沈圓圓，于福田，趙笑潁，劉小玲

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

炎癥是人體對有害刺激（例如物理創(chuàng)傷、化學(xué)暴露以及細(xì)菌或病毒感染）的一種復(fù)雜且高度調(diào)節(jié)的防御反應(yīng)。炎癥通常會(huì)因組織腫脹或水腫而加劇，滲出液到達(dá)損傷部位，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。炎癥與細(xì)胞因子密切相關(guān)，涉及多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。長期的炎癥與一些健康問題有關(guān)，炎癥幾乎影響所有主要疾病和次要疾病，克服炎癥將是一項(xiàng)關(guān)乎全世界人類健康的巨大挑戰(zhàn)。

腸道炎癥屬于慢性炎癥，例如炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種與腸道慢性炎癥相關(guān)的特發(fā)性疾病。IBD主要有兩種類型：潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn’s disease，CD）。IBD各年齡段都可發(fā)病，但青壯年為高發(fā)人群，男女發(fā)病人數(shù)比例基本沒有差異[1]。自21世紀(jì)初以來，IBD被認(rèn)為是西方國家發(fā)病率加速上升的腸道疾病之一。流行病學(xué)研究表明，目前IBD全球患病率超過0.3%，西方國家IBD的發(fā)病率趨于穩(wěn)定或開始下降，而亞洲、中東、非洲和南美洲等新工業(yè)化國家的發(fā)病率正在迅速上升[2]。IBD病發(fā)原因目前尚不清楚，可能與自身免疫調(diào)節(jié)紊亂、腸黏膜屏障受損、腸道菌群分布改變、遺傳學(xué)、環(huán)境、飲食及精神因素等相關(guān)[3]。IBD無法完全治愈，需要復(fù)雜的終生治療來預(yù)防或延緩病情發(fā)展。人類對這些疾病的發(fā)病機(jī)理知之甚少，患有這些疾病的患者遭受精神壓力和身體疼痛，給他們的家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及造成社會(huì)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。然而，常用于治療IBD的抗炎藥物不僅成本高，還具有很高的副作用，也會(huì)產(chǎn)生耐藥性等問題。目前，迫切需要尋找成本低、更安全和有效的抗炎藥物來克服這種狀況，因此近幾年的研究多集中在新藥研發(fā)上。

生物活性肽通常由2～20個(gè)氨基酸殘基組成，能夠發(fā)揮超出其親本蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的有益生物活性[5]。生物活性肽可通過酶促水解、發(fā)酵或胃腸道消化獲得。相比于蛋白質(zhì)和游離氨基酸，生物活性肽在機(jī)體的吸收方面具更突出的優(yōu)勢，尤其是二肽和三肽，可完整地被腸上皮細(xì)胞吸收。在胃腸道中，食物蛋白需要酶解成游離氨基酸或小肽才能被人體吸利用。氨基酸的吸收過程耗能高，載體易飽和，吸收速度慢。小肽吸收過程雖然也是一個(gè)耗能過程，但其耗能低，載體不易飽和，吸收速度更快。超過10個(gè)氨基酸的生物活性肽通常通過非載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)被腸上皮細(xì)胞吸收，并且涉及與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的疏水相互作用[6]。生物活性肽可通過腸上皮細(xì)胞吸收而釋放到循環(huán)血液中，從而使其到達(dá)靶器官或系統(tǒng)發(fā)揮作用，也可以在胃腸道中產(chǎn)生局部效應(yīng)。另外，被吸收的生物活性肽在進(jìn)入血液循環(huán)之前被運(yùn)輸?shù)礁闻K進(jìn)行代謝[7]。生物活性肽由于具有公認(rèn)的安全性高、成本低和易吸收等多種健康益處，因此是開發(fā)功能性食品和營養(yǎng)保健品的有前途的成分。生物活性肽已被證實(shí)具有抗癌、降血壓、降膽固醇、降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗菌等多種生理功能，其他功能活性也逐漸被開發(fā)，生物活性肽已成為藥物、功能性食品和其他領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，生物活性肽的抗炎活性也受到越來越多國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注，因此利用生物活性肽預(yù)防和補(bǔ)充IBD治療具有重要意義。本文就腸道炎癥治療現(xiàn)狀，對目前國內(nèi)外食源性抗炎活性肽的來源、制備、分離純化、鑒定、抗炎活性評價(jià)及作用機(jī)制進(jìn)行綜述，并探討食源性抗炎活性肽的應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為深入研究及開發(fā)抗炎藥物及腸道健康功能性食品提供參考。

1 腸道炎癥的治療進(jìn)展

腸道炎癥是免疫系統(tǒng)對傷害或疾病的自然反應(yīng)，炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)會(huì)引起組織和腸上皮細(xì)胞損傷、腸黏膜屏障功能受損、腸黏膜通透性增加，為致病菌的移位、過度繁殖和轉(zhuǎn)運(yùn)創(chuàng)造有利條件，最終導(dǎo)致腸道菌群失衡[8]。過度的腸道炎癥會(huì)誘發(fā)腸癌，因此減輕腸道炎癥和恢復(fù)腸道健康至關(guān)重要[8]。IBD是一種慢性復(fù)發(fā)性和緩解性腸道炎癥疾病，其特征為腸道炎癥、組織損傷、腹痛、體質(zhì)量減輕、直腸出血和疲勞等。

