周方園，高云霄，趙曉燕，張廣志，謝雪迎，張新建

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生態(tài)研究所/山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013）

作物根際微生物在植物的生長、營養(yǎng)吸收、病害防御等方面發(fā)揮著重要作用［1-4］，尤其一些根際細(xì)菌類群，具有較高的固氮、解磷、解鉀和產(chǎn)植物生長素活性［3］。近年來，在作物種植過程中大量使用化學(xué)肥料造成土壤氮磷過載和酸化、作物增產(chǎn)受阻，越來越多的科研工作者開始從根際微生物中挖掘、開發(fā)新的微生物資源，研發(fā)微生物肥料或者制劑來促進(jìn)作物生長和產(chǎn)量提高［5，6］。作物根際微生物成為分離促生菌的重要來源。

促生菌主要從土壤栽培的健康作物根際分離篩選［7-10］。但隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，種植技術(shù)不斷更新?lián)Q代，作物栽培介質(zhì)也不再局限于土壤，各種人工合成的育苗栽培基質(zhì)不斷出現(xiàn)［11-13］，作物的根際微生物類群也將隨之發(fā)生改變。從土壤栽培作物根際分離到的促生菌在基質(zhì)栽培條件下可能不能定殖發(fā)揮功能。因此，亟需從基質(zhì)栽培的作物根際篩選新的促生微生物，為開發(fā)適應(yīng)新栽培技術(shù)的菌肥或菌劑產(chǎn)品提供菌種資源。

黃瓜是我國大規(guī)模種植的重要蔬菜作物，經(jīng)濟(jì)效益巨大。目前受反季蔬菜價(jià)格優(yōu)勢的影響，日光溫室黃瓜種植面積巨大［14-16］，并且越來越多的農(nóng)戶選擇使用無土基質(zhì)種植［17，18］，這既能夠減少根部病害的發(fā)生，也有利于黃瓜根系延伸，提高肥料利用率，實(shí)現(xiàn)黃瓜增產(chǎn)。本研究從山東3地采集基質(zhì)栽培的設(shè)施黃瓜根際樣本，通過16S rRNA高通量測序技術(shù)測定黃瓜根際細(xì)菌的多樣性，并分離鑒定根際細(xì)菌，通過固氮、解磷、產(chǎn)吲哚乙酸、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)ACC脫氨酶活性篩選部分促生菌株；最后通過盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證菌株的促生活性，以期為開發(fā)適應(yīng)基質(zhì)栽培黃瓜的菌劑和菌肥產(chǎn)品提供菌種資源，并為未來尋找新的促生菌資源提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 試劑 10×磷酸鹽緩沖液購自生工生物工程（上海）股份有限公司，用蒸餾水稀釋10倍后滅菌備用；16SrRNA基因擴(kuò)增引物和Taq聚合酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司；植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。Salkowski顯色劑：0.5 mol/L FeCl3與35%HClO4體積比按1∶50配制。分析純吲哚乙酸購自國藥集團(tuán)。PVK無機(jī)磷培養(yǎng)基、阿須貝氏培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)基、改良CAS固體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購自北京酷來搏科技有限公司。金氏液體培養(yǎng)基按照Glickmann等［19］方法進(jìn)行配制，加入1%瓊脂制備固體培養(yǎng)基。栽培基質(zhì)（淀粉樹脂泡沫粒子25%、牛糞秸稈發(fā)酵物35%、草炭40%）購自山東商道生物科技股份有限公司。

引物序列：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′；799F：5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′，1193R：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。

1.1.2 儀器 PCR儀購自Applied Biosystems公司。NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 黃瓜根際細(xì)菌的高通量測序

