陳 才，程景林，王 靚

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是急性冠脈綜合征中最嚴(yán)重的類(lèi)型，具有發(fā)病急、進(jìn)展快、死亡風(fēng)險(xiǎn)高的特點(diǎn)，是心血管疾病中引起死亡的主要原因之一，早期快速地對(duì)急性心肌梗死病人進(jìn)行危險(xiǎn)分層，識(shí)別高危病人并采取合理的治療措施對(duì)改善病人預(yù)后、提高生存率具有重要意義[1]。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼RNA，通過(guò)結(jié)合特定mRNA的3′UTR區(qū)使基因沉默，在平滑肌細(xì)胞增殖、血管新生、損傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]，其中微小RNA-126(microRNA-126，miR-126)可多基因靶向調(diào)控血管再生，同時(shí)促進(jìn)多種血管相關(guān)基因的表達(dá)與分泌，進(jìn)而促進(jìn)血管再生和成熟[3]。去整合素-金屬蛋白酶9(a disintegrin and metalloprotease 9，ADAM9)屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，是ADAM家族中重要的一員，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的多種組織中，參與各種病理與生理學(xué)過(guò)程，參與炎癥反應(yīng)、病理性視網(wǎng)膜新生血管化、過(guò)敏反應(yīng)和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。Suresh等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，糖尿病病人心臟miR-126表達(dá)較低，并且ADAM9表達(dá)相應(yīng)增加，可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞的胞吞作用，減輕心臟損傷后心肌缺血-再灌注損傷過(guò)程所致?lián)p害，以實(shí)現(xiàn)炎癥和維持組織動(dòng)態(tài)平衡。本研究通過(guò)觀察急性心肌梗死病人入院血清中miR-126、ADAM9的表達(dá)水平，探討急性心肌梗死病人入院血清miR-126、ADAM9表達(dá)水平對(duì)急性心肌梗死短期預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年6月—2019年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診內(nèi)科確診并收治的急性心肌梗死病人142例為觀察組，其中男73例，女69例，年齡42～70(56.41±7.04)歲；選取同期體檢健康者140名作為對(duì)照組，其中男76名，女64名，年齡42～71(57.16±7.53)歲。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合世界衛(wèi)生組織(WHO)心肌梗死診斷和治療指南制定的標(biāo)準(zhǔn)[6]；②治療前1個(gè)月未接受重大手術(shù)者；③胸痛癥狀持續(xù)>20 min，服用硝酸酯類(lèi)藥物無(wú)效。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?lài)?yán)重心、肝、腎功能障礙；②曾行冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)等心臟手術(shù)者；③合并各種惡性腫瘤者；④近2周內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素藥物者；⑤凝血功能障礙者。

1.3 主要試劑與儀器 轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：DEM201-20T購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；Prime ScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(貨號(hào)：RR037A)及TRIzol試劑(貨號(hào)：JMS12279)均購(gòu)自日本TaKaRa公司；人ADAM9酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：JH-H11066)購(gòu)自上海繼和生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號(hào)：MiniAmp)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 臨床資料收集 入院時(shí)收集納入者性別、年齡、基本疾病情況等一般資料。

1.4.2 血清樣本的采集與保存 觀察組病人在急性心肌梗死發(fā)病后0～12 h、對(duì)照組于常規(guī)體檢當(dāng)日采集外周靜脈血5 mL，且觀察組于1個(gè)月復(fù)查時(shí)再次進(jìn)行血樣采集，操作人員及方法與第1次樣本采集保持一致。所有血樣于3 500 r/min離心10 min，吸取上清液2 mL于試管中，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)待測(cè)。

1.4.3 qRT-PCR測(cè)定血清miR-126表達(dá)水平 從-80 ℃取出血清樣本，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取血清總核糖核酸(RNA)。異丙醇沉淀濃縮后，用75%乙醇洗滌，干燥后加入100 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水，檢測(cè)所得RNA純度及完整度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系15 μL)：cDNA(50 ng/μL)模板1 μL，緩沖液3 μL，10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.5 μL，正、反向引物各1 μL，1.5 U Taq酶0.5 μL，水8 μL。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。正、反向引物及內(nèi)參基因由上海恒斐生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，miR-126以U6為內(nèi)參，ADAM9以β-actin為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：92 ℃預(yù)變性14 min；91 ℃變性35 s，59 ℃退火30 s，74 ℃延伸16 s，45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72 ℃收集熒光。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清中miR-126的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定血清中ADAM9的表達(dá)水平 從-80 ℃冰箱中取出血清標(biāo)本，利用ELISA測(cè)定血清ADAM9表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.5 隨訪結(jié)果 隨訪時(shí)間開(kāi)始于病人治療結(jié)束出院當(dāng)日，隨訪時(shí)長(zhǎng)為1個(gè)月，采用電話、微信等方式記錄病人生活質(zhì)量及死亡情況。1個(gè)月后觀察組復(fù)查心臟彩超，根據(jù)其是否發(fā)生不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACEs)分為MACEs組(36例)、未發(fā)生MACEs組(106例)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組年齡、性別、糖尿病史占比、高脂血癥占比比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，觀察組高血壓比例、體質(zhì)指數(shù)(BMI)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清miR-126、ADAM9表達(dá)水平比較 觀察組血清中miR-126表達(dá)水平低于對(duì)照組，ADAM9表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 兩組血清中miR-126、ADAM9表達(dá)水平比較(±s)

