺癌；②患者對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①合并其他腫瘤或精神障礙者；②術(shù)前接受過局部放療、全身化療或其他抗腫瘤治療者；③資料不完整者。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審核批準。選取同期21 例體檢健康者，其中男13例（61.90%），女8 例（38.10%），平均年齡（39.63±3.52）歲。納入標準：①年齡18～55 歲的健康成年人；②無腫瘤或其他慢性病，2年內(nèi)常規(guī)體檢指標均正常者。 用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測所有受試者血漿中的GCDFP-15。

從上海細胞庫購置5 株細胞系， 用于培養(yǎng)和檢測。 細胞系信息見表1。

表1 細胞系信息

1.2 方法

1.2.1 基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫分析肺癌中的泌乳素誘導(dǎo)蛋白的表達差異 從生物信息數(shù)據(jù)庫TCGA 中的腫瘤大數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站GEPIA 中查詢GCDFP-15 在肺癌組織和癌旁組織中的表達（癌旁組織59 例，肺癌組織515 例），同時分析GCDFP-15 不同表達水平的肺癌患者的預(yù)后情況。 依據(jù)肺癌分型，對肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC） 分別查詢GCDFP-15 在癌組織與癌旁組織中的表達差異。

1.2.2 ELISA 將入組的血漿樣本50 μl 及試劑盒配備的標準品嚴格按照GCDFP-15 ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司；貨號：JL14570）說明書進行實驗。 Thermo Scientific Multiskan Sky 全波長酶標儀檢測450 nm 波長的OD 值，所得數(shù)據(jù)依照試劑盒說明書的方法在Curve Expert 1.4 中進行分析計算， 并用GraphPad Prism 7.0 進行數(shù)據(jù)可視化和統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.3 細胞系與培養(yǎng) H1975、H520、H460、A549 以及16HBE 細胞在含有1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2保持飽和濕度培養(yǎng)， 隔天換液，待細胞密度80%～90%時常規(guī)傳代。

1.2.4 Western blot 各組6 孔細胞培養(yǎng)板中的細胞傳代2 次后，收集對數(shù)生長期的細胞，用蛋白提取試劑盒（Solarbio Life Science；貨號：BC3711）提取總蛋白， 提取的總蛋白經(jīng)BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（Solarbio Life Science；貨號：PC0020）測定其蛋白濃度， 取50 μg 總蛋白樣品進行SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜于PVDF 膜，經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封阻2 h 后， 按抗體說明書的稀釋比稀釋一抗GCDFP15 （Abcam 公司； 貨號：ab133290） 和內(nèi)參α-Tubulin（Abcam 公司； 貨號：ab7291），4℃搖動孵育過夜，加抗兔/鼠二抗，室溫下?lián)u動1.5 h，用1×TBST 緩沖液洗3 次，每次5 min，ECL 化學(xué)曝光顯影。 將膜置于GE Image Quant LAS4000 mini 成像系統(tǒng)上掃描目的條帶和內(nèi)參條帶，經(jīng)Image J 系統(tǒng)分析GCDFP15 和內(nèi)參α-Tubulin 蛋白表達量。

1.2.5 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR） 提取細胞中的總RNA，用Thermo Scientific Multiskan Sky 全波長酶標儀測定濃度和純度后備用。 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara；貨號：RR047A）說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照TB GreePremix Ex TaqTM試劑盒（Takara；貨號：RR420A）說明書的操作步驟，通過ABI Quant Studio 5 PCR儀檢測GCDFP-15 的mRNA 水 平。GCDFP-15 的正向引物為5′-TCAGGACAACACTCGGAAGA-3′，反向引物為5′-CGTCACATAGGCAGGCAGTA-3′，GAPDH 的正向引物為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反向引物為5′-AGGGGCCATCCAC-AGTCTTC-3′。 qPCR 反應(yīng)體系包括1 μl cDNA樣品、10 μl TB Green PCR Master Mix 和0.4 μl 正、反向引物。 反應(yīng)循環(huán)條件謹遵TB GreenPremix Ex TaqTM試劑盒（Takara；貨號：RR420A）說明書。 以GAPDH作為內(nèi)參照， 采用2-ΔΔCT法分析GCDFP-15 mRNA 的表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析肺癌中的GCDFP-15 的表達差異