1.2.1 測序樣本的制備 2021年1—3月在山東省壽光市（E118.715279°、N36.875423°；山東魯壽農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的品種強(qiáng)生719）、蘭陵縣（E116.413384°、N39.910925°；山東魯壽農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的品種綠蒂802）、濟(jì)南市（E117.101818°、N36.584433°；壽光市旭冉農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)的品種博盛99）的日光溫室中部每棚采集2株共計(jì)6株健康黃瓜，2個(gè)樣本相互間隔10 m以上。測序樣本的制備參照Zhang等［20］的方法：采集后剪掉植株地上部分，抖落附著于根部的土壤，剪取部分主根、側(cè)根以及不定根約10 g至滅菌50 mL離心管，每采集完一株，剪刀均用75%乙醇消毒并用滅菌水沖洗3次后再使用。采集完畢后，將裝有樣本的離心管置于冰盒內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。隨后，每個(gè)樣品管內(nèi)加入滅菌1×PBS緩沖液35 mL，置于搖床中180 r/min清洗20 min后，使用無菌濾紙吸干根表面水分，如此反復(fù)清洗3次，取0.2 g使用液氮充分研磨，用植物組織DNA提取試劑盒提取微生物總DNA，使用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)對提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。

1.2.2 黃瓜根際細(xì)菌多樣性高通量測序 使用特異引物799F和1193R擴(kuò)增根際細(xì)菌16SrRNA的V5-V7區(qū)，PCR產(chǎn)物5′端添加barcode序列（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供）。PCR反應(yīng)體系（50μL）：DNA模板5μL（10 ng），引物各1.5μL，2 mmol/L dNTPs 5μL，MgSO42μL，10×KOD Buffer 5μL，KOD Plus 1μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃2 min；94℃30 s，63℃30 s，68℃30 s，30個(gè)循環(huán)；68℃5 min。每個(gè)樣品3次重復(fù)，將3次PCR產(chǎn)物混合用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行建庫測序，測序平臺為Illumina Miseq PE250。

1.2.3 黃瓜根際細(xì)菌高通量測序數(shù)據(jù)分析 測序數(shù)據(jù)使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的“生信云”平臺（www.majorbio.com）進(jìn)行分析。在云平臺中，使用QIIME v.1.9.1（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）軟件包對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控檢測和數(shù)據(jù)分析［21］。數(shù)據(jù)處理前，剔除測序數(shù)據(jù)中長度低于200 bp、含有模糊堿基以及引物的錯(cuò)配數(shù)在2個(gè)堿基以上的序列。篩選后的序列用USEARCH軟件包中的UPARS按照97%相似性閾值對序列進(jìn)行OTU聚類［22］，選取豐度最高的序列作為該OTU的代表性序列并使用RDP classifier v.2.2進(jìn)行分類學(xué)分析，使用SILVA數(shù)據(jù)庫（http：//www.arb-silva.de）將置信閾值設(shè)為70%進(jìn)行分類學(xué)注釋［23，24］，統(tǒng)計(jì)不同分類水平下各個(gè)樣本的OTU組成和reads數(shù)。由于測序平臺和注釋數(shù)據(jù)庫的限制，本試驗(yàn)中部分序列不能注釋到種，因此根據(jù)各序列信息使用FastTree 2.1.3在屬水平構(gòu)建物種組成的最大似然樹，并統(tǒng)計(jì)在屬水平上的reads數(shù)作為物種豐度。

1.3 黃瓜根際細(xì)菌的分離鑒定

準(zhǔn)確稱取1.2.1中清洗后的6份根系樣本各0.2 g加入滅菌1×PBS緩沖液1 mL充分研磨，然后用1×PBS緩沖液10倍梯度稀釋至10-8，每個(gè)濃度用移液槍移取50μL滴加到TSA平板上，立即用無菌三角形玻璃涂布棒涂布均勻，待菌液充分吸收后封口膜封口，倒置于28℃培養(yǎng)36 h后，選擇顏色、大小、厚度、透明度和質(zhì)地不同的菌落，在TSA培養(yǎng)基上用接種環(huán)采用三區(qū)劃線法進(jìn)行純化和培養(yǎng)，得到菌株后反復(fù)劃線3次得到純菌株。根據(jù)菌落形態(tài)對菌株進(jìn)行分組。

選取代表性菌株分別接種至裝有2 mL TSB液體培養(yǎng)基的試管中，28℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。之后轉(zhuǎn)移1 mL菌液到2 mL離心管，13000 r/min離心2 min后收集菌體，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA，隨后用27F和1492R對細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：DNA 1μL（20 ng），引物各0.5μL，2×TaqPCR Buffer 12.5μL，ddH2O 10.5μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，片段大小為1500 bp左右的樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，平臺為Roche 454。所得序列上傳至GenBank，并與GenBank中親緣關(guān)系較近的菌株進(jìn)行序列比較，選取Anabaena affinis（AF247591）為外群，使用Mega X最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap值設(shè)置為1000）進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。

