孟憲宇， 路來金， 陳煥新

周圍神經(jīng)損傷是臨床上的常見病、多發(fā)病、也是疑難病，患者多為青壯年，常繼發(fā)于切割傷、車禍傷、工礦事故傷，遠(yuǎn)期高殘障率是困擾國內(nèi)外醫(yī)生的難題。目前中國周圍神經(jīng)損傷后殘障患者數(shù)量接近2000萬，且以每年近200萬人次的速度遞增。如何有效修復(fù)周圍神經(jīng)損傷，是公共衛(wèi)生領(lǐng)域迫切需要解決的問題，也是我國及全球范圍內(nèi)社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大需求[1]。

周圍神經(jīng)的混合束包含感覺束與運(yùn)動束，受創(chuàng)傷致斷裂后，臨床醫(yī)生只能憑經(jīng)驗(yàn)盲目地吻合斷裂的神經(jīng)遠(yuǎn)近端，很多情況下錯誤地將感覺束和運(yùn)動束、運(yùn)動束和感覺束對端縫合在一起，術(shù)后神經(jīng)功能的障礙或喪失給患者造成巨大的痛苦，迄今為止，還沒有臨床術(shù)中可用的鑒別神經(jīng)功能束的方法[2]。標(biāo)記是鑒別的方法，而標(biāo)記的前提是找到組成上的相對特異。周圍神經(jīng)的感覺束與運(yùn)動束到底有沒有組成上的差異，至今還沒有應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行篩選周圍神經(jīng)感覺束與運(yùn)動束不同時間點(diǎn)的差異蛋白的相關(guān)研究或報導(dǎo)，本課題組應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)用于篩選感覺束與運(yùn)動束的特異蛋白，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 鼠齡6 w、體重250～280 g，雄性，健康清潔級Wistar大鼠，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。術(shù)前、術(shù)后在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，溫度22 ℃～26 ℃，12 h間隔照明，自由飲水?dāng)z食。所有動物實(shí)驗(yàn)都符合國際實(shí)驗(yàn)動物使用指導(dǎo)規(guī)范的章程，且得到吉林大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心的批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 蛋白定量試劑盒，除雜質(zhì)試劑盒，Cy2、Cy3、Cy5熒光染料，兩性電解質(zhì)等，皆為Amersham Bioscience公司產(chǎn)品。熒光定量PCR通用試劑盒，為北京博奧生物公司產(chǎn)品。Ultrospec 3300 Pro分光光度，EttanIPGphor等電聚焦儀，EttanDALT Six電泳系統(tǒng)(GE)，Typhoon系列多功能激光掃描成像系統(tǒng)(GE)，凝膠圖像掃描儀(GE)，DeCyder差異分析軟件，Ettan picker斑點(diǎn)切膠儀，Ettan picker點(diǎn)樣儀，Ettan MALDI-TOF質(zhì)譜儀等皆為GE-Healthcare-Biosciences。

1.3 周圍神經(jīng)新鮮與陳舊性損傷動物建模 30只Wistar大鼠，10只為一組，分為3組。3組同時取材，以實(shí)現(xiàn)同一時間段切取同一大鼠相應(yīng)組織。按照0.3 ml/100 g體重的比例給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉。鼠面向上固定于解剖顯微鏡下，雙下肢互成90°略帶張力展開固定。無菌條件下取骼腹股溝斜行切口，鈍性分離暴露股神經(jīng)，股神經(jīng)運(yùn)動支(運(yùn)動束)長約6 mm，直徑約2 mm，恒定分為3束，用顯微鑷子觸碰有明顯肌顫反應(yīng)，在入肌處銳性剪斷,得到約5 mm的股神經(jīng)運(yùn)動支。股神經(jīng)在骼腹股溝處分出隱神經(jīng)(感覺束)，隱神經(jīng)剛分出時直徑約1 mm，向遠(yuǎn)端走行逐漸變細(xì)，在髕骨下逐漸移行于皮下支配皮膚，把髕骨下緣作為標(biāo)志向遠(yuǎn)端游離，得到約5 mm的隱神經(jīng)。在手術(shù)顯微鏡下自主干分出處銳性剪斷運(yùn)動支，在髕骨下銳性剪斷隱神經(jīng)，造成周圍神經(jīng)股神經(jīng)運(yùn)動支和隱神經(jīng)Sunderland V損傷的動物模型(見圖1)。取下的股神經(jīng)運(yùn)動支和隱神經(jīng)分別放置保存管中并做好標(biāo)記，迅速投入到液氮中,保存于-80 ℃冰箱中備用。

