張亞平，趙世明，任可可，吳聰聰，史卓暄，劉 玲

心肌纖維化是在高血壓、心肌梗死及瓣膜性心臟病中發(fā)生的一種病理學(xué)改變，其特征是間質(zhì)性成纖維細(xì)胞增殖和過度生成及心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積，包括膠原蛋白和纖連蛋白，被認(rèn)為是確定心臟病臨床結(jié)局的重要危險(xiǎn)因素[1-3]。黃芩苷是黃芩干燥根中的主要成分，是一種天然多酚，黃芩苷具有多種生物學(xué)活性，包括抗炎、抗氧化、抗血栓形成、抗增殖和凋亡調(diào)控[4]。研究表明，黃芩苷對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化具有保護(hù)作用[5]，并且可以抑制腎臟纖維化[6]。研究報(bào)道，黃芩苷對(duì)心血管疾病具有一定的保護(hù)作用，例如對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的抑制作用、對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷并抑制內(nèi)皮功能障礙[7-9]。但黃芩苷對(duì)心臟纖維化的作用研究較少。本研究通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，建立心肌梗死后心肌纖維化大鼠模型，探究黃芩苷對(duì)心肌纖維化大鼠的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)健康SD雄性大鼠 40 只，6～8周齡，體質(zhì)量(220±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。將動(dòng)物圈養(yǎng)在溫度可控的房間里，光照時(shí)間為12 h，溫度為22～24 ℃，濕度為50%～60%，給予標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室食物和任意的自來水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物、試劑和儀器 黃芩苷(純度>99%)購自上海阿拉丁公司；ECL發(fā)光液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒、RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑購自上海碧云天公司；蘇木精-伊紅(HE)染色液購自北京索萊寶公司；Masson染色液購自北京雷根生物公司；兔抗大鼠膠原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)單抗(ab260043，Abcam)，膠原蛋白Ⅲ(Collagen Ⅲ)單抗(ab7778，Abcam)，兔抗大鼠纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)單抗(ab268020，Abcam)，兔抗大鼠p38單抗(ab170099，Abcam)，兔抗大鼠p-p38單抗(ab4822，Abcam)，兔抗大鼠Smad2單抗(#5339，CST)，兔抗大鼠p-Smad2單抗(#18338，CST)，小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1(sc-65378，santa cruz)，兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗(ab181602，Abcam)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫吸附球蛋白G(IgG)抗體(ab6728)，兔抗小鼠IgG H&L(HRP)(ab6728，Abcam)，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、IL-10及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒均購自武漢博士德公司。ALC-V8S 型小動(dòng)物呼吸機(jī)購自上海阿爾科特生物公司，彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀購自美國ACUSON公司(Sepuoia512)，臺(tái)式高速低溫離心機(jī)購自美國Beckman Coulter公司，凝膠電泳儀購自美國 Bio-rad 公司，熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3 動(dòng)物模型的建立和給藥

1.3.1 模型建立 將40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、黃芩苷12.5 mg/kg組、黃芩苷25 mg/kg組和黃芩苷50 mg/kg組，每組8只[10]。模型組、黃芩苷12.5 mg/kg組、黃芩苷25 mg/kg組和黃芩苷50 mg/kg組大鼠處理如下[11]：用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，后背位固定，經(jīng)口氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，于左胸第3肋與第4肋間打開胸腔，暴露心臟。確定左冠狀動(dòng)脈前降支位置(肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處)，用5/0手術(shù)線進(jìn)行結(jié)扎，心室前壁變蒼白，室壁運(yùn)動(dòng)明顯減弱。用棉球吸除胸腔內(nèi)液體，擠出胸腔內(nèi)氣體，逐層縫合，觀察有自主呼吸后拔除插管。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。術(shù)后24 h將心電圖沒有 ST 段改變的造模大鼠剔除，最終每組選取6只。

1.3.2 給藥方法 黃芩苷各組大鼠按照相應(yīng)劑量分別給予黃芩苷12.5 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃4周。假手術(shù)組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

