張 婷，陳美如，于一丁，張 燕，劉靜波

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林省營養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

在各類食品的加工過程中，蛋白由于具有良好的起泡性、乳化性、凝膠性等功能特性，在食物的質(zhì)地和結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。起泡性作為其中的重要特性之一，通過形成綿密細(xì)微的泡沫來賦予食品優(yōu)良的質(zhì)構(gòu)特性和均勻細(xì)膩的口感，在許多烘焙制品、冰淇淋、啤酒、充氣糖果等制作中均起到了重要作用。隨著人們對(duì)泡沫型食品需求的增加，如何提高蛋白起泡性逐漸成為了研究重點(diǎn)。生物酶解作為食物蛋白深加工方法之一，不僅能產(chǎn)生具有生物活性的小分子肽，而且在一定程度上改善了蛋白的起泡特性，進(jìn)一步提高了蛋白的附加值。因此，本文就近年來蛋白起泡特性的相關(guān)機(jī)理以及生物酶解影響蛋白起泡特性的因素進(jìn)行綜述，希望為今后食物蛋白的綜合利用與深度開發(fā)提供新的思路。

1 蛋白的起泡機(jī)理及影響因素

1.1 蛋白泡沫的形成機(jī)理

泡沫是一種常見的氣-液多相分散體系，大量的氣體進(jìn)入到連續(xù)相（通常是含有蛋白質(zhì)的水溶液）中形成大小不同的氣泡，這些氣泡被液相薄膜所分隔，由于薄膜間的流體排水現(xiàn)象導(dǎo)致氣泡逐漸靠近，從最初的球形呈現(xiàn)為多面體狀[1]。因此，在沒有蛋白質(zhì)等表面活性劑穩(wěn)定界面的情況下，泡沫將極其不穩(wěn)定。蛋白分子具有兩親性，在分散過程中，蛋白的親水基團(tuán)進(jìn)入液相，疏水基團(tuán)進(jìn)入氣相；在攪拌過程中，由于疏水基團(tuán)吸附在氣-液界面上，降低了表面張力，同時(shí)因?yàn)榻缑嫣幍鞍椎姆枪矁r(jià)相互作用的存在形成黏彈性薄膜，有助于泡沫的形成和穩(wěn)定[2]，形成泡沫的相關(guān)機(jī)理示意圖如圖1所示。

圖1 蛋白泡沫形成的機(jī)理示意圖[3]Fig. 1 Schematic diagram of protein foaming mechanism[3]

1.2 蛋白泡沫的界面吸附動(dòng)力學(xué)

蛋白質(zhì)的起泡性在很大程度上取決于蛋白分子在氣液界面的吸附動(dòng)力學(xué)。一般來講，可以把蛋白的吸附動(dòng)力學(xué)分為4個(gè)階段[4]：滯后期、擴(kuò)散、吸附、重排。第一階段為滯后期，也叫滯后時(shí)間，即表面張力降至其初始值的95%時(shí)所需的時(shí)間，用來表征擴(kuò)散的早期階段，通常與蛋白分子的柔韌性和疏水性相關(guān)。Wouters等[5]在研究小麥面筋水解物部分替代蛋清蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于二者的混合溶液并沒有記錄到滯后時(shí)間，表明蛋白幾乎是瞬間吸附到界面上。類似的，Talansier等[4]研究干熱處理蛋清對(duì)蛋清蛋白泡沫和界面特性的影響時(shí)也獲得了一個(gè)極低值，同樣說明蛋清蛋白對(duì)界面的吸附與氣泡的形成是瞬時(shí)的。第二階段是擴(kuò)散階段，即蛋白分子由液相擴(kuò)散到氣相的過程，主要受到界面和連續(xù)相之間的蛋白濃度梯度的影響，較高的蛋白濃度對(duì)此階段的進(jìn)行有一定的促進(jìn)作用。第三階段是吸附（滲透），即親水基團(tuán)進(jìn)入水相，而疏水基團(tuán)暴露于空氣相，蛋白分子到達(dá)界面后進(jìn)行的一系列吸附、展開、界面折疊等過程。例如Talansier等[4]發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白的吸附率隨著熱處理強(qiáng)度的增加而逐漸降低。第四階段是重排，是指蛋白分子在界面的聚集、重新排列形成界面膜，平衡表面張力的過程。值得注意的是，對(duì)于蛋白混合物，各組分蛋白在氣-液界面的吸附程度主要取決于它們到達(dá)界面的順序，且后到達(dá)的蛋白很難使已經(jīng)吸附在界面的蛋白（尤其球狀蛋白）解吸[6]，因此考慮界面吸附動(dòng)力學(xué)對(duì)于研究泡沫的穩(wěn)定性和界面膜的組成具有一定必要性。

