王興亞，張守梅，郭玉秋，張娜娜，陳利容，龔魁杰，劉開昌

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，山東 濟南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院，山東 濟南 250100）

玉米收獲時籽粒含水量較高，一般在30%以上［1］，若直接脫粒胚部種皮易碎，為霉菌提供營養(yǎng)，入倉后存在存貯變質、毒素滋生、營養(yǎng)下降等諸多問題。為了降低籽粒含水量，玉米需要晾曬、烘干等環(huán)節(jié)，但成本較高［2］。因此，探索一種簡單、經(jīng)濟、有效的貯藏方法是解決這些問題的關鍵所在。有研究表明，玉米籽粒濕貯能夠更好地貯存，防止發(fā)霉變質，保持營養(yǎng)成分，減少浪費，降低飼料成本，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益［3］。

以往針對全株玉米青貯的研究表明，收獲期會影響青貯飼料的霉菌毒素、營養(yǎng)價值及發(fā)酵品質等［4-6］。過早收獲成熟度相對較低，玉米淀粉含量低，造成產(chǎn)量以及青貯飼料能值較低［7］。同時，容易造成梭菌繁殖，影響青貯品質［8］。收獲推后可以保證最佳的產(chǎn)量和營養(yǎng)價值［9］，但是真菌數(shù)量和真菌毒素含量隨著收獲期的延后而增加［10］。而且，收獲較晚會導致淀粉比例較高，難以實現(xiàn)高緊實度的青貯，限制乳酸菌的生長，青貯效果較差［11］。因此，適宜的收獲期是發(fā)酵的關鍵。

目前關于收獲期對玉米飼料發(fā)酵效果的研究主要集中在全株玉米和玉米秸稈，缺乏對玉米籽粒濕貯的研究。因此，本研究通過設置不同玉米籽粒收獲期，從霉菌毒素（嘔吐毒素）、營養(yǎng)價值、發(fā)酵品質方面探索最適玉米籽粒濕貯收獲期，以期為玉米籽粒濕貯的發(fā)展提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 濕貯玉米籽粒采集

濕貯玉米籽粒選用京農(nóng)科728（JNK728）品種籽粒。2020年6月25日播種于山東省農(nóng)業(yè)科學院濟陽實驗基地（117.22°E，36.98°N），10月15日收獲。

1.2 試驗設計

試驗共設3個處理，即分別在籽粒含水量20%～30%、30%～40%和40%～50%時收獲玉米并破碎，繼而采用厭氧發(fā)酵袋發(fā)酵，重復3次。玉米籽粒含水量用谷物水分測定儀測定。分別在濕貯前和濕貯后10、20、30、90 d取樣測定相關指標。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 真菌分離、純化和鑒定 稱取5 g樣品于含有45 mL滅菌蒸餾水的三角瓶中，密封后置于智能恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-100B，天津歐諾儀器股份有限公司）中150 r/min振蕩20 min，靜置5 min后，取1 mL上清液于裝有9 mL滅菌蒸餾水的離心管中，混勻后依次稀釋成10-2、10-3、10-4濃度梯度。取100μL稀釋液涂布于含有1%青霉素（10000 U/mL，）和硫酸鏈霉素（10 mg/mL）的PDA培養(yǎng)基上，每個濃度梯度設置3個重復。室溫下培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落形態(tài)進行計數(shù)和編號，并純化至單一菌落，用無菌保種管4℃保存。

將分離純化的菌落接種于PDA培養(yǎng)基上，室溫下培養(yǎng)3～5 d，待菌落直徑擴展到3～5 cm時，測量菌落大小，測定氣生菌絲狀態(tài)、菌落顏色和紋理形態(tài)以及是否產(chǎn)生可溶性色素等。在超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司）上用無菌接種針挑取少量菌絲至滴有無菌水的載玻片上，于光學顯微鏡（IX51，日本OLYMPUS公司）下觀察菌絲和孢子形態(tài)。

根據(jù)觀察結果，選取不同形態(tài)的菌株，采用熱裂解法［12］進行真菌DNA組提取。采用基于18S核糖體DNA的ITS通用引物進行DNA片段擴增［13］。