目前IBD國內(nèi)外主要的治療藥物及治療方式包括：氨基水楊酸制劑、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、生物制劑、外科手術(shù)、糞便菌群移植、間充質(zhì)干細(xì)胞移植、營養(yǎng)支持等[9-10]。5-氨基水楊酸酯是IBD治療中局部作用的藥物，口服給藥每天大于6 g時(shí)，會(huì)造成全身性不良反應(yīng)，例如肝臟損害發(fā)生率增大[11]。皮質(zhì)類固醇可以有效誘導(dǎo)緩解IBD，但不良副作用使其無法長期使用[12]。免疫因素也是引發(fā)IBD的因素之一，免疫抑制劑可用于難治性IBD且安全性較高，但也存在起效較慢等現(xiàn)象[13]?，F(xiàn)已有幾種針對IBD病理的特定生物學(xué)因子的生物制劑，主要包括抗腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、抗黏附分子、抗白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12等[14]，但也存在部分患者對該療法無反應(yīng)的現(xiàn)象[15-16]。藥物治療效果不佳的患者往往需要進(jìn)行手術(shù)治療，外科手術(shù)后也會(huì)出現(xiàn)感染、膿腫、腸梗阻、吻合口漏或任何需要再次手術(shù)等并發(fā)癥[17]。糞便菌群移植是一種直接改變受體腸道菌群以使組成正常化并獲得治療益處的方法。在臨床實(shí)踐中使用糞便菌群移植也存在一定的局限性，包括尋找合適的供體不易，制備新鮮的糞便樣品艱巨且耗時(shí)，并且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的治療方案[18]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，可緩解炎癥和修復(fù)組織功能[19]；不過間充質(zhì)干細(xì)胞移植療法的細(xì)胞來源、劑量和給藥間隔、分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增方案仍有待確定，造成研究之間存在差異難以合理化[20]。

雖然IBD治療藥物及方法多種多樣，但反復(fù)更換治療方案療效不佳，并且存在患者用藥依從性差、疾病復(fù)發(fā)率高、大多數(shù)患者無力負(fù)擔(dān)終身使用藥物費(fèi)用等問題，使得醫(yī)療行業(yè)乃至社會(huì)面臨巨大的壓力與挑戰(zhàn)[21]。

2 食源性抗炎活性肽的來源

當(dāng)前蛋白質(zhì)是炎癥性腸病防御和治療的研究熱點(diǎn)，這主要是由于蛋白質(zhì)除了提供基本營養(yǎng)外，還具有生理健康益處。蛋白質(zhì)對維持人體的營養(yǎng)健康功能至關(guān)重要，不僅是氨基酸的主要來源，同時(shí)也是生物活性肽的主要來源。生物活性肽因其結(jié)構(gòu)特征，使它們能夠與生物配體相互作用，并賦予其基本營養(yǎng)以外的功能。生物活性肽具有多種活性，例如抗氧化、抑菌性、降血壓等都有了一定的研究，近年來關(guān)于其抗炎活性的研究也越來越多。

生物活性肽來源廣泛，各種各樣的食物蛋白已被用于提取生物活性肽。目前，從動(dòng)物、植物及海洋生物中分離出多種具有抗炎活性的食源性生物活性肽；其中動(dòng)物源抗炎活性肽的來源蛋白有鹿茸蛋白、昆蟲蛋白、乳清蛋白、鱘魚蛋白等[22]；植物源抗炎活性肽的來源蛋白有玉米蛋白、小米谷醇溶蛋白、油菜籽蛋白、榛子蛋白等[23-25]；海洋源抗炎活性肽的來源蛋白有極大螺旋藻、鯡魚、蟹腿肌肉等[26]。Zhao Lei等從鹿茸蛋白的模擬胃腸消化（胃蛋白酶-胰酶水解物）中鑒定出4種抗炎活性肽，分別為VH（Val-His）、LAN（Leu-Ala-Asn）、AL（Ala-Leu）和IA（Ile-Ala）[27]。Zielińska等對食用昆蟲的生物活性肽進(jìn)行了鑒定和化學(xué)合成，發(fā)現(xiàn)合成肽能夠有效抑制脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）和環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）活性，有效緩解炎癥[28]。Aguilar-Toala等從特定植物乳桿菌菌株的發(fā)酵乳中獲得的粗提物和肽組分（分子質(zhì)量＜3 kDa和3～10 kDa）能夠抑制熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性，粗提物和肽組分（分子質(zhì)量＜3 kDa和3～10 kDa）顯示出較高的抗炎活性[29]。海洋生物占全球生物總量的一半左右，海洋生物資源已成為藥物和營養(yǎng)保健應(yīng)用中新型化合物的重要來源[30]。Durand等從鯡魚魚肉水解物中鑒定出兩個(gè)新的陽離子肽序列（IVPAS和FDKPVSPLL），并證明了其體外抗炎活性[31]。Narayanasamy等通過使用胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解蟹腿肌肉，最終分離得到的肽具有抗炎活性[26]。