1.3 蛋白泡沫的失穩(wěn)機(jī)制

泡沫的不穩(wěn)定性主要?dú)w因于歧化和聚結(jié)兩種失穩(wěn)機(jī)制。歧化的發(fā)生是因?yàn)椴煌笮馀荽嬖诘膲毫Σ顚?dǎo)致的。當(dāng)兩個(gè)氣泡半徑相等時(shí)，接觸界面為一個(gè)平面，說明界面兩邊壓力平衡。而當(dāng)兩個(gè)氣泡半徑不等時(shí)，界面呈現(xiàn)曲面狀，小氣泡內(nèi)外的壓力差大于大氣泡內(nèi)外的壓力差（小氣泡的氣體溶解度高于大氣泡），這就導(dǎo)致氣體從小氣泡擴(kuò)散至大氣泡中[7]。小的氣泡收縮并促使大氣泡增長(zhǎng)，最終導(dǎo)致泡沫的不穩(wěn)定破裂。Yang Xin等[8]研究蛋清蛋白泡沫穩(wěn)定性和界面特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于歧化作用，總體氣泡尺寸（平均氣泡面積）會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加。為了減緩歧化作用，可以通過降低表面張力或在氣泡周圍形成黏彈性膜[5]的方式阻礙氣體擴(kuò)散。

聚結(jié)是指相鄰氣泡的合并。當(dāng)多個(gè)氣泡聚集時(shí)，接觸點(diǎn)處的曲率較大，驅(qū)動(dòng)著正常界面的液體向接觸區(qū)域流動(dòng)，導(dǎo)致液膜中的液體流失[9]，液膜變得越來越薄直至達(dá)到臨界厚度，不再能承受住氣泡內(nèi)的壓力最終導(dǎo)致破裂。這一過程主要取決于氣泡周圍吸附的蛋白質(zhì)層和黏彈性膜[10]，也取決于氣泡表面蛋白質(zhì)引起的靜電作用力。Wouters等[5]發(fā)現(xiàn)通過增強(qiáng)蛋白吸附層間的靜電和疏水相互作用阻礙了氣泡的接近，增加了對(duì)起泡聚結(jié)的抵抗力。

泡沫最終形成的大小是氣泡增長(zhǎng)與失穩(wěn)現(xiàn)象之間相互平衡的結(jié)果[8]，而這兩種失穩(wěn)機(jī)制又與吸附在界面上的蛋白質(zhì)層有著直接關(guān)系。

1.4 蛋白起泡性的改性方法

在應(yīng)用和研究過程中，通常以起泡性和泡沫穩(wěn)定性作為蛋白泡沫的評(píng)價(jià)指標(biāo)[11]。起泡性通常用于衡量蛋白泡沫生成的難易程度，可通過測(cè)量泡沫體積的增加量來確定。而泡沫穩(wěn)定性是指維持泡沫的持久性，可通過測(cè)量一段時(shí)間內(nèi)液體的排放量或泡沫體積的減少量來確定。這兩個(gè)指標(biāo)在食品的加工過程中對(duì)于食品的外觀、質(zhì)構(gòu)等特征起到重要作用。影響蛋白溶液起泡性和穩(wěn)定性的因素有很多，例如蛋白來源[12]、蛋白濃度[13]、蛋白溶液的溫度[14]、pH值[15]、加入的各類物質(zhì)（糖[16]、無機(jī)鹽[17]、金屬離子[18]、生物酶[19]）及比例、攪打起泡的速度和時(shí)間[20]等。在實(shí)際生產(chǎn)中，為了能夠提高蛋白的起泡性，常常會(huì)對(duì)蛋白進(jìn)行改性處理。常用的改性方式主要包括物理改性、化學(xué)改性和生物酶解。