1.3.2 嘔吐毒素測定 嘔吐毒素采用酶聯(lián)免疫吸 附 法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定，按照試劑盒上的說明書逐步加樣進行反應。利用酶標儀（GENIOS Plus，瑞士TECAN公司）在450 nm和630 nm雙波長下檢測樣品反應，讀取各孔的吸光度值，計算百分吸光率。其公式如下：

式中，B為標準品或樣品的吸光度值，B0為空白對照吸光度值。

以標準品百分吸光率為縱坐標，以對應毒素標準品濃度（μg/kg）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。根據(jù)標準曲線，計算樣品嘔吐毒素含量。

1.3.3 營養(yǎng)價值指標測定 干物質（DM）和粗灰分（Ash）含量測定參考《飼料分析及飼料質量檢測技術》［14］進行測定。粗蛋白質（CP）含量測定采用凱氏定氮法。淀粉含量測定采用蒽酮比色法。

1.3.4 發(fā)酵指標測定 稱取20 g樣品，加入180 mL無菌蒸餾水，用榨汁機榨汁后過濾，取濾液用于發(fā)酵指標測定。使用pH計（LE438，METTLER TOLEDO）測定pH值。取濾液8 mL于10 mL離心管中，加入25%偏磷酸1.6 mL，置于-4℃冰箱過夜，10000 r/min離心，取上清液，于0.45μm孔徑水相濾膜下過濾用于指標測定。其中，乳酸含量采用對羥基聯(lián)苯比色法測定，氨態(tài)氮（NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定。費氏評分（FS）采用王國艮［8］的方法進行，計算公式：

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著水平設置為0.05，采用最小顯著法（LSD法）進行。SigmaPlot 10.0作圖。測序結果用Chromas軟件進行序列分析和校正，在Genebank中進行在線比對，獲得較高同源性的核苷酸序列，再初步確定其發(fā)育地位。

2 結果與分析

2.1 不同收獲期對玉米籽粒濕貯真菌數(shù)量的影響

玉米籽粒濕貯前，分離出的霉菌種類主要為鐮刀菌屬Fusarium、曲霉屬Aspergillus、青霉屬Penicillium。隨著收獲期的推遲，霉菌數(shù)量增加。玉米籽粒濕貯能明顯降低霉菌數(shù)量。發(fā)酵30 d，除20%～30%籽粒含水量下霉菌數(shù)量降低94.8%外，其余處理霉菌數(shù)量均降低100%，即降至零。發(fā)酵過程中，分離出的酵母菌以畢赤酵母Pichia kudriavzevii為主，酵母菌數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，20%～30%籽粒含水量下酵母菌較活躍（表1）。

表1 不同收獲期玉米籽粒濕貯真菌數(shù)量變化

2.2 不同收獲期對玉米籽粒濕貯嘔吐毒素含量的影響

由圖1可知，收獲期對玉米籽粒嘔吐毒素含量有顯著影響。濕貯前，20%～30%含水量下籽粒嘔吐毒素含量為325.4μg/kg，顯著高于其它兩個處理。其它處理籽粒嘔吐毒素含量均較低，在1.5～31.5μg/kg之間。玉米籽粒濕貯能顯著降低嘔吐毒素含量。發(fā)酵10 d，20%～30%含水量下籽粒嘔吐毒素含量降低91%，降至30.5μg/kg。發(fā)酵90 d，各處理籽粒嘔吐毒素含量在1.7～32.3 μg/kg之間，均低于中國飼料衛(wèi)生標準中植物性飼料原料的最高限量5 mg/kg（GB 13078—2017）。

圖1 不同收獲期玉米籽粒濕貯嘔吐毒素含量變化（干基）

2.3 不同收獲期對玉米籽粒濕貯營養(yǎng)品質的影響

由表2可以看出，不同收獲期玉米籽粒的干物質、粗灰分、蛋白質和淀粉含量均存在明顯差異。隨著收獲期推遲，籽粒干物質、蛋白質含量顯著增加（P＜0.05），粗灰分含量降低；20%～30%含水量下籽粒淀粉含量顯著高于其它兩個處理。

表2 不同收獲期玉米籽粒濕貯營養(yǎng)品質變化（干基） （%）

隨著發(fā)酵時間延長，相同含水量下籽粒干物質無明顯變化；30%～40%和40%～50%含水量下粗灰分含量降低，20%～30%含水量下粗灰分含量增加；發(fā)酵30 d，蛋白質含量明顯增加；淀粉含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。