2.1.1 LUAD 和LUSC 中腫瘤組織和癌旁組織的GCDFP-15 轉(zhuǎn)錄組水平的比較 TCGA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)查詢結(jié)果顯示，在肺腺癌中，癌組織與癌旁組織的GCDFP-15 mRNA 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；肺鱗癌中，癌組織與癌旁組織的GCDFP-15 mRNA 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 LUAD 和LUSC 中腫瘤組織和癌旁組織的GCDFP-15 轉(zhuǎn)錄組水平的比較

2.1.2 LUAD 和LUSC 中不同臨床分期患者肺癌組織中GCDFP-15 轉(zhuǎn)錄組水平的比較 LUSC 中，Ⅰ～Ⅲ期癌組織的GCDFP-15 mRNA 低于癌旁組織， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅳ期癌組織與癌旁組織的GCDFP-15 mRNA 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。LUAD 中，Ⅲ期癌組織中的GCDFP-15 mRNA 與癌旁組織比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期癌組織的GCDFP-15 mRNA 均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 LUAD 和LUSC 中不同臨床分期患者肺癌組織中GCDFP-15轉(zhuǎn)錄組水平的比較

2.1.3 GCDFP-15 高表達肺癌組與GCDFP-15 低表達肺癌組生存期的比較 低表達組的中位生存期為109 個月，高表達組的中位生存期為90 個月，兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.054）（圖3）。

圖3 GCDFP-15 高表達肺癌組與GCDFP-15 低表達肺癌組生存期的比較

2.2 肺癌與正常對照組血漿中GCDFP-15 濃度的比較

經(jīng)ELISA 檢測血漿中GCDFP-15 的含量，54 例肺癌患者血漿中的GCDFP-15 含量為（62.12±7.159）ng/ml，高于21 例正常對照組的（42.27±4.21）ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。 鱗癌組和腺癌組的GCDFP-15 含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 ELISA 方法檢測肺癌患者及正常對照組的血漿GCDFP-15含量

2.3 肺癌細胞系（4 株）與支氣管上皮細胞系（1 株）中GCDFP-15 mRNA 水平的比較

5 株細胞RT-qPCR 檢測GCDFP-15 mRNA 的表達情況，結(jié)果如圖5 所示，其中16HBE（人支氣管上皮樣細胞）未檢測到GCDFP-15 mRNA，A549（人非小細胞肺癌細胞）、H520（人肺鱗癌細胞）的GCDFP-15 mRNA 含量高于H460（人大細胞肺癌細胞）、H1975（人肺腺癌細胞），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。4 株肺癌細胞株的GCDFP-15 mRNA 含量均高于16HBE，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 RT-qPCR 方法比較5 株細胞系中GCDFP-15 mRNA 的表達差異

2.4 肺癌細胞系（4 株）與支氣管上皮細胞系（1 株）中GCDFP-15 蛋白水平的比較

收集5 株細胞， 采用Western blot 檢測GCDFP-15 及內(nèi)參tubulin 基因的表達，結(jié)果如圖6 所示，7 次檢測，均未能檢測到特異性條帶。

圖6 Western blot 檢測5 株細胞中GCDFP-15 蛋白的表達（重復(fù)7 次的結(jié)果）

2.5 肺癌細胞系（4 株）與支氣管上皮細胞系（1 株）培養(yǎng)基上清中GCDFP-15 蛋白水平的比較

收集5 株細胞的培養(yǎng)基上清，用ELISA 法檢測其中GCDFP-15 蛋白的含量， 結(jié)果顯示A549 和H460細胞培養(yǎng)基上清中的GCDFP-15 蛋白水平均高于16HBE，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；H520、H1975 與16HBE 的GCDFP-15 蛋白水平比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖7）。

圖7 ELISA 法檢測5 株細胞系培養(yǎng)基上清中的GCDFP-15 蛋白含量

3 討論

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因，非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%， LUAD 和LUSC是最常見 的NSCLC 類 型。GCDFP-15 在乳腺的病理狀態(tài)和一些外分泌組織中表達，如淚腺、唾液腺和汗腺[19]。 其在抗菌、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤進程中均發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[20]。 研究發(fā)現(xiàn)GCDFP-15 在乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中出現(xiàn)過表達現(xiàn)象，且提示GCDFP-15 與腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤也有關(guān)系[2]。

