張二豪，趙潤東，祿亞洲，尹秀，蔡皓，蘭小中

（西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

喜馬拉雅紫茉莉（Mirabilis himalaica）又名山紫茉莉，屬于多年生草本植物，主要分布在青藏高原［1］；以根入藥，具有治療腎炎、腎結(jié)石、腰疼、關(guān)節(jié)痛和子宮癌的功效，是西藏一級瀕危藏藥材之一［2，3］。

根際土壤作為植物根系及根系分泌物的接觸區(qū)域，微生物與植物生長發(fā)育、抗逆境、生態(tài)適應(yīng)性及系統(tǒng)進化關(guān)系密切［4］。藥用植物品質(zhì)不僅與品種、生長環(huán)境等因素有關(guān)，而且與根際微生物密切相關(guān)。根際微生物可直接作用于植物，通過影響植物生長發(fā)育及次生代謝，進而影響藥用植物生物量和藥用成分含量［5-7］。有研究表明根際益生菌能夠提高貫葉連翹藥用成分的含量［6］；枯草芽孢桿菌、梨狀芽孢桿菌和金黃色固氮菌能提高黨參和黃花蒿的生物量，促進其藥用成分的積累［8，9］。因此，研究藥用植物根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成，對分離篩選與藥材品質(zhì)相關(guān)微生物及人工種植具有重要意義。

喜馬拉雅紫茉莉作為西藏傳統(tǒng)藏藥材，相關(guān)研究主要集中在其化學(xué)成分及藥理學(xué)分析［10-13］，而關(guān)于根際土壤微生物群落組成的研究尚未見報道。本試驗采用高通量測序技術(shù)分析西藏5個種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異，揭示其根際細菌的核心菌群結(jié)構(gòu)，并分析環(huán)境因子與細菌群落結(jié)構(gòu)組成的相關(guān)性，以期為根際微生物與喜馬拉雅紫茉莉藥材品質(zhì)間的關(guān)系研究和人工種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2年生喜馬拉雅紫茉莉根際土壤樣品于2019年9月分別在林芝市巴宜區(qū)、林芝市工布江達縣、山南市扎囊縣、林芝市朗縣和山南市桑日縣采集（表1）。田間根際土壤樣品采集采用抖根法［14］，在每個種源地隨機選取20株長勢良好的喜馬拉雅紫茉莉并采集根際土壤，混合均勻，每個種源地3組重復(fù)。將采集的根際土壤立即裝入無菌袋中，低溫運輸至實驗室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣品采集點信息

1.2 試驗方法

1.2.1 不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤樣品理化性質(zhì)分析 土壤理化性質(zhì)測定采用常規(guī)檢測方法［15］，測定指標主要包括pH值、總磷（TP）、總鉀（TK）、總氮（TN）、速效氮（AN）、速效磷（AP）、有機質(zhì)含量（SOM）和電導(dǎo)率（EC）。土壤pH值檢測采用電位法，總磷和速效磷檢測采用鉬銻抗比色法，總鉀和速效鉀檢測采用火焰光度計法，總氮檢測采用凱氏定氮法，速效氮檢測采用堿解擴散法，電導(dǎo)率測定采用電極法，有機質(zhì)測定采用重鉻酸鉀水合熱法。

1.2.2 不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤樣品總DNA提取 利用Mag-Bind Soil DNA Kit（Omega）提取15個根際土壤樣品總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量并用NanoDrop ND-2000紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度。

1.2.3 PCR擴增 利用338F（5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHV GGGT WTCTAAT-3′）引物擴增細菌16S rRNA V3-V4可變區(qū)，引物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。反應(yīng)體系（20μL）：10×PCR Buffer 2.0μL，rTaq酶（5.0 U/μL）0.20μL，正反向引物各1μL，dNTPs（5 mmol/L）1μL，DNA模板1μL，ddH2O 13.80μL。PCR反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)結(jié)果并使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