1.4.1 物理改性

物理改性主要是通過熱處理、超聲波、微波、高壓脈沖電場(chǎng)、輻照處理等物理效應(yīng)改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間的聚集方式，從而改變蛋白的起泡特性。一般情況下，物理改性不會(huì)改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)[21]。以超聲為例，超聲空化作用會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)部分解折疊[22]，使位于分子內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露，提高蛋白的疏水性，從而達(dá)到改變起泡性的目的。這類改性方式具有作用時(shí)間短、無毒副產(chǎn)物、對(duì)食品的營養(yǎng)安全性小[23]等特點(diǎn)。

1.4.2 化學(xué)改性

化學(xué)改性是通過化學(xué)反應(yīng)在蛋白分子上引入不同的功能基團(tuán)（親水親油基團(tuán)、二硫基團(tuán)、帶負(fù)電基團(tuán)等），利用側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)活性，選擇性地轉(zhuǎn)化為衍生物來改變蛋白結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白的起泡特性。常見的包括磷酸化、糖基化、酰基化、硫醇化[24]以及共價(jià)交聯(lián)作用[25]等方式。以糖基化為例，與蛋白分子共價(jià)交聯(lián)時(shí)提供了額外的親水基團(tuán)而提高了溶解度[26]和起泡性；又因增加了體系的黏度[27]、降低了泡沫排水的速度而增加了泡沫的穩(wěn)定性?；瘜W(xué)改性方式較為靈活且對(duì)設(shè)備的要求較低、成本低，但同時(shí)需要考慮引入的化學(xué)試劑及反應(yīng)殘留物的毒性等問題，需更多地考慮其在食品工業(yè)上的可應(yīng)用性。

1.4.3 生物酶解

生物酶解是通過在蛋白溶液中添加生物酶，利用酶切位點(diǎn)將蛋白質(zhì)水解成多肽、寡肽、氨基酸等物質(zhì)。分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，影響蛋白與蛋白分子間以及蛋白與水分子之間的相互作用[24]，降低表面張力并加強(qiáng)與氣-液界面的交聯(lián)進(jìn)而影響起泡性。相較于物理改性對(duì)設(shè)備成本、操作技術(shù)要求較高，化學(xué)改性具有潛在安全隱患等局限性，生物酶解的反應(yīng)條件更加溫和，能源消耗更低、專一性強(qiáng)且毒副產(chǎn)物產(chǎn)生率極低[28]，一般情況下，酶解后的產(chǎn)物具有與母體蛋白相同的氨基酸組成[19]，并且與母體蛋白相比，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量顯著降低，部分典型的理化特性如溶解性、柔韌性、疏水性等得到明顯改善，促進(jìn)了起泡性的提升。此外，生物酶解法對(duì)于酶解過程、酶解產(chǎn)物都具有高度可控性，通過酶解前的預(yù)處理使分子結(jié)構(gòu)松散可以提高酶解效率；通過控制酶解時(shí)的溫度、pH值、酶添加量、底物濃度和酶解時(shí)間[29]等因素去調(diào)控水解程度來影響酶解產(chǎn)物及相關(guān)特性。通常在輕度酶解或適度酶解條件下便可對(duì)蛋白的起泡性有較顯著的改善作用。酶解產(chǎn)物易被人體消化吸收，能產(chǎn)生具有特定生物活性的小分子肽。有研究表明，這些活性肽具有良好的降血壓[30]、抗氧化[31]、抗凝血[32]、免疫調(diào)節(jié)[33]和防治糖尿病[34]等生理功能；從研究層面來講，對(duì)蛋白酶解產(chǎn)物的研究，多圍繞在各類生物活性肽的制備和作用機(jī)理方面[35]，在制備高特性蛋清蛋白粉[36]、降低致敏性[28]、脫苦[19]、脫鹽[37]等方面也開展了部分研究。但是，對(duì)于生物酶解改善蛋白起泡性方面的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，下文將重點(diǎn)介紹生物酶解影響起泡特性的因素及機(jī)理，其主要作用機(jī)制如圖2所示。