1.4 黃瓜根際細(xì)菌中促生細(xì)菌的篩選

1.4.1 菌株固氮能力的測定 將分離到的菌株（每個(gè)種選一株，下同）用TSB過夜培養(yǎng)，5000 r/min離心5 min后收集菌體，用1×PBS緩沖液反復(fù)清洗3遍后制成菌懸液（約108cfu/mL），接種50μL菌懸液至阿須貝氏培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿直徑30 mm，下同）上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌落的生長狀況，根據(jù)菌落直徑大小、菌苔厚度判斷固氮能力。每個(gè)菌株3次重復(fù)。

1.4.2 菌株解無機(jī)磷能力測定 參照1.4.1制備菌懸液，接種50μL菌懸液至PVK無機(jī)磷培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌落的生長狀況，根據(jù)菌落周圍透明圈的大小判斷解磷能力。每個(gè)菌株3次重復(fù)。

1.4.3 菌株分泌吲哚乙酸能力測定 參照1.4.1制備菌懸液，接種50μL菌懸液至金氏固體培養(yǎng)基中，37℃黑暗培養(yǎng)48 h后，清除平板表面的菌落后，取4 mL Salkowski顯色劑滴加到平板上，25℃避光反應(yīng)60 min，觀察菌落周圍是否有粉紅色暈圈，暈圈越大、顏色越紅表示產(chǎn)吲哚乙酸能力越強(qiáng)。每個(gè)菌株3次重復(fù)。

1.4.4 菌株產(chǎn)ACC脫氨酶活性測定 參照1.4.1制備菌懸液，接種50μL菌懸液至ADF培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌落的生長狀況，能夠在ADF培養(yǎng)基上生長的菌株即能夠產(chǎn)ACC脫氨酶。菌株生長越快，產(chǎn)ACC脫氨酶活性越強(qiáng)。每個(gè)菌株3次重復(fù)。

1.4.5 菌株產(chǎn)鐵載體能力的測定 參照1.4.1制備菌懸液，接種50μL菌懸液至CAS培養(yǎng)基平板上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，菌落周圍能夠產(chǎn)生桔黃色暈圈的菌株即能夠產(chǎn)鐵載體。暈圈越大，產(chǎn)鐵載體能力越強(qiáng)。每個(gè)菌株3次重復(fù)。

1.5 黃瓜根際促生細(xì)菌的盆栽驗(yàn)證

根據(jù)1.4試驗(yàn)結(jié)果，選取具有固氮、解磷、產(chǎn)吲哚乙酸、產(chǎn)鐵載體或者產(chǎn)ACC脫氨酶活性的菌株于2021年5月中旬在山東省科學(xué)院生態(tài)研究所人工溫室（溫度25℃、光周期L∶D=16∶8、光照強(qiáng)度20000 lx）內(nèi)開展盆栽試驗(yàn)，驗(yàn)證菌株對黃瓜幼苗的促生效果。用TSB培養(yǎng)基28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后收集菌體，用無菌水制備各菌株的菌懸液（108cfu/mL）。將滅菌（121℃高壓蒸汽滅菌15 min，反復(fù)2次）后的栽培基質(zhì)用滅菌水充分浸濕后填裝于一次性紙杯內(nèi)備用。黃瓜種子用稀釋100倍的40%福爾馬林溶液消毒30 min，無菌水反復(fù)沖洗3次，于浸濕的滅菌紗布28℃黑暗條件下催芽24 h，選取出芽整齊的種子每個(gè)紙杯點(diǎn)播1粒。前期平板活菌計(jì)數(shù)預(yù)試驗(yàn)表明，在日光溫室條件下基質(zhì)中萌芽的黃瓜種子表面約有107～109個(gè)細(xì)菌，因此，本試驗(yàn)中接種菌懸液1 mL（約108cfu）于紙杯內(nèi)種子上，表面覆蓋基質(zhì)后于25℃、光周期L∶D=16∶8培養(yǎng)，出苗后每隔一天澆水10 mL，出苗7 d后測量株高、莖粗、地上和地下部分鮮重。株高：用直尺測量根到生長點(diǎn)的長度（cm）；莖粗：用游標(biāo)卡尺測量平行于子葉方向子葉下2 cm處（mm）；地上、地下部鮮重采用萬分之一電子天平稱重（g）；地上、地下部干重：將幼苗鮮樣于烘箱105℃殺青15 min后，80℃烘干至恒重，然后用萬分之一電子天平稱重（g）；壯苗指數(shù)=（莖粗/株高+地下干重/地上干重）×單株干重。以接種滅菌水為對照，每個(gè)菌株6次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 24.0中單因素方差分析（Duncan’s檢驗(yàn)）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Sigmaplot 14.0和R 3.3.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)栽培的黃瓜根際細(xì)菌多樣性組成