利用QIIME（Version 1.9.1）軟件對高通量測序原始數(shù)據(jù)進行過濾除雜，以除去低質(zhì)量序列、錯配序列、引物序列和過長（≥500 bp）或過短序列（≤200 bp），從而獲得高質(zhì)量的Clean data，根據(jù)Reads間的重疊關(guān)系將Reads拼接成Tags。在97%相似度下，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）對拼接好的Tags進行OTU聚類［16］；利用Uparse（v7.0.1090）和Usearch（v7.0）軟件對OTU序列進行聚類和統(tǒng)計；利用Mothur（v1.30.2）軟件計算Alpha多樣性，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannoneven指數(shù)［17］；利用Qiime（v1.9.1）軟件生成各分類學(xué)水平豐富度和Beta多樣性［18］。

土壤理化性質(zhì)測定數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2019進行統(tǒng)計處理，使用SPSS 20.0軟件進行方差檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源地喜馬拉雅紫茉莉土壤理化性質(zhì)

由表2可知，不同種源地土壤樣品中ZL的pH值為8.437，呈堿性，NM的pH值為6.620，呈酸性，其它3個種源地土壤樣品呈中性；LX樣品中總磷、總鉀和總氮含量最高，ZL的含量最少；土壤電導(dǎo)率以GB最大，其次是LX，NM最??；NM速效磷含量最高，GB含量最低；有機質(zhì)含量以LX最高，NM含量最低。以上結(jié)果表明，不同種源地喜馬拉雅紫茉莉土壤理化性質(zhì)差異較大。

表2 不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤理化性質(zhì)

2.2 不同種源地根際土壤細菌高通量測序結(jié)果及多樣性分析

高通量測序結(jié)果表明，5個種源地15個根際土壤樣品中共獲得237120條有效序列，隸屬36門85綱221目384科708屬；在97%相似度水平下，對各樣品進行OTU聚類，15個樣品共產(chǎn)生2435個OTUs，NM、GB、ZL、LX和SR分別產(chǎn)生473、487、531、415和529個OTUs。Alpha多樣性分析結(jié)果表明，不同種源地根際土壤細菌微生物多樣性不同。SR和GB樣品中細菌群落豐度較高，NM樣品豐度指數(shù)最低；GB樣品細菌群落均勻度和多樣性指數(shù)最高，ZL樣品最低。覆蓋度代表每個樣本的測序深度，5個種源地細菌群落測序覆蓋度均大于97%，說明測序數(shù)據(jù)能夠基本反映不同種源地細菌群落結(jié)構(gòu)組成。

表3 不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落Alpha多樣性

2.3 不同種源地根際土壤細菌在門、屬分類水平上的群落組成

2435 個OTUs隸屬36門708屬，相對豐度較高的細菌有8個門，NM、GB、ZL、LX和SR樣品中的優(yōu)勢門均為放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），其相對豐度分別為29.97%～57.89%和17.54%～40.39%（圖1A），不同根際土壤樣品細菌優(yōu)勢門相對豐度差異較大。在屬分類水平下（圖1B），相對豐度≤1.00%或未被聚類的細菌群落相對豐度占32.02%～41.10%，在相對豐度≥1.00%條件下，NM、GB、ZL、LX和SR樣品中分別有9、9、10、12、9個屬，其優(yōu)勢屬分別為Norank_f_norank_o_Gaiellales（5.52%）、Norank_f_norank_c_Subgroup_6（6.76%）、Methylocaldum（22.11%）、Blastococcus（5.40%）和Norank_f_norank_c_Subgroup_6（8.52%）。

圖1 不同種源地根際土壤細菌在門、屬分類水平的群落組成

2.4 不同種源地根際土壤細菌核心菌群

不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌在屬分類水平Venn圖分析結(jié)果（圖2）表明，5個種源地根際土壤細菌共鑒定到708屬，其中ZL樣本中鑒定到的細菌屬最多，LX樣本中最少。各樣本中共同擁有295個屬，NM、GB、ZL、LX和SR樣品中特有菌屬分別為80、11、43、2和18。根際土壤中至少在3個種源地中共存的核心菌屬有483個，占根際土壤細菌種類的68.22%。

