王貝貝，于 哲，李 強，劉 飛,*，鐘 芳

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.北京秋實膠原腸衣有限公司，北京 102602）

自由基的產(chǎn)生是正常有氧細胞代謝的結(jié)果，體內(nèi)構(gòu)建的抗氧化系統(tǒng)在防止自由基損傷方面起著決定性的作用[1]。然而高濃度下的自由基可能會導致氧化應激，嚴重損害人體內(nèi)的細胞功能，甚至導致細胞死亡，引發(fā)患病狀態(tài)[2]。氧化性損傷會隨著時間延長而累積，參與癌癥、心血管和神經(jīng)性疾病的發(fā)展以及衰老過程[3]。同時，免疫系統(tǒng)也極易受到氧化劑和抗氧化劑平衡的影響，不受控制的自由基產(chǎn)生會破壞免疫系統(tǒng)的功能和防御機制[4]。大量研究表明抗氧化活性肽具有很強的自由基清除能力，可以參與到體內(nèi)抗氧化的進程[5-7]。肽鏈中的氨基酸殘基對不同的活性氧和活性氮具有不同的抗氧化活性，其中疏水殘基對清除過氧自由基有效，酸性殘基及其類似物對清除過氧亞硝酸根有效[8]。

羊皮富含膠原蛋白，脯氨酸含量高，但由于脂肪含量高、氣味差，嚴重限制了其市場潛力。堿解、熱解等一系列的預處理和蛋白水解酶可用于水解羊皮，獲得有益于人體的營養(yǎng)、功能膠原肽。許多文獻報道，分子質(zhì)量小于1 kDa的低分子質(zhì)量肽具有很強的抗氧化活性[9-12]。然而生物活性肽在胃腸道消化過程中不穩(wěn)定，會被胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化，導致活性降低甚至失去活性，不利于抗氧化活性肽到達靶細胞發(fā)揮作用；同時，現(xiàn)在許多研究傾向于通過酶解和模擬消化結(jié)合的方式從蛋白中釋放生物活性肽，如駱駝和牛酪蛋白被Alcalase和Pronase E同時水解后，模擬胃腸消化得到潛在的抗糖尿病肽[13]；模擬胃腸道消化乳鐵蛋白后得到具有血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽等[14]；然而，對膠原肽在胃腸道消化過程中活性降低原因等的研究還有所欠缺。腸溶膠囊是保護活性肽免受胃液消化最常見的方式，已廣泛用于紅霉素、奧美拉唑等藥品[15-16]，具有安全、易生產(chǎn)、成本低等優(yōu)勢。

本研究通過酶法制備3種分子質(zhì)量小于1 kDa的羊皮抗氧化活性肽，測定模擬消化前后膠原蛋白肽抗氧化活性的變化，結(jié)合計算機模擬消化肽段的變化，共同探討膠原肽在胃腸道消化過程中的抗氧化活性的變化及其原因。針對消化過程中的胃消化階段，使用腸溶膠囊對抗氧化活性肽進行保護；并進一步分析腸溶膠囊在胃消化階段對膠原肽抗氧化活性保護的有效性，為消化過程中膠原肽抗氧化活性的保持提供一種有效的手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綿羊皮 北京秋實農(nóng)業(yè)股份有限公司；羥丙甲纖維素腸溶膠囊殼 青島益青生物科技股份有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 AU/g）、中性蛋白酶（Neutrase 0.8 AU/g）、風味蛋白酶（Flavorzyme 1.5 AU/g） 丹麥諾維信生物技術有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；二水合磷酸氫二鈉、十二水合磷酸二氫鈉、乙醇、甲醛、氫氧化鈉、碳酸鈉等試劑（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1810型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；Chirascan V100 CD光譜儀 英國應用光物理公司；1260高效液相色譜系統(tǒng)（配備有ODS柱（250 mm×4.0 mm，5 μm））、1100高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器和熒光檢測器） 美國安捷倫科技有限公司；JXN-26型冷凍離心機 美國貝克曼有限公司；Infinite M200 Pro型酶標儀 瑞士帝肯貿(mào)易有限公司；串聯(lián)EASY-nano LC 1200高效液相色譜的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀（配有PEAKS Studio version X+分析軟件） 美國賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 羊皮膠原蛋白肽制備