高通量測序總共得到102159條reads，大部分長度為361～389 bp，平均長度375 bp。經(jīng)注釋后總共鑒定到64個(gè)OTU，分屬于5門6綱16目23科50屬。由圖1可知，所有樣品稀釋曲線均趨于平緩，且樣品α多樣性指數(shù)中Coverage指數(shù)均大于98.5%，說明本試驗(yàn)測序數(shù)據(jù)充分，能夠保證后續(xù)分析可靠性。

圖1 6個(gè)黃瓜根際樣本的測序稀釋曲線和Coverage指數(shù)

如圖2，在屬水平上，豐度較高的屬包括假苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、假單胞菌屬（Pseud-omonas）、叢毛單胞菌科某屬（u_Comamonadaceae）、食酸菌屬（Acidovorax）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、黃單胞菌科某屬（u_Xanthomonadaceae）、砂單胞菌屬（Arenimonas）、新草螺菌屬（Noviherbaspirillum）、嗜甲基菌屬（Methylophilus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、根瘤桿菌屬（Rhizobacter）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、快生根瘤菌屬（Rhizobium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）、草酸桿菌科某屬（u_Oxalobacteraceae）、甲基營養(yǎng)菌屬（Methyloversatilis）、馬賽菌屬（Massilia）、玫瑰彎菌科某屬（u_Roseiflexaceae），在整個(gè)根際細(xì)菌群落中所占比例分別為9.92%、8.62%、8.26%、6.07%、4.85%、4.56%、3.54%、3.51%、3.47%、2.83%、2.61%、2.58%、2.37%、2.11%、2.00%、1.74%、1.52%、1.35%、1.27%、1.11%、1.02%、1.01%。

圖2 黃瓜根際細(xì)菌中屬水平系統(tǒng)發(fā)育樹和測序reads數(shù)量

2.2 黃瓜根際細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

從黃瓜根際共分離到48株細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA鑒定屬于26個(gè)種，分屬于變形菌門（Proteobacteria，圖3）、厚壁菌門（Firmicutes，圖4a）、擬桿菌門（Bacteroidetes，圖4b）和放線菌門（Actinobacteria，圖4c）的13個(gè)屬。26個(gè)種的細(xì)菌分別為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Paenarthrobacter ureafaciens）、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、臺 灣金 黃桿 菌（Chryseobacterium taiwanense）、產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）、鏈霉菌（Streptomycessp.）、農(nóng)業(yè)生技所副芽孢桿菌（B.niabensis）、白色假芽孢桿菌（Falsibacillussp.）、環(huán)狀芽孢桿菌（B.circulans）、嗜溫鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium thalpophilum）、海水芽孢桿菌（B.aquimaris）、黃桿菌的兩個(gè)種（Flavobacteriumsp.D9，F(xiàn)lavobacteriumsp.A3、A9）、類產(chǎn)堿假單胞菌（P.pseudoalcaligenes）、德氏食酸菌（Acidovorax delafieldii）、產(chǎn)堿假單胞菌（P.alcaligenes）、曼多辛假單胞菌（P.mendocina）、金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）、植物內(nèi)芽孢桿菌（B.endophyticus）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、水原假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas suwonensis）、巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、干酪棒桿菌（Corynebacterium casei）、常州鞘氨醇桿菌（S.changzhouense）、貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。

圖3 分離自黃瓜根際樣本細(xì)菌基于16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖4 厚壁菌門（a）、擬桿菌門（b）和放線菌門（c）的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 黃瓜根際促生細(xì)菌的篩選結(jié)果