圖2 不同種源地根際土壤細菌在屬分類水平上Venn圖和數(shù)量

2.5 不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落比較

基于R語言對不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落進行主坐標分析（PCoA，principal co-ordinates analysis），結(jié)果如圖3所示，主坐標分析1和主坐標分析2的貢獻率分別為45.77%和19.87%，累計65.64%，這是差異的主要影響因素。5個種源地根際土壤分成3大組，其中GB、SR和LX樣品聚在一起，說明野生喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，而人工種植的NM和ZL樣品各呈一組，說明環(huán)境因子是造成根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵因素。

圖3 細菌群落主坐標分析

2.6 土壤理化性質(zhì)對不同種源地根際土壤細菌群落的影響

利用5個不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤的pH值、總磷（TP）、總鉀（TK）、總氮（TN）、速效氮（AN）、速效磷（AP）、土壤電導(dǎo)率（EC）和有機質(zhì)（SOM）等環(huán)境因子對樣品OTUs聚類結(jié)果進行Spearman和RDA（Redundancy analysis）分析，結(jié)果（圖4A）表明，TP、TN、AN和SOM與放線菌門（Actinobacteria）豐度顯著正相關(guān)（P＜0.05），TK和EC與厚壁菌門（Firmicutes）豐度顯著負相關(guān)（P＜0.05），pH和EC與Patescibacteria豐度顯著負相關(guān)（P＜0.05），TK、TN和SOM與變形菌門（Proteobacteria）豐度顯著負相關(guān)（P＜0.05），而土壤理化因子與酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和Rokubacteria豐度相關(guān)性均不顯著。RDA1和RDA2的解釋度分別為40.09%和32.08%，合計72.17%（圖4B），說明pH、TP、TK、TN、AN、AP、EC和SOM是影響根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成的關(guān)鍵因素。

圖4 環(huán)境因子對不同種源地根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.7 不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落功能預(yù)測

為分析不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落功能，本試驗采用PICRUSt軟件對細菌COG功能進行預(yù)測。結(jié)果如圖5所示，共獲得24類COG功能，主要參與物質(zhì)運輸、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜轉(zhuǎn)運。與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)，土壤細菌主要參與氨基酸代謝、其他次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、能量代謝和輔酶因子及維生素代謝等，各樣品中參與各功能信息的物種豐度差異較大（表4），其中SR樣品中參與各種代謝通路的物種豐度均最高。

圖5 不同種源地根際土壤細菌COG功能預(yù)測

表4 不同種源地根際土壤中細菌群落的KEGG代謝通路豐度

3 討論與結(jié)論

喜馬拉雅紫茉莉作為一種傳統(tǒng)藏藥材，具有生肌、排石、利尿等功效且地上部分可作為動物飼料，有著廣泛具的應(yīng)用前景。根際土壤作為植物根系及根系分泌物的接觸區(qū)域，其微生物對促進植物養(yǎng)分吸收、生長及生理過程有重要影響［19］。因此本試驗通過高通量測序技術(shù)對西藏5個種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行研究并對其土壤理化性質(zhì)進行分析。5個種源地中GB樣品細菌多樣性指數(shù)最高，NM和ZL樣品中最低，總體而言，野生喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌多樣性指數(shù)均高于人工種植。有研究表明，使用化肥和農(nóng)藥可導(dǎo)致細菌多樣性降低［20］，NM和ZL為人工種植喜馬拉雅紫茉莉，其根際細菌多樣性低可能與使用化肥和農(nóng)藥有關(guān)。

有研究表明，在門分類水平下，土壤微生物優(yōu)勢類群基本相似，主要集中在10個門，如變形菌門和放線菌門等［21］。對寧夏枸杞土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的研究表明其優(yōu)勢類群是變形菌門、放線菌門和擬桿菌門［22］；孫曉等［23］研究表明藥用植物鎖陽根際土壤微生物的優(yōu)勢類群是變形菌門和放線菌門，西洋參根區(qū)土壤細菌標志類群為變形菌門和酸桿菌門［24］。本試驗結(jié)果表明，變形菌門和放線菌門是不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌優(yōu)勢類群，同時還發(fā)現(xiàn)不同種源地根際土壤均存在厚壁菌門。研究表明變形菌門和厚壁菌門有助于提高藥用植物的產(chǎn)量和質(zhì)量［19］。