Wistar大鼠正常股神經(jīng)運(yùn)動支和隱神經(jīng)顯露和取材(A～C)；Wistar大鼠股神經(jīng)運(yùn)動支和隱神經(jīng)Sunderland V損傷8 h模型制備和取材(D～F)；Wistar大鼠股神經(jīng)運(yùn)動支和隱神經(jīng)Sunderland V損傷8 d模型制備和取材(G～I(xiàn))圖1 Wistar大鼠周圍神經(jīng)模型制備及取材

1.4 實(shí)驗(yàn)處理 神經(jīng)組織解凍后,分別取每個樣本約300 mg的組織塊，保證每個樣品最終能提取蛋白質(zhì)1 mg以上。DIGE樣品的純化，DIGE樣品的定量，蛋白樣品分別來自6種神經(jīng)組織樣本，其中每種神經(jīng)組織樣本都分3組，每種樣品進(jìn)行3次重復(fù),共計(jì)18組神經(jīng)組織蛋白樣本,分別避光進(jìn)行Cy2、Cy3、Cy5熒光標(biāo)記。pH保持在8.0～9.0，蛋白質(zhì)與熒光染料比例為50 μg∶400 pmol。Cy2顯黃色，Cy3顯紅色，Cy5顯藍(lán)色熒光，每次同時進(jìn)行6塊凝膠電泳。第一向等電聚焦(IEF)電泳和SDS-PAGE電泳后，凝膠圖像采集與分析，用Typhoon9400激光掃描儀在熒光模式下進(jìn)行Cy2、Cy3、Cy5成像掃描，所有的成像在1000 μm處行預(yù)掃描,Cy3、Cy5、Cy2標(biāo)記的成像分別由532 nm、633 nm、488 nm的激發(fā)波長收集，終圖像使用100 μm的精度掃描。分析膠熒光差異凝膠電泳，用BVA軟件分析顯示9塊凝膠平均分離1586個蛋白點(diǎn),蛋白點(diǎn)匹配率約為82%，表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)超過1.5倍的蛋白定義為差異表達(dá)蛋白，共160個。分析膠上的差異蛋白點(diǎn)與考染的制備膠上的6個蛋白點(diǎn)進(jìn)行匹配后再切取蛋白點(diǎn)并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。應(yīng)用肽混合物的肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fingerprinting,PMF)分析結(jié)果，應(yīng)用Mascot (http://www.matrixscience.com)搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。結(jié)果的可靠性用肽段匹配率的得分值和匹配肽段在對應(yīng)蛋白內(nèi)序列的覆蓋率進(jìn)行評價(見圖2)。

Master No.是該差異蛋白在膠中的號碼；等電點(diǎn)及分子量是根據(jù)PMF得到的蛋白質(zhì)的理論值；Coverage是已配對多肽與蛋白總序列的比值百分比；t-test是軟件應(yīng)用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法；Av-Ratio是差異蛋白在相對比的組中的升高或降低的比值圖2 大鼠正常股神經(jīng)運(yùn)動支(CM)和隱神經(jīng)(CS)、Sunderland V損傷后8 h股神經(jīng)運(yùn)動支(SIM)和隱神經(jīng)(SIS)、Sunderland V損傷后8 d(LIM)和隱神經(jīng)(LIS)3種時間點(diǎn)的比較蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜鑒定出的高差異蛋白