圖2 生物酶解影響蛋白起泡性的5種因素及其主要作用機(jī)制示意圖[5,28,38-40]Fig. 2 Schematic diagram of the major action mechanisms of five factors affecting protein foaming characteristics[5,28,38-40]

2 生物酶解影響蛋白起泡性的因素

2.1 預(yù)處理方式對(duì)起泡性的影響

緊密結(jié)合的蛋白比具有高度柔性的蛋白更耐酶的催化[41]。預(yù)處理的主要目的是讓處于折疊狀態(tài)的蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，加快酶促反應(yīng)進(jìn)程[38]。因此，酶解前底物蛋白預(yù)處理對(duì)起泡性改善效果起著重要作用。常用的預(yù)處理方式主要包括熱處理和超聲處理。

2.1.1 熱處理

適當(dāng)?shù)母邷靥幚頃?huì)改變蛋白的結(jié)構(gòu)并對(duì)其功能特性產(chǎn)生積極的影響[42]。高溫處理可破壞天然蛋白的氫鍵、疏水相互作用等次級(jí)鍵，使蛋白分子從有序的致密結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序的松散伸展?fàn)罱Y(jié)構(gòu)，暴露出大量的酶切位點(diǎn)，增加了酶與底物的接觸程度。王永梅等[43]研究了木瓜蛋白酶對(duì)蛋清蛋白起泡性的改善作用，發(fā)現(xiàn)在熱處理溫度90 ℃、熱處理時(shí)間15 min時(shí)，與對(duì)照組相比，蛋清蛋白起泡能力提高了112.97%，泡沫穩(wěn)定性提高了93.27%。Liang Guijiang等[44]在研究預(yù)熱處理和酶解相結(jié)合改性的大豆蛋白水解產(chǎn)物的起泡性能時(shí)發(fā)現(xiàn)，在55 ℃下對(duì)大豆蛋白進(jìn)行30 min的預(yù)熱處理可以促進(jìn)親水性酸性亞基的水解并增加了伴大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的比例，提高了其分子柔性和在空氣-水界面的快速吸附能力，使得此預(yù)處理?xiàng)l件下的酶解產(chǎn)物具有最佳的界面特性和泡沫容量以及穩(wěn)定性。利用蛋白酶酶解熱處理后的蛋白質(zhì)，可將體系中存在的不溶性蛋白聚集體降解為可溶性蛋白，從而提高其起泡性。另一方面，加熱導(dǎo)致體系黏度增大，降低了泡沫排水的速度[29]，從而改善了泡沫穩(wěn)定性。因此，熱處理目前也被廣泛應(yīng)用于改善動(dòng)植物蛋白[45]起泡特性的研究中。