如圖5，在固氮菌篩選培養(yǎng)基上菌株D5幾乎不生長，而菌株B3、D3、F5、B4能夠正常生長，說明該4株細(xì)菌具有固氮活性，其中以菌株D3和F5的固氮活性較高（表1）。

圖5 黃瓜根際細(xì)菌中具有固氮活性的菌株

如圖6，在PVK無機(jī)磷培養(yǎng)基上，菌株F4菌落周圍無明顯透明圈，而菌株A2、B3、C9菌落周圍均產(chǎn)生明顯透明圈，其中菌株A2和C9的解磷活性較高（表1）。

圖6 黃瓜根際細(xì)菌中具有解無機(jī)磷活性的菌株

如圖7，菌株B1在金氏培養(yǎng)基上生長后使用顯色液無紅色出現(xiàn)，說明菌株B1不產(chǎn)吲哚乙酸，而菌株B3、B5、E6平板在染色后出現(xiàn)粉紅色暈圈，說明上述3菌株能夠產(chǎn)生吲哚乙酸（表1）。

圖7 黃瓜根際細(xì)菌中具有產(chǎn)吲哚乙酸活性的菌株

如圖8，菌株B4在ADF培養(yǎng)基上幾乎不能生長，而菌株E6、F4、A1、C4、E1、B1、B5、F5、D3能快速生長，說明上述菌株具有產(chǎn)ACC脫氨酶活性，其中以B5、F5、D3活性最高（表1）。

圖8 黃瓜根際細(xì)菌中具有產(chǎn)ACC脫氨酶活性的菌株

如圖9，菌株B10和F5在CAS培養(yǎng)基上未產(chǎn)生黃色暈圈，菌株F7、A1、E6、B4、C9、D3、A5、D10菌落周圍均產(chǎn)生明顯黃色暈圈，說明上述菌株具有產(chǎn)鐵載體活性，其中以F7、A1、E6、B4、D10產(chǎn)鐵載體活性較強(qiáng)（表1）。

表1 黃瓜根際細(xì)菌中的促生菌株

圖9 黃瓜根際細(xì)菌中具有產(chǎn)鐵載體活性的菌株

2.4 根際促生細(xì)菌對黃瓜的促生效果

盆栽促生試驗(yàn)結(jié)果表明，不同菌株對黃瓜幼苗的根干重產(chǎn)生顯著影響（表2，one-way ANOVA，F(xiàn)16，85=1.787，P=0.046）。與對照相比，菌株D10、C4、C9顯著提高黃瓜幼苗根部干重約87.2%、74.4%、65.2%，而菌株E6、B4、D3、F4、A2、B3、F7、A1、B1、E1、F5、B5雖能夠提高黃瓜幼苗根干重，但與對照差異不顯著；菌株A5對根干重具有輕微的抑制作用。

不同菌株對黃瓜幼苗的莖干重產(chǎn)生顯著影響（表2，one-way ANOVA，F(xiàn)16，85=1.942，P=0.027），其中菌株C9、F4、D10、A2、B3、F7、E6、D3、E1、A1、B1、C4處理后分別顯著提高黃瓜幼苗莖干重約77.0%、67.9%、66.5%、64.6%、63.5%、56.2%、55.1%、53.4%、53.1%、52.9%、48.2%、45.3%；菌株B5、B4、F5、A5雖提高了黃瓜幼苗的莖干重，但與對照無顯著差異。

不同菌株對黃瓜幼苗的根莖比產(chǎn)生顯著影響（表2，one-way ANOVA，F(xiàn)16，85=3.863，P＜0.001），其中菌株C4處理后顯著提高了黃瓜幼苗根莖比約17.0%，菌株B4、D10雖提高了黃瓜幼苗的根莖比，但與對照無顯著差異；菌株A1、C9、F7、B1、A2、B3、F4、F5、B5、E1、A5均降低了黃瓜幼苗的根莖比，其中菌株A5差異顯著。