脫毛羊皮經(jīng)洗凈、脫灰、脫脂、除雜蛋白等前處理工藝，提取膠原蛋白；然后采用NaOH溶液浸泡（0.5 mol/L、48 h），再采用Na2SO4溶液浸泡（0.75 mol/L、24 h）進行脫鈣，脫鈣后對體系進行水浴熱解處理（80 ℃、5 h）。采用不同酶活力（0.006、0.048、0.096、0.160 AU/g）堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶對羊皮膠原蛋白進行酶解，將酶解液濃縮后冷凍干燥，所得肽分別命名為堿性蛋白酶解膠原肽（alcalase hydrolyzed collagen peptide，ACP）、中性蛋白酶解膠原肽（neutrase hydrolyzed collagen peptide，NCP）和風味蛋白酶解膠原肽（flavorzyme hydrolyzed collagen peptide，F(xiàn)CP）。對ACP、NCP和FCP分析得到，3種酶活力在0.096 AU/g時制備的膠原肽寡肽（180 Da＜分子質(zhì)量＜1 000 Da）相對含量最高，分別為80.38%、48.44%和61.23%，故選擇酶活力0.096 AU/g制備的膠原肽進行后續(xù)研究。

1.3.2 體外模擬胃腸消化

參考Minekus等[17]報道的方法制備消化體系并進行膠原肽的模擬胃腸道消化。將10 mL的模擬胃液加入消化體系中，在100 r/min下均勻攪拌模擬胃液消化2 h，保持pH值為2.0±0.2，溫度為37 ℃。模擬胃消化階段之后，使用1.0 mol/L和0.1 mol/L NaOH溶液將消化體系的pH值調(diào)至7.0，立即添加15 mL pH值為7.0的模擬腸液至消化體系中，進行模擬小腸階段的消化，在100 r/min均勻攪拌下2 h，消化過程中保持體系pH值為7.0±0.2，溫度為37 ℃。在模擬消化過程中測定膠原肽的分子質(zhì)量分布和相關活性。

1.3.3 氨基酸組成測定

參照Hill[18]的方法測定氨基酸的組成。將膠原蛋白肽置于6 mol/L HCl溶液中，于120 ℃水解22 h，然后采用OPA柱前衍生化反相高效液相色譜-紫外檢測法對所得的水解產(chǎn)物進行定量，分析氨基酸的組成。使用紫外線檢測器在40 ℃下梯度洗脫，氨基酸含量以外標法定量。

1.3.4 二級結(jié)構(gòu)相對含量測定

膠原肽二級結(jié)構(gòu)采用圓二色光譜法進行分析。樣品質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，石英比色皿狹縫寬度為1.0 mm，掃描波長范圍為180～280 nm，帶寬1.0 nm，掃描速率120 nm/min，以磷酸鹽緩沖液作為空白，實驗重復3次。進一步采用CDNN軟件計算α-螺旋、β-片層、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.5 分子質(zhì)量測定

采用1100高效液相色譜儀測定膠原水解物的分子質(zhì)量分布。使用TSK凝膠2000 SWXL柱，測試條件：樣品質(zhì)量濃度5 mg/mL，上樣體積10 μL，流動相為乙腈/水/三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V），流速0.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm，柱溫30 ℃。肽標準品：Gly-Gly-Gly（189 Da）、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 Da）、桿菌肽（1 450 Da）、抑肽酶（6 511 Da）和細胞色素c（12 384 Da）。

1.3.6 液相色譜-質(zhì)譜分析

1.3.6.1 樣品前處理

膠原蛋白肽濃縮、冷凍干燥后，用于液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.3.6.2 色譜條件

色譜柱：Acclaim PepMap C18色譜柱（27 cm×75 μm）；進樣量2.0 μL；柱流速控制在400 nL/min，柱溫為40 ℃；色譜梯度洗脫，其中流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液；流動相B為體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈溶液。

1.3.6.3 質(zhì)譜條件

離子源為在線納噴霧離子源；電噴霧電壓2 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；分辨率120 000；最大注入時間50 ms；電荷狀態(tài)為2～7。

1.3.7 氨基酸殘基在N端的切割頻率計算

氨基酸殘基在N端的切割頻率按式（1）計算。

式中：F為氨基酸殘基在N端的切割頻率；A為特定氨基酸在N端的數(shù)量；P為樣品中氨基酸的百分比；M為氨基酸的摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

1.3.8 還原力測定

取0.5 mL水解物溶液，加入2.5 mL、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL質(zhì)量分數(shù)1%的鐵氰化鉀溶液，在試管中充分混勻，50 ℃水浴反應20 min。冷卻后，加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸溶液，振蕩混勻，4 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，加入1 mL蒸餾水和0.2 mL質(zhì)量分數(shù)0.1%的FeCl3溶液。靜置10 min后，溶液由黃色變?yōu)榫G色，取等量去離子水代替樣品溶液調(diào)零，在700 nm波長處測定吸光度，以吸光度表征還原力。

1.3.9 DPPH自由基清除率測定

精確稱量25 mg DPPH，溶解到1 L無水乙醇中，配制成濃度為6.5×10－5mol/L DPPH-乙醇溶液。分別吸取2 mL DPPH-乙醇溶液與無水乙醇于試管中，搖勻，在室溫下反應30 min后，在517 nm波長處測定吸光度；吸取2 mL樣品溶液和無水乙醇于試管中，搖勻，在室溫下反應30 min后，在517 nm波長處測定吸光度；最后，吸取2 mL乙醇配制的不同肽質(zhì)量濃度的樣品溶液和DPPH-乙醇溶液置于試管中，搖勻，在室溫下反應30 min后，在517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率按式（2）計算。