GCDFP-15 在肺癌中的研究十分有限。Osawa 等[19]利用序列特異性引物對多種組織進行RT-qPCR 檢測，發(fā)現(xiàn)GCDFP-15 基因在腦、肺、肝、脾、心臟、骨骼肌、腎、胃、子宮和卵巢中的表達可以忽略不計。 另一方面，它在淚腺、腮腺、舌下、頜下腺、乳腺和精囊中大量表達。 免疫組織化學(xué)分析顯示GCDFP-15 在腦腺癌[9]和肺腺癌[21]中過表達。

本研究為明確GCDFP-15 在肺癌中的表達情況，首先利用TCGA 數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)LUAD 和LUSC 中的GCDFP-15 的表達趨勢不同，GCDFP-15 低表達組顯示出比高表達組更高的中位生存期，這是肺癌組織標本的結(jié)果，血漿樣本的結(jié)果可能不同。 應(yīng)用ELISA方法檢測肺癌患者及正常對照組的血漿GCDFP-15含量， 發(fā)現(xiàn)肺癌組的GCDFP-15 含量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 但是通過血漿提取GCDFP-15 mRNA 得到的是陰性的結(jié)果，這很可能是因為該蛋白屬于分泌型，mRNA 并未被轉(zhuǎn)運到細胞外。文獻報道稱人和嚙齒動物的GCDFP-15 基因在外分泌器官中表達，并通過分泌囊將GCDFP-15 轉(zhuǎn)移到這些器官的液體分泌物中[20]。因此mRNA 在血漿中本身就幾乎不存在，無法被檢測到。

本研究利用4 株肺癌細胞和1 株支氣管上皮細胞系進行實驗，分別以RT-qPCR 和Western blot 技術(shù)檢測細胞中的GCDFP-15 mRNA 和蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 株肺癌細胞中的GCDFP-15 mRNA 均高于支氣管上皮細胞系， 且不同的肺癌細胞系之間也有差異。但是Western blot 卻得到了陰性的結(jié)果，GCDFP-15為特異性囊腫病液體蛋白15，分泌型，分子量約17 kDa，抗體說明書檢測條帶介于15～20 kDa， 檢測難度大。考慮該蛋白分泌至培養(yǎng)基里，本研究嘗試使用ELISA檢測培養(yǎng)基上清中的GCDFP-15 蛋白，得到的結(jié)果均為陽性，但是由于培養(yǎng)基內(nèi)含有胎牛血清，胎牛血清本身是否含有GCDFP-15，值得考量，經(jīng)文獻調(diào)研和血清廠家的咨詢， 均無確鑿的證據(jù)表明血清中自帶GCDFP-15，后續(xù)實驗可以考慮用無/低血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，或設(shè)置一個放置培養(yǎng)箱中但不鋪細胞的空培養(yǎng)基作為對照組來消除血清干擾的問題。 另外，不同細胞系的大小、生長速度不盡相同，除了控制鋪板時的細胞數(shù)，對于檢測GCDFP-15 前的細胞密度不便于統(tǒng)計，所以，在培養(yǎng)基上中檢測GCDFP-15 如何精準定量是個值得思考的問題。后續(xù)實驗將從三個方面入手進行優(yōu)化，以期得到更精準有效的結(jié)果：首先，擴大入組樣本量； 其次， 增加肺癌患者的唾液樣本進行GCDFP-15 檢測；最后，在細胞水平的實驗中，努力優(yōu)化條件（如無血清培養(yǎng)等），力爭更科學(xué)、有效地檢測培養(yǎng)基上清液中的GCDFP-15 蛋白。

綜上所述，本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)庫對肺癌組織中的GCDFP-15 轉(zhuǎn)錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)GCDFP-15 低表達組顯示出比高表達組更高的中位生存期；結(jié)合肺癌患者血漿標本以及肺癌細胞系的檢測結(jié)果，初步確定GCDFP-15 在肺癌患者血漿中呈現(xiàn)特異性表達升高的趨勢，提示GCDFP-15 可能是肺癌外周血中的腫瘤標志物，但此次研究樣本量偏小，結(jié)論需得到臨床更大樣本量的驗證。