2.1.2 超聲處理

與熱處理相比，超聲被認(rèn)為是一種更加溫和的蛋白處理方式。熱處理會(huì)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)造成不可逆的影響，而超聲可通過空化作用[46]使蛋白結(jié)構(gòu)松散，可作為改善蛋白起泡特性[47]等功能特性的輔助手段。Stefanovic等[39]研究超聲預(yù)處理對(duì)蛋清蛋白酶解產(chǎn)物起泡性影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，與未超聲樣品相比，在20 min的超聲處理時(shí)間內(nèi)，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶產(chǎn)物的起泡性均隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是由于超聲導(dǎo)致蛋白和空氣均勻混合，使蛋白結(jié)構(gòu)松散，暴露出更多的酶切位點(diǎn)和疏水基團(tuán)，增加了蛋白對(duì)酶解的敏感性。酶可以結(jié)合更多的蛋白酶切位點(diǎn)，酶解效率提高，在相同處理?xiàng)l件下獲得產(chǎn)物的水解程度和形成泡沫的能力增強(qiáng)[40]。然而超聲處理超過20 min會(huì)顯著降低蛋白對(duì)酶解的敏感性，表明過長(zhǎng)的處理時(shí)間會(huì)使分散的蛋白又重新聚集，暴露的酶切位點(diǎn)和疏水基團(tuán)將被再次掩埋。因此，在超聲預(yù)處理過程中應(yīng)嚴(yán)格把控超聲時(shí)間，避免因聚集現(xiàn)象導(dǎo)致的水解產(chǎn)物起泡性下降。Jain等[48]研究超聲預(yù)處理對(duì)蛋殼膜（egg shell membrane，ESM）蛋白的酶促水解及功能特性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，與只進(jìn)行酶解的蛋白樣品相比，經(jīng)歷了超聲預(yù)處理的酶解產(chǎn)物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均提高了10%左右。這可能是因?yàn)樵诔曔^程中產(chǎn)生的剪切力和熱效應(yīng)導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，共價(jià)鍵斷裂，暴露疏水基團(tuán)，使蛋白的柔性和溶解度增加，酶切位點(diǎn)更容易被酶結(jié)合。因此，適當(dāng)?shù)某曨A(yù)處理對(duì)于酶解提高蛋白水解物的起泡特性具有一定的促進(jìn)作用。

2.2 酶類型對(duì)起泡性的影響

不同的蛋白酶，其來源、底物特異性、活性位點(diǎn)和催化機(jī)理等特性各異，因此選擇合適的酶水解蛋白將能生產(chǎn)出具有高質(zhì)量功能特性的水解產(chǎn)物并有效地控制生產(chǎn)成本。目前市面上常見的蛋白酶主要包括微生物來源的蛋白酶（堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等）、植物來源的蛋白酶（木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等）和動(dòng)物來源的蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶等）。劉麗莉等[49]研究了不同蛋白酶對(duì)卵白蛋白（ovalbumin，OVA）水解度和起泡性的影響，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的水解能力和水解產(chǎn)物起泡性顯著優(yōu)于其他蛋白酶（P＜0.05），原因可能是堿性蛋白酶的活力較高，在堿性條件下更易誘導(dǎo)蛋白自身的水解。此外，堿性蛋白酶作為一種典型的內(nèi)肽酶，具有廣泛的水解特異性，能夠使隱藏在蛋白分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露出來，增強(qiáng)了水解產(chǎn)物的疏水性，對(duì)于后續(xù)的起泡性結(jié)果起到了積極的促進(jìn)作用。Stefanovic[39]和Jovanovic[50]等研究了蛋白酶類型對(duì)蛋清蛋白起泡性影響，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物在酶解全程中表現(xiàn)出更好的起泡特性（P＜0.05），這一結(jié)果可能是酶切割位點(diǎn)的特異性導(dǎo)致的。堿性蛋白酶優(yōu)先水解包含芳香族氨基酸殘基的肽鍵，特別是精氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸等[51]，而木瓜蛋白酶偏向于半胱氨酸和組氨酸殘基。因此，由于蛋白酶底物特異性的不同，導(dǎo)致了水解產(chǎn)物的表面疏水性和電荷性質(zhì)等理化性質(zhì)差異，最終使得酶解產(chǎn)物之間的泡沫性質(zhì)發(fā)生變化。

Hammershoj等[9]利用不同蛋白酶酶解卵黏蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，風(fēng)味蛋白酶的水解產(chǎn)物具有較好的起泡特性。風(fēng)味蛋白酶是通過米曲霉的受控發(fā)酵獲得的一種同時(shí)具有外肽酶和內(nèi)肽酶酶解特性的混合物。在最初的酶解過程中，風(fēng)味蛋白酶主要發(fā)揮內(nèi)肽酶活性，緩慢增加水解體系中末端活性位點(diǎn)的數(shù)量；在酶解12 h后，水解體系中末端活性位點(diǎn)的數(shù)量積聚又激發(fā)了其外肽酶的酶解效應(yīng)；獲得的風(fēng)味蛋白酶水解產(chǎn)物具有更高的表面疏水性，即疏水殘基的暴露降低了產(chǎn)物肽中凈電荷增加所產(chǎn)生的干擾，同時(shí)表現(xiàn)出良好的起泡能力。Garcés-Rimón等[52]發(fā)現(xiàn)食品級(jí)氨肽酶處理液態(tài)蛋清可賦予液態(tài)蛋清良好的起泡性和泡沫再塑性，其原因可能在于產(chǎn)物的極性、離子化基團(tuán)和疏水基團(tuán)等發(fā)生變化。因此，不同的酶類型主要是憑借其各自的切割位點(diǎn)及酶切末端特異性，影響產(chǎn)物的水解度及表面疏水性、電荷屬性等理化性質(zhì)，進(jìn)而改善水解產(chǎn)物的起泡特性及泡沫質(zhì)地。