關(guān)于食源性抗炎活性肽的研究主要集中在從動(dòng)物、植物、海洋生物身上提取活性物質(zhì)，尤其以乳蛋白、大豆蛋白和魚蛋白等物質(zhì)中分離得到抗炎活性肽的研究較多，對微生物源抗炎活性肽的研究相對較少。另外，隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展，隨之而來產(chǎn)生了大量廢棄物或副產(chǎn)物，其中含有豐富的蛋白質(zhì)資源被用作肥料、飼料或丟棄。為了生物資源的開發(fā)利用和可持續(xù)發(fā)展，加工副產(chǎn)物或廢棄物受到廣泛關(guān)注，其在生產(chǎn)抗炎活性肽方面具有巨大潛力。近年來，酒糟、母雞、鯡魚副產(chǎn)物、菜籽、極大螺旋藻和玉米面筋都已用于生產(chǎn)食源性抗炎活性肽，這些應(yīng)用可以提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和資源的綜合利用率。

3 食源性抗炎活性肽的制備方法

生物活性肽常用的制備方法有：酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、基因重組法、生物提取法和化學(xué)水解法。關(guān)于食源性抗炎活性肽制備方法的選擇，需根據(jù)肽的種類、綜合各方面因素，選擇性價(jià)比較高的制備方法。在目前研究和實(shí)際應(yīng)用中，食源性抗炎活性肽主要通過酶解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法制得。

3.1 酶解法

目前，酶解法是制備食源性抗炎活性肽最主要的方法。與微生物發(fā)酵法相比，酶水解的過程通常更快并且更易于控制。與化學(xué)合成法相比，酶解法制得的抗炎活性肽特異性更高，無有機(jī)溶劑或有毒化學(xué)物質(zhì)的殘留，已成為食品和制藥工業(yè)中生產(chǎn)抗炎活性肽的優(yōu)選方法。酶的特異性、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶/底物比和水解度等條件對肽的功能活性都有影響[32]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用于制備食物蛋白水解產(chǎn)物的優(yōu)選商業(yè)酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味酶等。Ge Huifang等用堿性蛋白酶在pH 10.0、56 ℃條件下酶解變性蛋清3 h，所得蛋清肽的抗炎活性在葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中得到驗(yàn)證[33]。由于酶具有專一性、酶切位點(diǎn)有限等特點(diǎn)，單一酶酶解制備生物活性肽的效果有時(shí)不佳，通常需要選擇適當(dāng)?shù)膹?fù)合酶進(jìn)行酶解。Narayanasamy等用堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對蟹腿肌肉進(jìn)行酶解，水解度的結(jié)果表明，這些酶能有效地催化蛋白質(zhì)水解[26]。在一些研究還通過體外模擬胃腸消化的方法從食物蛋白質(zhì)中產(chǎn)生出抗炎活性肽，試圖確定在食用特定食物或食物蛋白質(zhì)后，人體內(nèi)可能產(chǎn)生的肽的活性。Zhang Mengya等對皮蛋蛋白模擬胃腸道消化，所獲得的4種消化肽在TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型中表現(xiàn)出抗炎活性[34]。

3.2 微生物發(fā)酵法

可利用微生物生長過程中分泌的蛋白酶降解食物蛋白而制備抗炎活性肽。酶解程度取決于蛋白質(zhì)來源、菌種、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和pH值等條件[35]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)菌、酵母和內(nèi)生真菌等微生物已被用于食源性抗炎活性肽的制備。Luti等用乳酸桿菌和酵母菌發(fā)酵面粉，在發(fā)酵的酸面團(tuán)中分離得到的低分子質(zhì)量肽在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中表現(xiàn)出抗炎活性[36]。Li Feng等用刺盤孢屬植物內(nèi)生真菌S8發(fā)酵大米，分離純化并鑒定出4種具有體外抗炎活性的環(huán)狀三肽[37]。與酶解法相比，微生物發(fā)酵制備抗炎活性肽的方法更加簡便而且成本低。然而，由于微生物發(fā)酵法產(chǎn)生肽的得率低、特異性不強(qiáng)、質(zhì)量不穩(wěn)定等特點(diǎn)阻礙了微生物發(fā)酵法在抗炎活性肽工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

