李亞南 金春明 宮方巖 高 宇 鄧 夢 張 航 丁鑫哲 尹貴彬

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157000；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江牡丹江 157000

乳腺癌居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位，也是女性患癌死亡的主要原因[1]。有研究表明，患有良性乳腺疾病的女性， 在長達(dá)15年的時間里都有較高的轉(zhuǎn)為乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。MicroRNA（miR）是一種調(diào)控分子，可監(jiān)督各種過程和基因表達(dá)，miR 可以通過干擾細(xì)胞活動來正向或負(fù)向調(diào)節(jié)乳腺腫瘤形成[3]，因此，miR 顯示出了其用作監(jiān)測乳腺癌的生物標(biāo)志屬性。近年國內(nèi)外研究表明，miR-501-5p 通過多種信號通路在多種癌癥中起重要作用，但在乳腺癌中的作用尚未發(fā)現(xiàn)。 哺乳動物L(fēng)AMTOR5 是一種高度保真的、約18 kDa 的蛋白，其最初被鑒定為乙型肝炎X 蛋白相互作用蛋白（hepatitis B virus X -interacting protein，HBXIP）[4]。LAMTOR5 與致癌基因c-Myc、p53、survivin 相關(guān)，可發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及抗凋亡作用[5-7]。 miR-501-5p與LAMTOR5 兩者間相關(guān)性尚未有研究發(fā)現(xiàn)。 本研究旨在通過探討miR-501-5p 在乳腺癌患者組織及血清中的表達(dá)水平、LAMTOR5 在乳腺癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)以及miR-501-5p 與LAMTOR5 之間的相關(guān)性，為乳腺癌的早期臨床診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年3月至2021年3月牡丹江市腫瘤醫(yī)院收治的40 例初次診斷為乳腺癌的患者為乳腺癌組，收集其初次手術(shù)切除的癌組織、癌旁組織及血清，選取同期在牡丹江市牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院體檢的40 名體檢者為健康對照組，采集其血清。新鮮組織標(biāo)本于液氮中轉(zhuǎn)運(yùn)，保存于-80℃冰箱。乳腺癌組中，平均年齡（54.15±10.99）歲；健康對照組均為女性，平均年齡（53.13±8.09）歲，兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)且所有患者及家屬均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有乳腺癌患者首次經(jīng)病理組織活檢診斷為原發(fā)性乳腺癌；②乳腺癌患者手術(shù)切除病灶前未接受放療及化療等治療措施；③乳腺癌患者臨床病歷資料完備； ④健康體檢者過去3 個月無癌癥史，無住院治療記錄，無其他良性乳腺疾?。虎萁】刁w檢者未處于孕期或哺乳狀態(tài)。

排除標(biāo)準(zhǔn)： ①患有其他慢性疾病及其他腫瘤患者；②非女性患者。

臨床數(shù)據(jù)癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）表達(dá)水平、糖類抗原153（carbohydrate antigen，CA153）表達(dá)水平、糖類抗原125（carbohydrate antigen，CA125）表達(dá)水平、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）表達(dá)情況、雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達(dá)情況、孕激素受體（progesterone receptor，PR）表達(dá)情況來自醫(yī)院病理數(shù)據(jù)。

1.2 主要試劑及設(shè)備

Trizol 總RNA 提取試劑（批號：Lot20210525C）、miR-501-5p SYBR 兩步法試劑盒（批號：Lot20210625）均購自上海艾博思生物科技有限公司；PCR 儀（型號：MX3000P）購自美國Aligent Stratagene 公司；LAMTOR5抗體（貨號：14492-1-AP）購自武漢三鷹生物有限公司；脫水機(jī)（型號：JT-12J）、包埋機(jī)（型號：JB-L5）購自武漢俊杰電子有限公司；顯微鏡（型號：eclipse Ci-e）購自日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 MiR-501-5p 檢測 實(shí)時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法檢測乳腺癌組織、癌旁組織、 實(shí)驗(yàn)組血清及對照組血清中miR-501-5p 水平，先經(jīng)總RNA 提取試劑盒（Trizol 法）提取血清總RNA， 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA， 再進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)。 qRT-PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸40 s，共40 個循環(huán)，采用2-△CCT計(jì)算miR-501-5p 表達(dá)量。