2.3 水解程度對(duì)起泡性的影響

蛋白酶水解過程中，隨著水解程度的增加，水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量和氨基酸殘基的暴露情況會(huì)發(fā)生顯著的變化。其中，水解產(chǎn)物的疏水性對(duì)其起泡性和泡沫穩(wěn)定性有著重要的影響，在蛋白界面吸附動(dòng)力學(xué)中的“滯后期”和“吸附期”階段起著重要作用。適度的酶解可以使原本被掩埋的疏水基團(tuán)暴露出來，增強(qiáng)蛋白對(duì)氣-液界面處的吸附，降低表面張力，從而改善起泡性；同時(shí)，由于界面處蛋白吸附量增多，分子間作用力增加，有助于穩(wěn)定界面黏彈性薄膜，阻礙泡沫排水現(xiàn)象來改善泡沫穩(wěn)定性。Liu Lili等[28]通過堿性蛋白酶在適宜條件下酶解卵白蛋白，發(fā)現(xiàn)水解OVA的起泡性比天然OVA的起泡性有所提高，可能是由于酶解導(dǎo)致蛋白質(zhì)的部分展開，增加了疏水區(qū)域的暴露程度，產(chǎn)物疏水性增強(qiáng)。通過紫外吸收光譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)吸收峰產(chǎn)生了紅移，且吸收強(qiáng)度增高，表明色氨酸殘基（疏水性氨基酸）逐漸暴露于蛋白分子的表面，進(jìn)一步證明了疏水性的影響。

然而，起泡性并不隨著水解程度的持續(xù)增加而增加。Mohanty等[53]在研究水解程度對(duì)魚蛋白酶解產(chǎn)物起泡特性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，起泡性隨著水解程度的增加而呈線性下降趨勢(shì)，說明水解產(chǎn)物中較大尺寸的肽可能會(huì)形成更濃密的泡沫。輕度水解時(shí)，較長(zhǎng)的多肽鏈可以快速在界面吸附并降低表面張力。但當(dāng)水解過度時(shí)，較短的肽鏈或氨基酸不利于形成氣-液界面穩(wěn)定的薄膜，對(duì)泡沫特性存在負(fù)面影響。Hammershoj等[9]利用堿性蛋白酶和鏈酶E酶解卵黏蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物的起泡性在最初的1～2 h內(nèi)逐漸增加。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，起泡性呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。酶解24 h后，樣品的起泡性已低于未酶解蛋白的起泡性。對(duì)于水解度在15%～40%之間的樣品，起泡性能較佳。根據(jù)排水速率的測(cè)定，樣品的泡沫穩(wěn)定性與水解中段和末段的起泡性呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)。表面疏水性實(shí)驗(yàn)證明，較高水解程度下的疏水性較低，是因?yàn)檫^度水解導(dǎo)致疏水區(qū)域肽裂解，肽的凈電荷增加，吸附的靜電屏障可能會(huì)增加，減少肽在氣-液界面的吸附量，從而降低了起泡性。此外，增加的靜電排斥作用可能會(huì)阻礙氣-液界面上吸附的肽之間的分子間作用力，導(dǎo)致界面黏彈性降低，泡沫穩(wěn)定性隨之降低[53]。類似的，Wouters等[5]在用胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解小麥面筋蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，水解度為2%的水解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性要比水解度為6%的水解產(chǎn)物高（P＜0.05），這是由于水解程度較低的樣品中特定疏水性肽的含量更高。劉麗莉等[49]利用堿性蛋白酶對(duì)卵白蛋白進(jìn)行了5 h的充分酶解后，所測(cè)得的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均降低了20%左右，且水解時(shí)間越長(zhǎng)，水解度越高，表面巰基含量越少，疏水性降低趨勢(shì)越顯著。其原因可能在于過度酶解破壞了疏水區(qū)域肽，同時(shí)在酶解產(chǎn)物制備的離心過程中存在一定疏水性多肽的損失。因此，調(diào)控酶解產(chǎn)物的水解程度可直接影響水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量和疏水性，改善界面吸附效應(yīng)，進(jìn)而影響蛋白的起泡特性。