2.4 不同收獲期對玉米籽粒濕貯發(fā)酵品質的影響

由表3看出，濕貯前，20%～30%含水量下pH值顯著低于其它兩個處理，40%～50%含水量下NH3-N含量顯著低于其它兩處理（P＜0.05）。

表3 不同收獲期玉米籽粒青貯發(fā)酵品質變化（干基）

隨著發(fā)酵時間延長，各處理玉米籽粒pH值整體呈降低趨勢，高水分含量下pH值降速較快。發(fā)酵30 d，除20%～30%含水量外，其它兩處理pH值均降至4.3以下；發(fā)酵90 d，20%～30%含水量下pH值仍為4.71。發(fā)酵90d，30%～40%和40%～50%含水量下乳酸和NH3-N含量顯著高于20%～30%含水量（P＜0.05）。發(fā)酵30 d和90 d，30%～40%含水量下費氏評分最高。

3 討論與結論

3.1 不同收獲期對玉米籽粒濕貯真菌及嘔吐毒素的影響

本研究中，隨著收獲期推遲，霉菌數(shù)量以及嘔吐毒素含量均增加。主要是因為作物生育后期，隨著收獲期推遲，真菌感染、生長以及毒素積累的風險 將 會 增 加［10，15］。本 研 究 中，發(fā) 酵30 d，20%～30%含水量下霉菌數(shù)量降低94.8%，其它兩處理均降低100%，即降至零，這可能是乳酸菌在發(fā)揮作用。因為發(fā)酵過程中起主導作用的是乳酸菌，乳酸菌通過產(chǎn)生乳酸使?jié)褓A玉米籽粒變?yōu)樗嵝?，逐漸形成不利于腐敗菌生長的條件［16］。但是，收獲期會影響發(fā)酵過程中的乳酸菌生長，含水量較低時乳酸菌生長受到抑制，而此時酵母菌與乳酸菌爭奪糖分，快速繁殖［17］。因此，20%～30%含水量下酵母菌含量較高。本研究中，發(fā)酵10 d，20%～30%含水量下嘔吐毒素含量降低91%。有研究表明，乳酸菌和酵母菌均可以結合或降解發(fā)酵飼料中的霉菌毒素，使?jié)褓A過程中真菌毒素含量下降［18］。但是，嘔吐毒素下降的具體原因以及機理還需要進一步探索。

3.2 不同收獲期對玉米籽粒濕貯營養(yǎng)品質的影響

隨著收獲期的改變，玉米籽粒的營養(yǎng)成分也發(fā)生差異性變化［19］。本研究中，隨著收獲期推遲，玉米籽粒濕貯前后均表現(xiàn)為干物質、蛋白質和淀粉三者含量增加。這和以往研究結果一致［20］。因為籽粒形成期葉片光合產(chǎn)物和莖葉中貯存的干物質集中向籽粒轉運，籽粒干物質量逐漸增加，其淀粉和蛋白質含量也均在蠟熟后期至成熟階段呈現(xiàn)最大值。

3.3 不同收獲期對玉米籽粒濕貯發(fā)酵品質的影響

研究表明，收獲期對玉米籽粒濕貯具有顯著影響，過低的籽粒含水量不利于發(fā)酵［21］。本研究中，發(fā)酵90 d，20%～30%含水量下pH值仍為4.71，未達到發(fā)酵要求標準，并且其乳酸和NH3-N含量顯著低于高含水量處理。主要是因為適宜的水分是乳酸菌生長發(fā)酵的必要條件，較高水分含量乳酸菌比較活躍，而水分含量低會使物料難以壓實，乳酸菌發(fā)酵緩慢，產(chǎn)酸較少，pH值也降低的相對緩慢［19］。微生物的蛋白質水解過程會影響發(fā)酵玉米的NH3-N含量，高水分玉米由于發(fā)酵比較活躍，因此NH3-N含量高，這與Schmidt等（2009）［22］的研究結果一致。費氏評分主要由干物質含量和pH值計算得到，是評估發(fā)酵效果的標準之一［5］。本研究中，30%～40%含水量下費氏評分最高，與20%～30%含水量相比，其pH值降速較快，pH值較低，同時干物質含量高于40%～50%含水量處理。

綜上所述，濕貯玉米籽粒最佳收獲期為含水量30%～40%。