黃瓜幼苗植株干重受菌株影響顯著（表2，oneway ANOVA，F(xiàn)16，85=1.830，P=0.040）。菌株C9、D10、F4、A2、B3、E6、F7、D3、A1、C4、E1、B1處理后黃瓜幼苗植株干重顯著增加75.0%、70.1%、65.2%、62.1%、60.9%、55.8%、54.2%、53.6%、51.0%、50.4%、49.2%、46.3%；而菌株B4、B5、F5、A5雖提高了黃瓜植株干重，但與對照差異不顯著。

黃瓜幼苗壯苗指數(shù)受菌株影響顯著（表2，Welch’s ANOVA，F(xiàn)16，31.49=1.761，P＜0.001）。菌株D10、C4、C9、E6、B4分別顯著提高黃瓜幼苗壯苗指 數(shù)109.7%、95.2%、89.5%、79.0%、75.8%，而菌株F4、D3、A2、B3、B5、F7、A1、B1、E1、F5雖提高了黃瓜幼苗的壯苗指數(shù)，但與對照差異不顯著。

表2 不同菌株對黃瓜幼苗根干重、莖干重、根莖比、植株干重、壯苗指數(shù)的影響

3 討論

本研究檢測了基質(zhì)栽培的黃瓜根際細(xì)菌組成，豐度較高的屬包括Phenylobacterium、Pseudomonas、Acidovorax、Flavobacterium、Arenimonas、Noviherbaspirillum、Methylophilus、Paenibacillus、Bacillus、Sphingomonas、Rhizobacter、Cellvibrio、Rhizobium、Enterobacter、Devosia等以及一些不能鑒定到屬的細(xì)菌（圖2）。上述種類的細(xì)菌類群在以往研究中也有報(bào)道。例如，Pseudomonas屬在一些溫室黃瓜的根際中檢測到［25，26］，另外，本研究發(fā)現(xiàn)的Devosia、Dyella、Flavobacterium、Methyloversatilis、Sphingomonas、Rhizobacter、Acidovorax、Bradyrhizobium、Noviherbaspirillum、Shinella、Pseudomonas等屬細(xì)菌在使用基質(zhì)栽培的黃瓜幼苗根際也有發(fā)現(xiàn)［11］。一般來說，植物的根系會(huì)分泌特定的分泌物，這些分泌物是根際微生物群落組裝的重要驅(qū)動(dòng)因素。受到這一因素的影響，某些特殊種類的微生物會(huì)在植物根際富集，形成根際微生物的核心菌群；但由于栽培介質(zhì)理化性質(zhì)、土著菌群的差異及不同栽培模式、環(huán)境下的植物根際微生物組存在一定差異［27］。本研究中豐度較高的細(xì)菌類群和已經(jīng)報(bào)道的黃瓜根際細(xì)菌種類很有可能屬于黃瓜根際細(xì)菌的核心菌群，這些菌群在黃瓜生長過程中發(fā)揮著重要功能，其中可能存在一些根際促生菌。

本研究使用TSB培養(yǎng)基分離到了黃瓜根際細(xì)菌群落中的大部分優(yōu)勢屬，如Pseudomonas、Acidovorax、Flavobacterium、Bacillus、Sphingomonas等；也有部分優(yōu)勢屬未分離到，如Phenylobacterium、Arenimonas等。分離作物根際細(xì)菌常用的培養(yǎng)基一般包括TSB［20］、NB［28］、LB［6］等，在高通量分離技術(shù)中，也有學(xué)者使用稀釋后的TSB分離作物根際細(xì)菌［20］，其主要目的是分離出生長速度較慢的細(xì)菌種類。本研究目的在于從黃瓜根際分離出易培養(yǎng)、生長速度快的細(xì)菌種類以便于后期開發(fā)應(yīng)用，因此選取了比較常用的TSB培養(yǎng)基，這也導(dǎo)致未分離到一些生長速度比較慢、對營養(yǎng)成分要求較高的細(xì)菌種類。