野生喜馬拉雅紫茉莉主要分布在干熱河谷地帶，其生境以沙土為主。研究表明，根際微生物多樣性受氣候、地理位置及人類生產(chǎn)活動等因素影響［25，26］。Gong等［27］研究表明環(huán)境條件對紅樹林土壤微生物群落多樣性至關(guān)重要；尚天翠等［28］在研究不同生態(tài)環(huán)境野生櫻桃李土壤微生物時發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)分顯著影響土壤微生物數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，野生喜馬拉雅紫茉莉（GB、LX和SR）根際細菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，與人工栽培喜馬拉雅紫茉莉（ZL和NM）根際細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，且ZL和NM樣品細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，這可能與生態(tài)環(huán)境（NM地區(qū)屬熱帶濕潤和半濕潤氣候類型，ZL地區(qū)屬高原溫帶半干旱季風(fēng)氣候類型）和土壤理化性質(zhì)差異有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和鏈霉菌屬（Streptomyces）是不同根際土壤的核心微生物類群。假單胞菌屬和芽孢桿菌屬是植物根際土壤微生物的重要組成部分，具有促進植物生長和抑制病害的作用［29］；有研究表明芽孢桿菌屬具有提高植物抗旱能力［30］，這可能是喜馬拉雅紫茉莉具有較強抗旱能力的原因。鞘氨醇單胞菌屬能夠利用多種有機化合物，使番茄植株在貧瘠土壤中能夠較好生存［31］；能夠增加大豆IAA含量，促進大豆生長和抗?jié)B透脅迫［32］；同時能夠抵御植物根部病害，如增強萵苣抗根腐的能力［33］。鞘氨醇單胞菌屬作為不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤的核心微生物，可能有助于喜馬拉雅紫茉莉在貧瘠的土壤中生長。根瘤菌屬具有固定氮源和促進植物生長的作用；節(jié)桿菌屬和鏈霉菌屬具有代謝多種物質(zhì)的能力，廣泛分布于土壤中。節(jié)桿菌屬能夠增強谷子抗旱能力［34］。鏈霉菌屬能夠減輕干旱對玉米生長的影響，提高產(chǎn)量［35］。由此可見，不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤核心微生物類群可促進植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、增強抗旱能力、抵御病原菌的感染，從而改善根際土壤微生物環(huán)境，促進喜馬拉雅紫茉莉的生長發(fā)育。

藥材品質(zhì)不僅與環(huán)境因素有關(guān)，還與土壤微生物密切相關(guān)。采用PICRUSt進行基因功能預(yù)測，結(jié)果表明，不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌參與代謝的物種相對豐度較高。次生代謝產(chǎn)物如黃酮類、醌類化合物和糖脂類化合物是喜馬拉雅紫茉莉的主要藥用成分［36，37］，其根際土壤細菌基因中富含氨基酸、酮類、次級代謝產(chǎn)物、碳代謝、多糖合成和脂質(zhì)代謝等與植物藥用成分合成相關(guān)的通路，這些通路可能有助于其藥用成分的合成、積累和運輸。因此研究喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成，對獲取參與藥用成分合成相關(guān)基因信息、提高藥用植物品質(zhì)具有重要意義。

本試驗表明不同種源地喜馬拉雅紫茉莉根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的共性和差異，核心微生物類群可增強植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高抗旱能力和抵御植物病原菌感染，同時還發(fā)現(xiàn)了參與植物藥用成分合成相關(guān)的基因信息，為挖掘根際土壤微生物對藥用植物抗逆境、抗病害及促進藥用成分合成、積累等方面的功能及了解根際微生物與喜馬拉雅紫茉莉藥材品質(zhì)間的關(guān)系提供了理論依據(jù)。