2.4 pH值對(duì)起泡性的影響

pH值也是影響蛋白水解產(chǎn)物起泡性能的重要因素之一，主要是通過影響分子的帶電性而在吸附動(dòng)力學(xué)的“吸附期”發(fā)揮作用，一定程度上影響了蛋白水解產(chǎn)物在界面的吸附和聚集行為。Cho等[54]在測(cè)定蛋清蛋白的中性蛋白酶水解產(chǎn)物的起泡性時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸性條件下產(chǎn)物的起泡性遠(yuǎn)大于中性和堿性條件。起泡性在pH值為3.6時(shí)達(dá)到最大值，且與相同pH值條件下的非水解蛋白相比，泡沫容量和泡沫穩(wěn)定性顯著提高，而pH值在7.6和9.0時(shí)，發(fā)泡能力趨于下降。原因可能在于pH值為3.6時(shí)更接近蛋清蛋白的等電點(diǎn)，蛋白水解產(chǎn)物表面電荷被中和，降低了分子間的靜電斥力和氣-液界面吸附能壘，蛋白水解產(chǎn)物的界面吸附速率和吸附數(shù)量增加，從而改善了蛋白水解產(chǎn)物的起泡性。與此同時(shí)，較低的靜電斥力導(dǎo)致界面處分子間吸引力增加，提高了界面膜強(qiáng)度，改善了流變性能，減緩了液體排水，從而增加了泡沫穩(wěn)定性。pH值的變化導(dǎo)致的酶解體系中分子帶電性的差異，會(huì)進(jìn)一步影響蛋白水解產(chǎn)物的溶解度，從而影響其起泡性能。研究表明，隨著pH值的升高，蛋白水解產(chǎn)物溶解度呈增加趨勢(shì)，起泡性也相應(yīng)提升。這可能是由于蛋白水解產(chǎn)物在蛋白等電點(diǎn)處的靜電斥力最小，分子最易于聚集，從而導(dǎo)致接近等電處的產(chǎn)物溶解度較低且不能快速地移動(dòng)到氣-液界面，影響產(chǎn)物的起泡性。Chen Chen等[55]研究了不同pH值條件下蛋白水解產(chǎn)物的起泡性差異，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值在3.0～5.0之間增加時(shí)，整個(gè)體系越來越接近蛋白等電點(diǎn)，蛋白水解產(chǎn)物溶解度逐漸降低，而起泡性逐漸增加。隨著pH值的繼續(xù)增加，蛋白水解產(chǎn)物溶解度逐漸升高，在pH 7.0時(shí)獲得最大值，而起泡性顯著降低。體系在pH 8.0時(shí)出現(xiàn)了溶解度降低和起泡性升高的現(xiàn)象，說明溶解度并不是影響蛋白水解產(chǎn)物起泡性的唯一因素。Stefanovic等[56]認(rèn)為，蛋白暴露于堿性條件下可能會(huì)促進(jìn)其部分結(jié)構(gòu)展開，增加了疏水基團(tuán)與氣-液界面的可及性，從而提高蛋白水解產(chǎn)物的起泡性。