2 結(jié) 果

周圍神經(jīng)感覺和運(yùn)動束之間差異表達(dá)的蛋白共160個，選取6個高差異蛋白點(diǎn)分析鑒定，Annexin V、NF-L、Tec、Serpina3n、PRDX-2、TPM1蛋白被確切地鑒定。其中的1399號蛋白點(diǎn)Annexin V穩(wěn)定出現(xiàn)與各膠中，CM/CS的比值是-1.94倍，匹配良好，蛋白穩(wěn)定出現(xiàn)在所有膠中，P值0.00068,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SIM/SIM的比值是-2.07倍，匹配良好，蛋白穩(wěn)定出現(xiàn)在所有膠中，P值0.0053，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LIM/LIS的比值是-2.20倍，匹配良好，蛋白穩(wěn)定出現(xiàn)在所有膠中，P值0.0069，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用實(shí)時定量Rt-PCR的方法，檢測比較蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜分析鑒定出的周圍神經(jīng)感覺和運(yùn)動束之間在不同時間點(diǎn)損傷的高差異蛋白在mRNA水平的變化，驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定結(jié)果(見圖3)。

a：Annexin V蛋白引物序列；b：Annexin V 在正常運(yùn)動束(CM)與正常感覺束(CS)mRNA表達(dá)水平；c：Annexin V 在Sunderland V新鮮損傷8 h運(yùn)動束(LIM)與感覺束(LIS)mRNA表達(dá)水平；d：Annexin V 在Sunderland V陳舊損傷8 d運(yùn)動束(SIM)與感覺束(SIS)mRNA表達(dá)水平圖3 蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的Rt-PCR驗(yàn)證，Annexin V是周圍神經(jīng)感覺和運(yùn)動束之間在不同時間點(diǎn)損傷后的高差異蛋白

3 結(jié) 論

周圍神經(jīng)感覺束和運(yùn)動束之間的比較蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)存在明顯差異,Annexin V可作為鑒別周圍神經(jīng)感覺和運(yùn)動束的高差異標(biāo)記蛋白。

4 討 論

周圍神經(jīng)損傷后，功能恢復(fù)不佳的主要原因是接觸導(dǎo)向理論模式下的對位精準(zhǔn)性差，這在周圍神經(jīng)損傷的最重分型，即Sunderland V損傷表現(xiàn)最為明顯，所以本實(shí)驗(yàn)采用了Wistar大鼠股神經(jīng)肌支和隱神經(jīng)的Sunderland V損傷模型?，F(xiàn)今，微創(chuàng)化手術(shù)要求束膜縫合，而束膜縫合的前提是能夠鑒別神經(jīng)功能束的性質(zhì)，但迄今還沒有實(shí)用的神經(jīng)功能束鑒別方法。

國內(nèi)外學(xué)者曾經(jīng)提出電刺激法或近紅外光譜法進(jìn)行鑒別，但電刺激法術(shù)中鑒別的缺點(diǎn)是患者需保持清醒，麻醉受到限制，電位不穩(wěn)定，不適于術(shù)中應(yīng)用[3]。酶組織化學(xué)法(膽堿酯酶AchE和碳酸酐酶CA)鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)，一度被認(rèn)為是突破此難題的方法，但需實(shí)驗(yàn)室操作，時間過長，而且操作步驟極其繁瑣，非實(shí)驗(yàn)人員無法完成。AchE和CA都不是神經(jīng)組織的特異性標(biāo)志酶，缺乏特異性，酶染方法自身的缺陷難以在臨床上應(yīng)用[4]。