2.3 觀察組血清miR-126、ADAM9表達(dá)水平的相關(guān)性 觀察組病人血清中miR-126與ADAM9表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.580，P<0.001)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 觀察組血清miR-126、ADAM9表達(dá)水平的相關(guān)性

2.4 MACEs組與未發(fā)生MACEs組血清miR-126、ADAM9表達(dá)水平比較 MACEs組血清中miR-126表達(dá)水平低于未發(fā)生MACEs組，ADAM9表達(dá)水平高于未發(fā)生MACEs組(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 MACEs組與未發(fā)生MACEs組血清miR-126、ADAM9表達(dá)水平比較(±s)

與未發(fā)生MACEs組比較，①P<0.05。

2.5 血清miR-126、ADAM9表達(dá)水平對(duì)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線顯示，miR-126預(yù)測(cè)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的ROC曲線下面積為0.757[95%CI(0.675，0.839)]，截?cái)嘀禐?.884，敏感度為94.4%，特異性為47.2%；ADAM9預(yù)測(cè)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的ROC曲線下面積為0.681[95%CI(0.572，0.790)]，截?cái)嘀禐?.732 pg/mL，敏感度為44.4%，特異性為90.4%；miR-126、ADAM9聯(lián)合預(yù)測(cè)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的ROC曲線下面積為0.786[95%CI(0.700，0.873)]，敏感度為86.1%，特異性為77.9%。詳見(jiàn)圖2。

圖2 血清miR-126、ADAM9表達(dá)水平對(duì)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

急性心肌梗死是冠心病中最為嚴(yán)重的一種類(lèi)型，具有較高的死亡率，急性心肌梗死病人在接受介入治療時(shí)會(huì)出現(xiàn)心肌缺血-再灌注損傷，目前認(rèn)為急性心肌梗死發(fā)病越久，血管再通難度越大，黃明劍等[7]研究顯示，>6～12 h組血清N末端B型利鈉肽前體(NT-proBNP)、心肌肌鈣蛋白I (cTnI)水平明顯低于>3～6 h組和≤3 h組，發(fā)病>6～12 h行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)，雖然病人心功能恢復(fù)更好，但左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)更低，心肌損傷程度更大，不利于病人預(yù)后；≤3 h組再灌注心律失常發(fā)生率明顯高于>3～6 h組和>6～12 h組，提示越早開(kāi)通梗死相關(guān)動(dòng)脈再灌注心律失常發(fā)生率越高。因此，急性心肌梗死發(fā)病3～6 h是急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的最佳時(shí)間窗，盡早開(kāi)通梗死相關(guān)動(dòng)脈，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈供血，是拯救瀕死心肌、提高左室功能、改善病人預(yù)后的重要措施。宮俊龍[8]的研究顯示，高血壓是冠心病的主要危險(xiǎn)因素之一，在高血壓合并急性心肌梗死病人中，血壓變異性與冠狀動(dòng)脈病變程度相關(guān)。焦震宇等[9]等的研究顯示，年齡、BMI等是空腹三酰甘油水平升高人群發(fā)生急性心肌梗死的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果中，兩組基線比較，觀察組高血壓比例、BMI高于對(duì)照組，說(shuō)明高血壓、肥胖與急性心肌梗死發(fā)生具有一定相關(guān)性。miRNA在心肌細(xì)胞中表達(dá)豐富，參與心肌細(xì)胞凋亡、心律失常、心肌肥厚、心室重構(gòu)和心力衰竭等病理生理過(guò)程[10]。其中miR-126廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)中，是血管生成的主要調(diào)節(jié)劑，具有保護(hù)血管和抗動(dòng)脈硬化的作用[11]。研究顯示，在非冠心病、心絞痛和心肌梗死3組中，病人血漿miR-126水平呈遞降趨勢(shì)，即miR-126水平隨冠心病嚴(yán)重程度增加而降低，提示其表達(dá)水平可能與心肌損傷程度有關(guān)[12]。Chistiakov等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在成熟的EC和成人EPC中，miR-126通過(guò)抑制血管生成、維持血管完整性、增加相關(guān)靜態(tài)內(nèi)皮表型抑制細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)血管穩(wěn)態(tài)。本研究結(jié)果中，觀察組血清miR-126表達(dá)水平低于對(duì)照組，MACEs組血清miR-126可能表達(dá)水平低于未發(fā)生MACEs組，提示miR-126可能參與急性心肌梗死病人的發(fā)病過(guò)程。短期預(yù)后過(guò)程中，發(fā)生MACEs的病人miR-126表達(dá)水平依然低于未發(fā)生MACEs的病人，猜測(cè)miR-126表達(dá)降低可能是由于急性心肌梗死過(guò)程中血管梗死，miR-126保護(hù)血管的作用被抑制，血管穩(wěn)態(tài)破壞，而miR-126表達(dá)降低又使得這種情況持續(xù)至病人搶救后的恢復(fù)狀態(tài)，從而導(dǎo)致病人發(fā)生MACEs，形成惡性循環(huán)。