1.4 心功能指標(biāo)檢測(cè) 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心臟變化。異氟烷吸入麻醉大鼠，心前區(qū)脫毛后取仰臥位，經(jīng)胸行超聲檢查，探頭頻率為 2～4 MHz，測(cè)量左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)。左室收縮功能通過左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)進(jìn)行評(píng)估。完成檢測(cè)后腹主動(dòng)脈采血，離心后取上清于-20 ℃保存，頸椎脫臼處死大鼠，解剖取出心臟組織，每組各取3只大鼠的心臟組織于-80 ℃保存，另外3只大鼠的心臟組織保存于4%多聚甲醛溶液中。

1.5 心肌酶學(xué)檢測(cè) 取出于-20 ℃保存的大鼠血清，用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。

1.6 HE染色檢測(cè)心肌組織病理學(xué)變化 各組大鼠心肌組織在4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h后，經(jīng)梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片，厚度為4 μm。脫蠟，行HE染色，脫水透明封片，鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化(×400)。

1.7 Masson染色檢測(cè)心肌纖維化 心肌組織切片按Masson染色試劑盒步驟操作，使用Image-ProPlus軟件鏡下觀察拍照，并計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。顯微鏡下心肌組織為紅色，膠原纖維為藍(lán)色。CVF(%)=膠原纖維染色面積/切片總面積×100%。

1.8 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)蛋白表達(dá) 用RIPA 裂解液提取大鼠心肌組織蛋白，采用 BCA 法測(cè)定各組蛋白濃度。蛋白樣品上樣量為35 μg，經(jīng)SDS-PAGE在電泳緩沖液中電泳分離，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗3次，每次10 min；加入稀釋的一抗(GAPDH 1∶1 500、Collagen Ⅰ 1∶1 000、Collagen Ⅲ 1∶1 000、FN 1∶1 000、t-p38 1∶1 000、p-p38 1∶1 000、Smad2 1∶1 000、p-Smad2 1∶1 000和TGF-β11∶1 000)4 ℃靜置過夜。TBST 洗膜3次，每次10 min，用HRP標(biāo)記的山羊抗兔和兔抗小鼠二抗(1∶4 000)37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL顯色，用Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.9 ELISA檢測(cè)炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平 按照ELISA 試劑盒說明書采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平。

2 結(jié) 果

2.1 心臟功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD明顯升高，LVFS、LVEF明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，黃芩苷25 mg/kg組和黃芩苷50 mg/kg組LVEDD、LVESD明顯降低，LVFS、LVEF明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心臟功能指標(biāo)比較(±s)

2.2 心肌酶水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，黃芩苷25 mg/kg組和黃芩苷50 mg/kg組大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心肌酶水平比較(±s) 單位：U/L

2.3 心肌組織病理形態(tài)和纖維化比較 HE染色：假手術(shù)組肌束緊密有序，形態(tài)規(guī)則，胞核完整；模型組心肌組織被破壞，心肌細(xì)胞破碎，細(xì)胞核固縮變形，失去原有的結(jié)構(gòu)；黃芩苷25 mg/kg組和黃芩苷50 mg/kg組心肌組織形態(tài)較模型組規(guī)則，細(xì)胞膜完整見(見圖1A)。Masson染色：模型組大鼠心肌組織有大量藍(lán)色膠原纖維沉積，纖維化程度嚴(yán)重，CVF較假手術(shù)組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芩苷25 mg/kg組和黃芩苷50 mg/kg組纖維化程度明顯減輕，CVF較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1B)。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)和纖維化情況[A為HE染色和Masson染色(×400)；B為各組CVF比較，n=3]

2.4 纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纖連蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷25 mg/kg組和黃芩苷50 mg/kg組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纖連蛋白表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

與假手術(shù)組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖2 各組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纖連蛋白表達(dá)情況[A為Western Blot檢測(cè)Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纖連蛋白表達(dá)情況；B為各組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纖連蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)]

2.5 炎性因子水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷25 mg/kg組和黃芩苷50 mg/kg組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清炎性因子水平比較(±s)單位：ng/L