3.3 化學(xué)合成法

食源性抗炎活性肽都可以通過化學(xué)合成的方法獲得。食源性抗炎活性肽制備和研究的經(jīng)典方法是先尋找合適的食物蛋白質(zhì)來源，然后利用蛋白酶或微生物發(fā)酵對其水解，然后對水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和鑒定以確定目標(biāo)活性肽的序列，對鑒定的肽進(jìn)行化學(xué)合成，并進(jìn)一步評估其抗炎活性。例如，Tenore等利用固相合成法來合成來源于水牛乳的多肽，研究其在IBD治療中的作用[38]。Ren Dayong等發(fā)現(xiàn)榛子蛋白酶水解物具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性，分離純化并鑒定出最佳免疫調(diào)節(jié)肽（LDAPGHR），通過化學(xué)合成法來合成LDAPGHR，對其功能活性近一步研究，發(fā)現(xiàn)其在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中表現(xiàn)出抗炎活性[25]。與酶解法和微生物發(fā)酵法相比，化學(xué)合成法的副產(chǎn)物更多、肽易降解、成本高，所以在實(shí)際應(yīng)用中受到了限制[39]。常用的生物活性肽制備方法整理見表1。

表1 常用的生物活性肽制備方法Table 1 Common preparation methods for bioactive peptides

4 食源性抗炎活性肽的分離純化和鑒定

通過酶解法、微生物發(fā)酵法和生物提取法等制備方法得到的粗提物中含有蛋白質(zhì)、脂類、糖類、氨基酸、核酸和無機(jī)鹽等物質(zhì)，為獲得高活性、高純度、高得率的生物活性肽，還需對粗物進(jìn)行分離純化。如表2所示，目前食源性抗炎活性肽一般通過沉淀法、膜分離技術(shù)、離子交換層析（ion-exchange chromatography，IEC）、疏水層析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）、凝膠過濾層析（gel filtration chromatography，GFC）、反相高效液相色譜法（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）進(jìn)行逐級(jí)分離純化。沉淀法包括有機(jī)溶劑沉淀法、選擇性變性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法和鹽析法等方法。有機(jī)溶劑沉淀法常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇和氯仿等，其中乙醇在工業(yè)中應(yīng)用最廣泛。鹽析法可用于從批量回收到選擇性分離的所有純化階段，通常用硫酸銨、氯化鈉或硫化鈉等無機(jī)鹽進(jìn)行鹽析，其中硫酸銨應(yīng)用最廣泛[43]。膜分離技術(shù)根據(jù)截留分子質(zhì)量的不同分為微濾、超濾（ultrafiltration，UF）、納濾和反滲透，其中UF的截留分子質(zhì)量范圍在1～300 kDa，被廣泛用于抗炎活性肽的分離純化。離子交換色譜是抗炎活性肽最常用技術(shù)之一，通常與GFC聯(lián)用。GFC也稱為分子篩色譜法或尺寸排阻法，該技術(shù)的分離效果主要受包括填料類型、色譜柱體積或流速等因素的影響。目前對食源性抗炎活性肽的分離純化以交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）應(yīng)用最廣，常用型號(hào)為G-15和G-25。在RP-HPLC中，常用的固定相為十八烷基鍵合硅膠，常用的流動(dòng)相為超純水、甲醇和乙腈。據(jù)報(bào)道，通過用超濾膜將極大螺旋藻的酶水解物分離成不同的分子質(zhì)量，其截留分子質(zhì)量為10、5、3 kD；所得級(jí)分通過Superdex peptide 10/300 GL凝膠色譜柱進(jìn)一步純化；之后采用配有C18色譜柱的RP-HPLC儀純化得到兩種抗炎活性肽：LDAVNR和MMLDF[44]。不同的技術(shù)具有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，僅通過使用單一技術(shù)難以獲得理想的肽組分，因此多種分離技術(shù)的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)肽混合物的準(zhǔn)確分類和分離，從而獲得高純度的抗炎活性肽。

表2 食源性抗炎活性肽主要分離純化方法Table 2 Major separation and purification methods for food-derived anti-inflammatory peptides

經(jīng)過一系列分離和純化后，還需對肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。肽鑒定的常用方法包括電泳法、埃德曼降解法、DNA順序分析法、紅外/紫外光譜法、核磁共振和質(zhì)譜法。生物活性肽的功能活性氨基酸組成隨著質(zhì)譜分析技術(shù)在生物領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用，快原子轟擊質(zhì)譜法（fastatom-bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS）、電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization，ESI-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）、超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF-MS/MS）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）等方法已逐漸成為鑒定蛋白質(zhì)及生物活性肽的常用方法[47]。目前食源性抗炎活性肽的分離純化及結(jié)構(gòu)序列分析是將多種分離鑒定方法聯(lián)合使用，充分利用色譜的強(qiáng)分離性能與質(zhì)譜的強(qiáng)定性優(yōu)勢，便可獲得生物活性肽的結(jié)構(gòu)信息，從而鑒定食源性抗炎活性肽的可能結(jié)構(gòu)。Ma Ye等用堿性蛋白酶水解乳清蛋白研究其潛在抗炎活性肽，并用UPLC/Q-TOF-MS/MS對其氨基酸序列進(jìn)行分析鑒定，獲得了8種具有抗炎潛力的肽，其中包括2種新肽：DYKKY和DQWL[48]。Durand等用超濾膜電滲析分離鯡魚水解產(chǎn)物收集到4個(gè)級(jí)分：兩個(gè)陰離子級(jí)分和兩個(gè)陽離子級(jí)分；通過混合離子淌度四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀從兩個(gè)陽離子回收級(jí)分中鑒定出兩種抗炎活性肽（IVPAS和FDKPVSPLL）[31]。