近幾年，神經(jīng)特異蛋白免疫學(xué)方法給周圍神經(jīng)功能束鑒別帶來了希望。標(biāo)記是鑒別的方法，而標(biāo)記的前提是找到組成上的相對特異。免疫學(xué)方法鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)在理論上是切實(shí)可行的，但文獻(xiàn)回顧中提到一些蛋白在周圍神經(jīng)感覺或運(yùn)動束的特異性上受到很多專家的質(zhì)疑，如何選擇一種高通量篩選周圍神經(jīng)干感覺束與運(yùn)動束的實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)行研究，是周圍神經(jīng)干感覺束與運(yùn)動束鑒別的焦點(diǎn)問題。我們通過應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法結(jié)合質(zhì)譜及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對周圍神經(jīng)運(yùn)動束與感覺束的蛋白質(zhì)進(jìn)行整體對比分析,找出周圍神經(jīng)運(yùn)動和感覺束的特異性或高差異性蛋白質(zhì),為臨床周圍神經(jīng)運(yùn)動和感覺束快速鑒別提供新手段。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高通量的比較蛋白質(zhì)組學(xué),篩選出了6個差異在1.5倍之上的蛋白，其中Annexin V不僅在正常周圍神經(jīng)運(yùn)動束與感覺束中存在-1.94倍的高差異，在新鮮周圍神經(jīng)損傷后運(yùn)動束與感覺束中存在著-2.07倍的高差異，而且在陳舊性周圍神經(jīng)損傷后運(yùn)動束與感覺束中存在-2.20倍的高差異，Rt-PCR也驗(yàn)證Annexin V確實(shí)在周圍神經(jīng)感覺束與運(yùn)動束中存在較大差異。通過Annexin V在周圍神經(jīng)感覺束與運(yùn)動束中2倍左右的高差異比例，證明Annexin V是個可用于周圍神經(jīng)運(yùn)動束和感覺束鑒別的高差異蛋白。這就為周圍神經(jīng)新鮮與陳舊性損傷后的鑒別提供了可標(biāo)記的高差異蛋白，有可能實(shí)現(xiàn)免疫組化法進(jìn)行術(shù)中快速的周圍神經(jīng)束性質(zhì)鑒別。

Annexin V是一種膜聯(lián)蛋白，生理情況下具有促進(jìn)髓鞘形成、樹突生長、神經(jīng)元修復(fù)及維持突觸可塑性等重要功能，在神經(jīng)再生和修復(fù)中起著重要作用[5]。本實(shí)驗(yàn)在Wistar大鼠股神經(jīng)運(yùn)動支和隱神經(jīng)損傷后Annexin V持續(xù)表達(dá)，并在量上變化較大，驗(yàn)證了其在髓鞘再生和軸突生長免疫調(diào)節(jié)修復(fù)過程中起著重要作用。現(xiàn)今國外對于Annexin V在Alzheimer病(AD)、精神分裂癥、抑郁癥、多發(fā)梗死性癡呆、帕金森病、原發(fā)進(jìn)行性失語癥、Lewy小體型癡呆、唐氏綜合癥、輕度認(rèn)知功能損傷等中樞系統(tǒng)疾病上論述較多,但在周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷及疾病方面研究較少[6]?，F(xiàn)今納米粒因?yàn)轶w積微小和優(yōu)良發(fā)光屬性而成為最優(yōu)良的蛋白標(biāo)記物[7]。應(yīng)用發(fā)光效率好且容易制備的碲化鎘(CdTe)納米粒，把CdTe納米粒與Annexin V蛋白抗體相耦連，制備出常溫下穩(wěn)定可備用的CdTe-Annexin V抗體復(fù)合物，作用于感覺束上的抗原，使抗原和抗體結(jié)合，利用CdTe納米粒的發(fā)光性標(biāo)記出感覺束，實(shí)現(xiàn)周圍神經(jīng)感覺束和運(yùn)動束的鑒別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)斷端感覺束與感覺束、運(yùn)動束與運(yùn)動束的準(zhǔn)確對接束膜縫合，達(dá)到降低周圍神經(jīng)斷裂損傷后的肢體殘障率，真正惠及眾生，造福于民。

Annexin V能否用于抗原抗體免疫反應(yīng)發(fā)光標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)周圍神經(jīng)功能束鑒別和Annexin V和發(fā)光偶聯(lián)物的相容性問題是個后續(xù)的科研方向。本研究突破傳統(tǒng)的周圍神經(jīng)感覺束與運(yùn)動束在單一時間點(diǎn)鑒別的觀念，積極探討周圍神經(jīng)感覺束、運(yùn)動束損傷后不同時間的蛋白量的變化，將會推動周圍神經(jīng)功能束鑒別以及周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的進(jìn)一步研究。