1.3.2 LAMTOR5 定性檢測 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)定性檢測乳腺癌組織及癌旁組織中LAMTOR5 表達(dá)情況。 組織制成切片后烘干，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、3%過氧化氫水溶液中孵育、PBS 洗滌3 次， 再將切片置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液中修復(fù)抗原、PBS 洗滌滴加封閉液后室溫封閉。 滴加一抗， 陰性對照以PBS 代替，切片置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。 PBS 洗滌、滴加二抗，室溫孵育。 PBS 洗滌后滴加DAB 顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，見棕黃色即蒸餾水沖洗切片終止染色。 蘇木精復(fù)染3 min、鹽酸酒精分化、蒸餾水沖洗、梯度乙醇脫水、中性樹膠封片。

1.4 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

①比較乳腺癌患者癌組織與癌旁組織的miR-501-5p 表達(dá)水平；②比較乳腺癌組和健康對照組的血清miR-501-5p、CEA、CA153、CA125 表達(dá)水平；③比較不同臨床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 的表達(dá)水平；④LAMTOR5 在乳腺癌組織和癌旁組織中表達(dá)情況；⑤LAMTOR5 和miR-501-5p 在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性；⑥判斷miR-501-5p 的診斷效能，繪制ROC 曲線，ROC 曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的指標(biāo)， 以敏感度為縱坐標(biāo)，（1-特異度）為橫坐標(biāo)繪制成曲線，AUC 越接近1，診斷準(zhǔn)確性越高。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 檢驗(yàn)； 繪制ROC 曲線判斷miR-501-5p 的診斷效能；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-501-5p 表達(dá)水平的比較

miR-501-5p 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平為（1.12±0.23），在癌旁組織中的表達(dá)水平為（0.96±0.15），其在乳腺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

圖1 乳腺癌組織與癌旁組織中MiR-501-5p 表達(dá)水平的比較

2.2 乳腺癌組與健康對照組血清中miR-501-5p 表達(dá)水平的比較

乳腺癌組血清中miR-501-5p 的表達(dá)水平為（0.96±0.17），健康對照組血清中miR-501-5p 的表達(dá)水平為（0.88±0.12），乳腺癌患者血清中miR-501-5p的表達(dá)水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

圖2 乳腺癌組與健康對照組血清中miR-501-5p 表達(dá)水平的比較

2.3 乳腺癌組與健康對照組血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的比較

乳腺癌組血清中CEA、CA153、CA125 表達(dá)水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 乳腺癌組與健康對照組血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的比較（±s）

表1 乳腺癌組與健康對照組血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的比較（±s）

注 CEA：癌胚抗原；CA153：糖類抗原153；CA125：糖類抗原125

乳腺癌組健康對照組t 值P 值40 40 4.33±4.72 1.21±0.65 4.182＜0.001 25.31±48.35 9.06±5.10 2.114 0.041 29.17±49.59 10.90±2.95 2.326 0.025組別 例數(shù) CEA（ng/ml） CA153（U/ml）CA125（U/ml）

2.4 不同臨床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表達(dá)水平的比較

miR-501-5p 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期Ⅲ、 Ⅳ期患者中的表達(dá)水平高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 乳腺癌患者不同年齡、Her-2、ER、PR 表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

表2 不同臨床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表達(dá)水平的比較（±s）

表2 不同臨床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表達(dá)水平的比較（±s）

注 ER：雌激素受體；PR：孕激素受體；Her-2：人類表皮生長因子受體2

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2.5 LAMTOR5 在乳腺癌組織和癌旁組織中表達(dá)情況的比較

運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測LAMTOR5 在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，LAMTOR5 主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，染色呈棕黃色為陽性（圖3）。LAMTOR5 在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為77.5%，高于癌旁組織的陽性率15.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

圖3 LAMTOR5 在乳腺癌組織中的表達(dá)情況

表3 LAMTOR5 在乳腺癌組織及癌旁組織中表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.6 MiR-501-5p 表達(dá)水平與LAMTOR5 表達(dá)情況的相關(guān)性

通過Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-501-5p 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與LAMTOR5 的陽性表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）（表4）。