5 食源性抗炎活性肽抗炎活性評價(jià)

抗炎活性評價(jià)方法有兩種：一種是通過建立細(xì)胞炎癥模型進(jìn)行體外活性評價(jià)；另一種是通過建立動(dòng)物炎癥模型進(jìn)行體內(nèi)活性評價(jià)。

5.1 體外抗炎活性評價(jià)

在各類活性物質(zhì)篩選、驗(yàn)證和作用機(jī)制研究中，細(xì)胞炎癥模型因其快速、靈敏、成本低和易操作等優(yōu)勢，已成為體外活性評價(jià)的重要工具。體外抗炎活性評價(jià)方法主要是對相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后建立炎癥模型，再通過細(xì)胞活性、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western blotting來檢測抗炎活性肽對細(xì)胞模型中相關(guān)炎癥因子在基因水平和蛋白水平的表達(dá)以及含量的影響[49]。如表3所示，在生物活性肽的抗炎活性研究中，可通過使用TNF-α、H2O2或LPS刺激誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞、HT-29細(xì)胞和RAW264.7巨噬細(xì)胞等構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型[34]。常見的Caco-2細(xì)胞系源自人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，與小腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能類似，是適合腸道炎癥相關(guān)研究的體外模型，外源性刺激物TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)在很大程度上由趨化因子IL-6和IL-8介導(dǎo)。Zhang Mengya等選擇IL-8作為炎癥標(biāo)志物，測定了皮蛋清模擬胃腸道消化肽在TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞模型中的抗炎作用[34]。在炎癥發(fā)生的過程中，巨噬細(xì)胞具有3個(gè)主要功能：抗原呈遞、吞噬和通過產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和生長因子進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞在炎癥的發(fā)生、維持和消除中起著關(guān)鍵作用，是調(diào)控炎癥反應(yīng)的中心細(xì)胞。Hao Yuqiong等從脫脂大豆中分離得到的Lunasin肽在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型中顯示出很高的抗炎活性，并顯著抑制了炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[50]。Chen Yuhuan等從豆?jié){和酸奶中分離得到分子質(zhì)量小于10 kDa的肽在TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞和HT-29細(xì)胞炎癥模型中有效抑制炎癥細(xì)胞因子IL-8分泌[51]。

表3 食源性抗炎活性肽的體外活性評價(jià)Table 3 Recent studies on in vitro activity evaluation of food-derived anti-inflammatory peptides

5.2 體內(nèi)抗炎活性評價(jià)

與細(xì)胞模型相比，動(dòng)物模型具有重復(fù)性、可靠性和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，可以更加科學(xué)、準(zhǔn)確地探究IBD的病因、病理、治療機(jī)制，并對抗炎藥物的開發(fā)和臨床研究具有重要意義[63-64]。通常，理想的動(dòng)物模型應(yīng)顯示某些關(guān)鍵特征，例如腸道應(yīng)表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)改變、炎癥癥狀和體征，以及與人體IBD相似或相同的病程。動(dòng)物模型多種多樣，如基因工程類動(dòng)物模型、化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型、細(xì)胞移植類IBD模型、細(xì)菌誘導(dǎo)類模型和自發(fā)類動(dòng)物模型，其中化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型簡單易行，所以成為構(gòu)建腸道炎癥的主要方法?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)模型主要包括DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenze sulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型、惡唑酮誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型和乙酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型，在抗炎活性肽研究中主要應(yīng)用以下兩種模型。

5.2.1 葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型

DSS作為一種由蔗糖合成的硫酸多聚體，有抗止血抗凝血作用。DSS主要通過增加腸道黏膜通透性，上調(diào)某些炎癥因子，引起腸道微生物菌群失衡而引發(fā)炎癥。這種模型操作簡便，只需給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲用一定濃度的DSS即可，最重要的是該模型的組織學(xué)特點(diǎn)，例如遠(yuǎn)端結(jié)腸受累更嚴(yán)重、黏液流失、通透性增加、中性粒細(xì)胞浸潤、隱窩膿腫和淺表黏膜糜爛等特點(diǎn)與人體的UC十分相似，并且方法簡單、結(jié)果重現(xiàn)性好，因此被廣泛使用。王曉麗通過構(gòu)建DSS結(jié)腸炎模型，研究發(fā)現(xiàn)生物活性肽Y7和S6可以改善結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量下降和臨床評分情況，表現(xiàn)出明顯的抗炎作用[65]。Lee等[66]采用DSS結(jié)腸炎模型研究蛋清肽的抗炎活性。連續(xù)5 d經(jīng)胃內(nèi)導(dǎo)管給予DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，然后用蛋白肽或生理鹽水治療5 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白肽可減輕DSS引起的臨床癥狀，包括體質(zhì)量減輕、腸黏膜炎癥、隱窩變形和結(jié)腸肌增厚，并通過降低腸道通透性和增加黏蛋白基因表達(dá)來恢復(fù)腸道屏障功能[66]。