2.5 分子質(zhì)量對(duì)起泡性的影響

分子質(zhì)量對(duì)起泡性的影響主要作用在吸附動(dòng)力學(xué)的“擴(kuò)散期”，分子質(zhì)量的大小影響著分子的界面擴(kuò)散速率。有文獻(xiàn)表明，能快速形成泡沫的蛋白，其結(jié)構(gòu)特征之一就是具有低分子質(zhì)量[1]。蛋白經(jīng)過酶解被切割成多肽或氨基酸，蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞的同時(shí)分子質(zhì)量降低，向界面擴(kuò)散和吸附的速率提高，有利于改善其起泡性。由于大部分蛋白的優(yōu)良加工特性只有在處于可溶解狀態(tài)時(shí)才能展現(xiàn)出來，而分子質(zhì)量的降低使得蛋白的親水性提高，可提高其溶解度和柔韌性，有望改善蛋白的加工特性。Chen Chen等[55]利用胰蛋白酶酶解蛋清蛋白后，起泡性和泡沫穩(wěn)定性均顯著提高，說明酶解降低了蛋白的分子質(zhì)量，提高了溶解性和柔韌性，促進(jìn)了泡沫和界面膜的形成。Cho等[54]的研究表明，與天然蛋白分子相比，酶解后的蛋白溶液起泡性有明顯改善，其原因在于蛋白水解產(chǎn)物分子質(zhì)量的降低使其能形成更穩(wěn)定的界面層，增加分子界面擴(kuò)散速率。然而，分子質(zhì)量過低會(huì)對(duì)泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響，因?yàn)檫^多的低分子質(zhì)量肽很難維持液膜強(qiáng)度，不利于泡沫的穩(wěn)定。Stefanovic等[56]利用中性蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)蛋清蛋白進(jìn)行雙酶水解，發(fā)現(xiàn)蛋白水解產(chǎn)物分子質(zhì)量降低，提高了溶解度和柔韌性，從而促進(jìn)了界面膜的形成，提高了蛋白水解產(chǎn)物的起泡性。Liu Lili等[28]通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)測(cè)定了卵白蛋白酶解后的分子質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)水解后的蛋白分子質(zhì)量主要在20.1～14.3 kDa之間，明顯低于天然卵白蛋白的分子質(zhì)量（大于44.3 kDa），而蛋白水解產(chǎn)物具有更好的起泡性。其原因可能在于，蛋白酶酶解處理可以通過切割肽鍵來影響蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)構(gòu)象，從而產(chǎn)生更親水、更易溶的較低分子質(zhì)量的蛋白水解產(chǎn)物，提高了它們向氣-液界面處的遷移速率，進(jìn)而影響其起泡性。

將蛋白生物酶解過程的影響因素及機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，具體如表1所示。

表1 生物酶解改善蛋白起泡性的作用機(jī)理分析Table 1 Analysis of the mechanism by which enzymatic hydrolysis improves protein foaming capacity

3 結(jié) 語

在蛋白的酶解過程中，預(yù)處理方式、酶的類型、水解程度、pH值以及分子質(zhì)量等因素通過不同的作用機(jī)制來影響蛋白的起泡特性。但目前的研究主要圍繞在生物酶解對(duì)起泡性能的影響及工藝優(yōu)化等方面，對(duì)其影響機(jī)制的研究仍然亟待開展，應(yīng)用領(lǐng)域仍待開拓。目前尚有諸多問題亟待解決：1）生物酶解后蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的變化與蛋白起泡特性的相關(guān)性仍不夠明確，對(duì)于蛋白水解產(chǎn)物起泡性構(gòu)效關(guān)系方面的研究較為欠缺；2）相較于實(shí)際的食品加工體系，目前對(duì)于生物酶解的實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用環(huán)境過于簡(jiǎn)單，所考察的泡沫性質(zhì)較為單一，在今后的研究中應(yīng)考慮利用復(fù)雜食品介質(zhì)（濕度、溫度、鹽、糖、脂肪等混合作用）來評(píng)估酶解產(chǎn)物的起泡特性；3）雖然生物酶解可有效改善蛋白水解產(chǎn)物的起泡特性，但隨之而來的產(chǎn)品風(fēng)味和口感變化不容忽略。蛋白酶解過程中容易產(chǎn)生苦味肽和游離氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)，后續(xù)應(yīng)研究產(chǎn)品風(fēng)味與起泡性之間的關(guān)系。