表4 miR-501-5p 表達(dá)水平與LAMTOR5 表達(dá)情況的相關(guān)性

2.7 ROC曲線分析血清中CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 在乳腺癌中的診斷價值

為進(jìn)一步判斷CEA、CA153、CA125 及miR-501-5p 四者對乳腺癌的檢驗(yàn)診斷效能，用ROC 曲線對四項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4、表5。 在四項(xiàng)指標(biāo)中，CEA 的AUC 最大，CEA、CA153、CA125 及miR-501-5p 四項(xiàng)聯(lián)合的AUC 大于CEA、CA153 及CA125 三項(xiàng)聯(lián)合診斷。

表5 CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 在乳腺癌中的診斷效能

圖4 血清中CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 診斷乳腺癌中的ROC 曲線圖

3 討論

據(jù)估計(jì)，2020年全球發(fā)生了1930 萬新癌癥病例，近1000 萬癌癥死亡病例，其中女性乳腺癌已經(jīng)超過肺癌——成為最常被診斷出的癌癥，約230 萬[8]。乳腺癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷是提高乳腺癌患者生存率的重要因素之一。 手術(shù)治療、藥物治療及輔助放療等治療手段的逐漸成熟，提高了早期發(fā)現(xiàn)患者的生存率。

癌基因和抑癌基因的改變決定了癌癥的發(fā)生，這些基因表達(dá)可以通過miR 進(jìn)行調(diào)控[9]。 自2002年發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制性miR 以來， 先后發(fā)現(xiàn)多種miR 的失調(diào)參與腫瘤發(fā)生的啟動，癌癥的進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，其中也包括乳腺癌[10]。 本研究的主要研究對象miR-501-5p 是一種有多種調(diào)控作用的非編碼RNA， 可以與多種靶mRNA 的3’非編碼區(qū)（3’UTR）結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種通路以達(dá)到致癌作用[11-12]。 本研究采用qRTPCR 技術(shù)檢測了miR-501-5p 的表達(dá)情況，乳腺癌組織中miR-501-5p 表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；乳腺癌患者血清中miR-501-5p表達(dá)水平高于健康對照人群血清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 提示miR-501-5p 在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到了致癌作用，可以作為一個潛在的乳腺癌血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物。 為進(jìn)一步了解miR-501-5p 的作用機(jī)制， 結(jié)合其與乳腺癌臨床病理特征間關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌臨床TNM 分期有關(guān)（P＜0.05），與年齡、ER、PR、Her-2 表達(dá)均無關(guān)（P＞0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床TNM 分期是提示患者預(yù)后不良的指標(biāo)，miR-501-5p 的表達(dá)水平隨著臨床TNM 分期的增加而增加且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增加， 這表明miR-501-5p 的高表達(dá)可能提示患者乳腺癌病程深甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移。大量文獻(xiàn)表明，多種腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測，可以提高乳腺癌的檢出率、降低誤診率[13-14]，再配合影像學(xué)檢查，將大大提高乳腺癌的診斷準(zhǔn)確性[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-501-5p 與傳統(tǒng)血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物CEA、CA153、CA125 四項(xiàng)聯(lián)合檢測的診斷效能明顯高于各項(xiàng)單獨(dú)診斷乳腺癌的效能，同時也高于CEA、CA153、CA125 三者聯(lián)合診斷乳腺癌的診斷效能，這提示四者有望成為一種新的乳腺癌早期診斷標(biāo)志物組合。

LAMTOR5 在多種癌癥中高表達(dá)， 大量研究均表示其與一系列臨床病理特征和不良預(yù)后相關(guān)[17-20]。 本研究運(yùn)用免疫組化法對癌組織中LAMTOR5 的表達(dá)進(jìn)行分析，癌組織中的LAMTOR5 陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,提示其對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有作用，且miR-501-5p 與LAMTOR5的表達(dá)呈正相關(guān)， 提示miR-501-5p 可能通過靶向LAMTOR5 對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展起到正向調(diào)節(jié)作用，但具體靶向方式還有待在日后的研究中加以證實(shí)。

綜上所述，miR-501-5p 和LAMTOR5 在乳腺癌中可能起致癌作用。本研究不足之處在于總標(biāo)本量較小， 且僅初步研究了miR-501-5p 和LAMTOR5 在實(shí)驗(yàn)組及對照組中的差異表達(dá)， 未進(jìn)一步研究miR-501-5p 與其靶標(biāo)LAMTOR5 的具體作用機(jī)制。 若能深入研究兩者的作用方式，miR-501-5p 及LAMTOR5可能為乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)及治療提供新思路。