5.2.2 2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型

TNBS是一種半抗原物質(zhì)，可溶解腸黏膜表面黏液，破壞腸黏膜屏障，造成黏膜損傷，從而誘發(fā)腸道炎癥。該模型同樣具有易操作、重復(fù)性好和成本低等特點(diǎn)，但也存在一定的局限性，就是缺乏急性期表現(xiàn)，動(dòng)物死亡率較高。因此，控制好藥物的劑量十分關(guān)鍵[67]。Yin Bingjiao等用TNF-α結(jié)合環(huán)肽和腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）1結(jié)合環(huán)肽聯(lián)合治療TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎1周后，發(fā)現(xiàn)此組合有效地改善了TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀并減輕了大鼠的結(jié)腸炎組織病理學(xué)損傷[68]。Abad等通過構(gòu)建TNBS結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)血管活性腸肽可減輕TNBS引起的結(jié)腸炎的臨床和組織病理學(xué)嚴(yán)重程度，改善體質(zhì)量減輕、腹瀉以及腸道炎癥[69]。

食源性抗炎活性肽的體內(nèi)活性評價(jià)整理見表4。近年來IBD的模型越來越復(fù)雜多樣，研究人員可以針對性地使用動(dòng)物模型來解決特定的問題。盡管沒有單一的動(dòng)物模型能夠完全反映人類IBD的所有臨床特征和病理特征，但是每種動(dòng)物模型都有助于我們更好地理解慢性腸道炎癥的發(fā)生過程和持久性機(jī)制。

在IBD的動(dòng)物模型中，若將體質(zhì)量變化和便血程度作為腸道炎癥病情檢測指標(biāo)不足以客觀、真實(shí)地反映疾病嚴(yán)重程度，還需通過疾病部位組織學(xué)、病理學(xué)、基因水平和蛋白水平等方面來對病情程度做出更加確切的判斷，從而為藥物評價(jià)提供依據(jù)。例如還可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增來對比炎癥因子的基因含量，從基因水平評價(jià)腸道的炎癥[47-48]。對炎癥因子進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測，研究目標(biāo)活性肽對其表達(dá)量的影響，從而對目標(biāo)活性肽的抗炎作用機(jī)理進(jìn)行初步探究[83]。

表4 食源性抗炎活性肽的體內(nèi)活性評價(jià)Table 4 Recent studies on in vivo activity evaluation of food-derived anti-inflammatory peptides

6 食源性抗炎活性肽作用機(jī)制

食源性抗炎活性肽主要通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的釋放、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥相關(guān)信號(hào)通路及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，以及調(diào)控腸道免疫及上皮屏障功能等作用機(jī)制來發(fā)揮作用。

6.1 調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的釋放

許多促炎或抗炎細(xì)胞因子在腸道炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-12[83]等。TNF-α、IL-1β和IL-8通過協(xié)同誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的產(chǎn)生來加劇炎癥反應(yīng)。如IL-6與其受體結(jié)合后參與抗凋亡基因的表達(dá)，從而防止T細(xì)胞凋亡，活化T細(xì)胞不受控制的增殖最終加劇了炎癥反應(yīng)。這些促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)在炎癥反應(yīng)中似乎被上調(diào)。然而，IL-10作為抗炎細(xì)胞因子，可以抑制促炎細(xì)胞因子的合成，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[84]。抗炎活性肽通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放，即抑制促炎細(xì)胞因子合成或者上調(diào)抗炎細(xì)胞因子表達(dá)，從而減輕炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥。Gao Ruichang等研究發(fā)現(xiàn)鱘魚蛋白衍生的3種肽在LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型中可有效抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的釋放[22]。Ji Zhongwei等研究發(fā)現(xiàn)小米谷醇溶蛋白肽通過抑制經(jīng)LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，能夠顯著減輕炎癥反應(yīng)[24]。Zhang Mengya等分離并鑒定了源自皮蛋白（SGD-PEW）的6種肽，其中DEDTQAMPFR（DR-10）、DEDTQAMPF（DF-9）、MLGATSL（ML-7）和MSYSAGF（MF-7）顯著抑制IL-8分泌，并顯著降低TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β和IL-12基因的表達(dá)，促進(jìn)IL-10基因的表達(dá)[34]。

6.2 調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)