2.6 p38/TGF-β1/ Smad2通路指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中p38、Smad2磷酸化水平及TGF-β1蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷25 mg/kg和黃芩苷50 mg/kg組大鼠p38、Smad2磷酸化水平及TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05圖3 各組大鼠心肌組織中p38、Smad2磷酸化水平及TGF-β1蛋白的表達(dá)比較[A為Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)；B為蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)]

3 討 論

心肌梗死后，由于心肌細(xì)胞外基質(zhì)沉積和降解失衡，膠原纖維替代了壞死的心肌組織，進(jìn)而導(dǎo)致瘢痕組織積聚，心肌病理重塑和心臟功能下降[12]，主要病理特征為心室增大和LVEF降低，且隨著時(shí)間的推移不斷惡化，LVEF降低是心力衰竭的主要臨床表現(xiàn)[13]。本研究顯示，心肌梗死模型大鼠心室增厚，LVEF和LVFS明顯下降，出現(xiàn)心臟收縮和舒張障礙，黃芩苷可改善心肌梗死過程中心室收縮和舒張功能，減少包括CK、CK-MB和LDH在內(nèi)的心肌酶釋放。因此，黃芩苷能夠改善心肌梗死大鼠的心臟功能。

研究表明，黃芩苷通過抑制心肌膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)和其他相關(guān)纖維化標(biāo)志物發(fā)揮改善自發(fā)性高血壓大鼠心臟纖維化的作用[14-15]。黃芩苷可以改善各種器官內(nèi)的纖維化效應(yīng)，例如肺纖維化[16]和腎纖維化[6]。本研究HE 染色和 Masson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙能夠看到大量膠原纖維增生。經(jīng)黃芩苷處理后心肌組織的病變程度降低，膠原蛋白容積分?jǐn)?shù)減少，并逆轉(zhuǎn)模型組大鼠Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)上調(diào)，表明黃芩苷可減輕心肌梗死造成的心肌纖維化及心肌功能損傷。

心肌梗死后第1個(gè)小時(shí)，心肌中就發(fā)現(xiàn)了炎性細(xì)胞的浸潤[17]。炎癥通過刺激膠原蛋白沉積以補(bǔ)償在心臟修復(fù)過程中心肌細(xì)胞的丟失，因此，長期、不充分的抑制炎癥可能會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白在心臟中過度沉積，使心臟壁變硬，從而損害心臟功能[18]。黃芩苷通過抑制IL-6和IL-23來減輕二氧化硅誘導(dǎo)的肺部炎癥和肺纖維化[19]。Zhao等[4]研究表明，黃芩苷可以明顯減輕博來霉素引起的大鼠肺纖維化和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷處理可明顯抑制心肌梗死引起的IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的釋放，促進(jìn)抗炎因子IL-10的分泌。因此，黃芩苷能明顯減輕心肌梗死大鼠的心肌炎癥。

越來越多的證據(jù)表明，TGF-β/Smad信號(hào)通路對(duì)于纖維化的發(fā)生至關(guān)重要，并且廣泛認(rèn)可Smads在TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分過度積累中的重要作用[20]。研究表明，黃芩苷通過上調(diào)腺苷A2a受體、下調(diào)TGF-β1和磷酸化p-ERK1/2表達(dá)來抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[21]。本研究表明，黃芩苷通過下調(diào)心肌梗死模型大鼠中TGF-β1和p-Smad2的表達(dá)，抑制TGF-β/ Smad信號(hào)通路活化，從而減輕心肌梗死后纖維化。除了TGF-β/Smads途徑，TGF-β還參與幾種絲裂原活化蛋白激酶的非經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括ERK1/2和p38 MAPK[22]。p-ERK1/2和 p38 MAPK通路的抑制可有效抑制心肌梗死大鼠心肌纖維化[23]。本研究表明，黃芩苷可明顯降低p38的磷酸化水平，從而抑制心肌細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和心肌纖維化發(fā)展。

綜上所述，本研究表明，黃芩苷可以減輕心肌梗死大鼠的心功能障礙，通過減少膠原沉積和促炎因子分泌抑制了心肌纖維化的發(fā)展。黃芩苷抗纖維化的作用可能與抑制p38的磷酸化及TGF-β1/Smad2通路相關(guān)。本研究為黃芩苷的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，但黃芩苷抗纖維化的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。