本研究選用固氮、解無機(jī)磷、產(chǎn)IAA、產(chǎn)ACC脫氨酶、產(chǎn)鐵載體5個(gè)指標(biāo)從黃瓜易培養(yǎng)的根際細(xì)菌中定性篩選根際促生菌。通過固氮培養(yǎng)基，從黃瓜根際細(xì)菌中篩選出固氮菌B.subtilis、B.megaterium、A.delafieldii、A.tumefaciens（表1）。芽孢桿菌屬中多種細(xì)菌具有固氮功能，如B.subtilis固氮功能在多種作物如番茄［29］等已有報(bào)道，固氮菌B.megaterium在杉木土壤中的豐度也很高［30］。也有研究報(bào)道了A.tumefaciens的固氮活性［31］。本研究首次發(fā)現(xiàn)A.delafieldii具有固氮活性，之前相關(guān)研究只推測這一細(xì)菌可能具有固氮活性［32］。本研究共篩選到3株具有解無機(jī)磷活性的菌株（表1），其中包括兩株芽孢桿菌B.cereus和B.subtilis，與以往研究一致［33］；已有研究報(bào)道Pseudomonas屬細(xì)菌具有解磷活性［34］，本研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān).alcaligenes具有解磷活性。IAA是重要的植物激素，能夠促進(jìn)作物生長。本研究從黃瓜根際細(xì)菌中共分離到3株具有產(chǎn)IAA活性的菌，分別為B.subtilis、B.megaterium、C.indologenes（表1）。已有研究表明，芽孢桿菌屬中的多個(gè)種能夠產(chǎn)生IAA［35］。ACC脫氨酶對多種作物具有顯著的促生作用，這種酶尚未在植物中發(fā)現(xiàn)，其主要來源于一些土壤微生物［36］。本研究發(fā)現(xiàn)了9種能夠產(chǎn)ACC脫氨酶活性的菌株，其中S.changzhouense、B.megaterium、B.endophyticus、A.delafieldii、S.thalpophilum、C.indologenes、P.ureafaciens、A.tumefaciens產(chǎn)ACC脫氨酶活性已有廣泛報(bào)道［37-44］，而細(xì)菌C.casei是首次被發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)ACC脫氨酶活性。本研究共篩選到8種具有產(chǎn)鐵載體活性的細(xì)菌，其中芽孢菌屬的B.subtilis、B.megaterium、B.aquimaris、B.velezensis產(chǎn)鐵載體活性較高，以往也有廣泛報(bào)道［45］。此外，與以往報(bào)道一致，細(xì)菌A.delafieldii［38］、C.indologenes［46］、P.alcaligenes［47］均能夠產(chǎn)生鐵載體。本研究中首次發(fā)現(xiàn)S.changzhouense具有產(chǎn)鐵載體活性，以往只在其同屬的一些菌株中有過報(bào)道［48］。本研究篩選到的促生細(xì)菌如Pseudomonas、Acidovorax、Bacillus和Sphingomonas在黃瓜根際微生物群落中的相對豐度均較高（圖2），與前人研究結(jié)果一致［3］。

目前在根際促生菌的開發(fā)應(yīng)用過程中，往往存在田間實(shí)際使用效果不穩(wěn)定的情況。因此本研究在室內(nèi)開展了盆栽試驗(yàn)，篩選到部分效果較好的菌株。如菌株D10（B.aquimaris）、C9（P.alcaligenes）、C4（B.endophyticus）對黃瓜幼苗的地上植株、地下根系的生長均具有顯著的促進(jìn)作用（表2）。Bacillus和Pseudomonas屬細(xì)菌是比較常見的根際促生菌，尤其是關(guān)于Bacillus屬的促生效果報(bào)道較多［49］，關(guān)于P.alcaligene的促生效果也有報(bào)道［50］，但這些研究往往更加關(guān)注菌株本身的促生效果，而沒有關(guān)注菌株對不同栽培介質(zhì)的適應(yīng)性。本研究表明，Bacillus和Pseudomonas屬細(xì)菌在基質(zhì)栽培的黃瓜根際微生物群落中的相對豐度均較高（圖2），這也暗示這類細(xì)菌如果外源添加到基質(zhì)后可能會(huì)在基質(zhì)栽培的黃瓜根際定殖產(chǎn)生促生效果，具體定殖情況還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

總體來說，菌株D10（B.aquimaris）、C9（P.alcaligenes）、C4（B.endophyticus）對黃瓜幼苗生長均具有顯著的促進(jìn)作用，并且能夠顯著提高壯苗指數(shù)，可以考慮將其作為候選菌株在基質(zhì)栽培黃瓜中使用。