抗炎活性肽通過抑制iNOS和COX-2的表達(dá)來減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[49]。一氧化氮（NO）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的過量產(chǎn)生與iNOS和COX-2的過度表達(dá)有關(guān)[85]。iNOS和COX-2是炎癥過程中的關(guān)鍵酶，也是NO和PGE2合成的上游酶。例如正常情況下，巨噬細(xì)胞很少表達(dá)iNOS；但當(dāng)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，iNOS將大量表達(dá)并釋放NO，從而導(dǎo)致炎癥性疾病和細(xì)胞損傷。NO參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，以及免疫和炎癥過程中作為介導(dǎo)。免疫激活的巨噬細(xì)胞在炎癥部位分泌NO進(jìn)行組織修復(fù)以消除炎癥，但是過量的NO會(huì)導(dǎo)致各種炎癥性疾病。因此，抑制NO的產(chǎn)生是治療炎癥性疾病的另一種途徑[86]。Ahn等從鮭魚副產(chǎn)物蛋白中分離出的三肽（PAY），PAY處理對NO和PGE2的抑制率分別為63.80%和45.33%[84]。蛋白質(zhì)印跡分析表明，PAY顯著抑制了iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)[84]。Ding Ni等研究皮蛋對RAW264.7巨噬細(xì)胞的抗炎活性，并比較了皮蛋、皮蛋清和皮蛋黃的不同抗炎作用，發(fā)現(xiàn)它們能顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO、TNF-α和IL-6的分泌，且沒有明顯的細(xì)胞毒性，并抑制COX-2和iNOS基因的表達(dá)[87]。Lee等[88]評估了從條斑紫菜中提取的生物活性肽（PPY1）在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中的體外抗炎機(jī)制。PPY1對LPS刺激的巨噬細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子（iNOS、COX-2、IL-1β和TNF-α）具有劑量依賴性抑制作用[89]。

6.3 調(diào)控炎癥相關(guān)信號(hào)通路及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

細(xì)胞因子對炎癥的影響最終還需通過胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑完成。目前研究表明抗炎活性肽抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)主要與MAPK和NF-κB通路有關(guān)。MAPK和NF-κB通路是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)如IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS和COX-2轉(zhuǎn)錄的最重要的兩個(gè)途徑，抗炎活性肽調(diào)節(jié)作用歸因于其通過阻斷NF-κB和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制炎性基因表達(dá)。

MAPK途徑在將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到許多生物過程中起重要作用，包括炎癥、凋亡、細(xì)胞分化和增殖。MAPKs為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，包括p38、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和Jun激酶（Jun kinase，JNK）亞族。研究表明，MAPKs的激活是LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)標(biāo)志。當(dāng)LPS通過與細(xì)胞膜上toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR-4）結(jié)合而刺激時(shí)，MAPKs（p38、ERK和JNK）被磷酸化，隨后其下游信號(hào)通路被激活，這與在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中的NF-κB產(chǎn)生炎癥介質(zhì)有關(guān)。MAPK途徑在炎癥階段中控制iNOS和COX-2表達(dá)中具有不同的作用[89]。

NF-κB在炎性疾病如IBD和結(jié)腸癌中起著至關(guān)重要的作用。NF-κB家族在哺乳動(dòng)物中有5種蛋白，分別是NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB和c-Rel。在NF-κB經(jīng)典通路中，靜息狀態(tài)下NF-κB二聚體與NF-κB抑制蛋白（inhibitor-κ binding protein，IκB）α以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。在受到包括LPS和炎性介質(zhì)的刺激后，IκBα發(fā)生磷酸化和降解，導(dǎo)致NF-κB p65的釋放。NF-κB信號(hào)通過IκBα的磷酸化迅速激活，然后NF-κB p65亞基易位到細(xì)胞核中，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)促炎癥介質(zhì)的表達(dá)。因此，抑制NF-κB的活化被認(rèn)為是調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的重要靶標(biāo)之一[90]。

Wang Xiong等利用TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型，通過體外模擬肽切割來評估卵轉(zhuǎn)鐵蛋白及其二肽的抗炎作用。在基于模擬肽切割的OVT衍生的18種二肽中，CR、FL、HC、LL和MK明顯抑制了IL-8的分泌。此外，這5種二肽均能顯著抑制Caco-2細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β和IL-12的基因表達(dá)，而對抗炎細(xì)胞因子IL-10的基因表達(dá)起促進(jìn)作用。FL、LL和MK通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路來減弱細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而降低促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外，CR和HC抑制了JNK和p38的磷酸化，阻斷MAPK和NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮的抗炎活性[91]。

6.4 調(diào)控腸道免疫及上皮屏障功能

腸道除了日常進(jìn)行消化吸收的功能之外，還具有腸道免疫功能。腸道是人體最大的免疫器官，腸道免疫占全身免疫功能的70%。腸黏膜屏障作為人體的第一道防線，在免疫防御中起重要作用。腸上皮屏障作為腸黏膜屏障的重要防線之一，腸上皮屏障功能在腸道炎癥中受損會(huì)導(dǎo)致腸上皮通透性增加，參與IBD的發(fā)病過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，食源性抗炎活性肽主要通過修復(fù)上皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接而改善腸上皮屏障功能[92]，從而在IBD中發(fā)揮作用。Lee等用不可代謝的糖醇D-甘露醇評估蛋清肽對胃腸道通透性的影響，研究發(fā)現(xiàn)蛋清肽能夠修復(fù)DSS誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷[66]。Ge Huifang等用DSS誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷研究蛋清肽的抗炎活性，為了確定結(jié)腸黏膜糜爛和潰瘍的程度，使用典型的蘇木精-伊紅染色研究結(jié)腸的組織病理學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋清肽治療可增強(qiáng)腸道免疫應(yīng)答，減少炎性細(xì)胞數(shù)量，減輕隱窩損傷，修復(fù)腸上皮細(xì)胞[33]。