ADAM9是ADAM的家族成員，除了金屬蛋白酶活性，ADAM9還與不同的整合素相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附功能，例如ADAM9 Disintegrin域可通過(guò)與整合素相互作用，激活人體中性粒細(xì)胞[14]?？扇苄訟DAM9細(xì)胞外域不能增加內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性或抑制單核細(xì)胞-內(nèi)皮黏附，但可以抑制單核細(xì)胞-內(nèi)皮遷移[15]。單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜后，分化成巨噬細(xì)胞，攝取修飾后的脂蛋白成為泡沫細(xì)胞，逐漸積累在內(nèi)皮的泡沫細(xì)胞凋亡，若凋亡的泡沫細(xì)胞沒(méi)有被及時(shí)清除，可逐漸導(dǎo)致血栓和炎性壞死核心的形成，巨噬細(xì)胞進(jìn)一步加劇炎癥，繼發(fā)血栓形成，引起缺血性事件如心肌梗死[16]。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清中ADAM9表達(dá)水平高于對(duì)照組，MACEs組血清中ADAM9表達(dá)水平高于未發(fā)生MACEs組，提示ADAM9參與急性心肌梗死的發(fā)生過(guò)程，ADAM9對(duì)急性心肌梗死發(fā)生的作用機(jī)制可能是ADAM9高表達(dá)抑制單核細(xì)胞向內(nèi)皮遷移，防止分化為泡沫細(xì)胞導(dǎo)致血栓的形成，ADAM9或與急性心肌梗死發(fā)生時(shí)所引起的炎性機(jī)制相關(guān)；而在病人短期恢復(fù)期間，巨噬細(xì)胞持續(xù)作用于心肌再灌注所引起的修復(fù)過(guò)程中，導(dǎo)致ADAM9保持高表達(dá)的同時(shí)激活中性粒細(xì)胞分泌。另外Pearson分析結(jié)果顯示，觀察組病人血清中miR-126與ADAM9表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。ROC曲線顯示，miR-126預(yù)測(cè)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的ROC曲線下面積為0.757，截?cái)嘀禐?.884，但特異性較低；ADAM9預(yù)測(cè)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的ROC曲線下面積為0.681，截?cái)嘀禐?.732 pg/mL，敏感度較低，提示當(dāng)miR-126相對(duì)表達(dá)量低于0.884、ADAM9相對(duì)表達(dá)量高于1.732 pg/mL時(shí)，心肌梗死病人可能發(fā)生MACEs；miR-126、ADAM9聯(lián)合預(yù)測(cè)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的敏感度為86.1%，特異性為77.9%，比單項(xiàng)檢測(cè)miR-126、ADAM9敏感度、特異性均高，因此miR-126、ADAM9血清表達(dá)量對(duì)急性心肌梗死病人發(fā)生MACEs的預(yù)測(cè)有一定的價(jià)值，聯(lián)合檢測(cè)價(jià)值更高。

綜上所述，急性心肌梗死病人血清中miR-126呈低表達(dá)，ADAM9呈高表達(dá)，且兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-126、ADAM9血清表達(dá)對(duì)急性心肌梗死病人是否發(fā)生MACEs的預(yù)測(cè)有一定的價(jià)值。