7 食源性抗炎活性肽應(yīng)用現(xiàn)狀

盡管生物活性肽的研究正在蓬勃發(fā)展，尤其是具有抗炎活性的生物活性肽，但是將這些新發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為諸如保健食品、功能食品、藥品之類的商業(yè)產(chǎn)品仍然滯后。目前，國內(nèi)外僅有幾種針對皮膚炎癥的抗炎活性肽產(chǎn)品上市。例如，國內(nèi)某護(hù)膚產(chǎn)品祛痘凈顏精華液中添加了植物來源的抗炎活性肽（棕櫚酰三肽-8），針對痤瘡痘肌，通過抑制炎癥因子釋放達(dá)到鎮(zhèn)定褪紅和舒緩的效果；國外某護(hù)膚產(chǎn)品抗炎活性肽乳液中添加了來源于谷胱甘肽的S-乙?；入赘孰囊约癓-五肽，該產(chǎn)品專治慢性炎癥性皮膚病痤瘡，具有減輕組織炎癥和改善表皮屏障功能的功效。上述相關(guān)上市的食源性抗炎活性肽產(chǎn)品主要針對皮膚炎癥發(fā)揮作用，而針對腸道炎癥的食源性抗炎活性肽產(chǎn)品幾乎沒有。另外，絕大部分的上市抗炎活性肽為外用型產(chǎn)品，目前鮮有相關(guān)內(nèi)服型產(chǎn)品上市。造成這一現(xiàn)狀的原因，主要是由于目前食源性抗炎活性肽的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，缺乏完整的臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為食源性生物活性肽潛在的抗炎活性提供實(shí)質(zhì)性證據(jù)。

8 結(jié) 語

隨著IBD發(fā)病率逐年上升，促使人們對基于天然、安全的替代藥物或補(bǔ)充療法進(jìn)行研究，關(guān)于食源性生物活性肽抗炎活性方面的研究不斷深入，從越來越多的食物資源中分離出新型且活性較高的抗炎活性肽，其在抗炎活性藥物、腸道健康功能性食品等方面的應(yīng)用具有很大的發(fā)展?jié)摿Α，F(xiàn)階段國內(nèi)外研究多采用酶解法制備食源性抗炎活性肽；使用UF、IEC、GFC和RP-HPLC等技術(shù)分離純化得到食源性抗炎活性肽；通過液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對抗炎活性肽的氨基酸序列進(jìn)行分析鑒定。但是該策略也存在步驟繁瑣、耗時(shí)和成本高等問題，而且得到高純度的抗炎活性肽較為困難，所以還需創(chuàng)建更加快速便捷的抗炎活性肽篩選方法。目前對食源性抗炎活性肽的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，難以批量生產(chǎn)，生產(chǎn)的活性肽分離設(shè)備需要進(jìn)一步改進(jìn)，使得食源性抗炎活性肽能夠大批量生產(chǎn)。

目前，雖然已從食物蛋白質(zhì)中鑒定出大量的抗炎活性肽，但對食源性抗炎活性肽構(gòu)效關(guān)系的研究比較有限，因此很難確定其生物活性的特定結(jié)構(gòu)特征，還需要進(jìn)一步研究其分子機(jī)制。關(guān)于食源性抗炎活性肽胃腸道消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還需詳盡地闡明，因?yàn)橛醒芯勘砻魇吃葱钥寡谆钚噪牟灰欢ㄐ枰獜奈改c道吸收才能發(fā)揮生物活性[35]。胃腸道本身是一個(gè)很大的器官，食源性抗炎活性肽的局部作用是一個(gè)日益受到關(guān)注的領(lǐng)域。食源性抗炎活性肽通過體內(nèi)和體外活性評價(jià)，證明其對IBD患者改變腸道內(nèi)環(huán)境具有一定的作用，它們通過幾種機(jī)制發(fā)揮抗炎活性、增強(qiáng)或修復(fù)胃腸道穩(wěn)態(tài)等健康作用。但是，涉及人類受試者的臨床研究較少。因?yàn)槭吃葱钥寡谆钚噪脑谌梭w內(nèi)的作用效果、最佳給藥方式、給藥劑量、穩(wěn)定性、安全性等問題尚不明確，所以食源性抗炎活性肽的相關(guān)產(chǎn)品暫未上市，未來應(yīng)將食源性抗炎活性肽由實(shí)驗(yàn)室水平研究向商業(yè)化產(chǎn)品轉(zhuǎn)變。另外，相信隨著研究的不斷深入，食源性抗炎活性肽對腸道炎癥的作用機(jī)制也會(huì)越來越明確。