式中：A0為DPPH-乙醇溶液與無水乙醇的吸光度；A1為樣品溶液與無水乙醇的吸光度；A2為樣品溶液與DPPH-乙醇溶液的吸光度。

1.3.10 ABTS陽離子自由基清除率測定

配制ABTS儲備液（7.4 mmol/L、0.4 mL）：取ABTS 20.3 mg，加蒸餾水5 mL；配制K2S2O8儲備液（2.6 mmol/L、1.43 mL）：取K2S2O83.5 mg，加蒸餾水5 mL；將ABTS儲備液和K2S2O8儲備液混合后于黑暗中放置12 h，制備得到ABTS工作液；使用pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至ABTS工作液在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02，取0.8 mL ABTS工作液和0.2 mL蒸餾水配制的不同肽質(zhì)量濃度的樣品溶液并充分混合，避光靜置6 min后在734 nm波長處測定吸光度。ABTS陽離子自由基清除率按式（3）計算。

式中：A0為蒸餾水與ABTS工作液的吸光度；A為樣品溶液與ABTS工作液的吸光度。

1.3.11 計算機模擬消化

采用PeptideCutter軟件（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）模擬羊皮膠原肽的胃腸道消化，預測羊皮膠原肽消化前后的理論肽序列。計算機分析中模擬膠原序列的胃腸道消化酶的組合，包括胃蛋白酶（pH 1.3）和胰蛋白酶。

1.3.12 腸溶膠囊對膠原肽的保護作用分析

分別稱取250 mg不同酶解膠原肽，裝入腸溶膠囊殼中，采用1.3.2節(jié)的方法模擬胃腸道消化，在模擬消化結(jié)束后，測定膠原肽溶液的分子質(zhì)量分布和相關活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣品測定均重復3次。結(jié)果表示為平均值±標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原肽的基本結(jié)構(gòu)分析

肽的化學結(jié)構(gòu)特征是影響其抗氧化活性的主要因素，由肽序列中氨基酸的大小、組成、位置以及氨基酸的結(jié)構(gòu)和疏水性決定[19-20]。具有高抗氧化活性的肽通常含有較高比例的疏水氨基酸（Ala、Leu、Ile、Val、Met、Pro）或芳香氨基酸（Trp、Tyr和Phe）殘基[21]。其中，疏水氨基酸可以通過清除自由基來增強抗氧化活性[22]。一項研究表明，抗氧化肽的典型結(jié)構(gòu)特征包括在肽段N端存在的疏水氨基酸殘基Leu或Val[23-24]。同時，因Tyr中的酚羥基、Pro中的吡咯烷環(huán)、Trp中的吲哚環(huán)、His中的咪唑環(huán)、Cys中的硫醇、Met中的硫醚基團相對容易被氧化[25]，故氨基酸側(cè)鏈的抗氧化活性通常決定了肽的抗氧化活性。圖1展示了羊皮中提取膠原蛋白肽的氨基酸組成，可知膠原蛋白肽主要由Gly、Glu、Pro和Hyp組成，且Ala、Leu、Val和Pro等疏水氨基酸含量較高，具有高抗氧化活性肽的氨基酸組成結(jié)構(gòu)。圖2是不同酶解膠原肽及其消化后膠原肽的氨基酸殘基在N端切割頻率的熱圖，能夠顯示不同酶對特定氨基酸的酶切頻率，結(jié)果表明Leu和Val在肽段N端的切割頻率較高，具有抗氧化肽的典型結(jié)構(gòu)特征。

圖1 膠原蛋白肽的氨基酸組成Fig. 1 Amino acid compositions of collagen peptides

圖2 氨基酸殘基在N端切割頻率的熱圖Fig. 2 Heatmap of the calculated cutting frequency of amino acid residues at the N-terminus

此外，生物活性肽的結(jié)構(gòu)性質(zhì)主要以無規(guī)卷曲（46%）和β-片層（30%）為主，而并非β-轉(zhuǎn)角和α-螺旋[26]?？寡趸牡臒o規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)有助于活性位點的暴露，進而提高其抗氧化能力[27-28]。通過圖3和表1可知，F(xiàn)CP的β-片層相對含量最高，為48.5%，ACP和NCP的β-片層含量分別為46.0%和46.9%；而不同酶解膠原肽的無規(guī)卷曲相對含量都在28%左右。因此，不同酶解膠原肽的二級結(jié)構(gòu)組成主要以β-片層和無規(guī)卷曲為主，進一步證實其具有生物活性肽的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。由于膠原肽中Pro和Hyp含量高，而其中的吡咯結(jié)構(gòu)使折疊受限，只能取較為伸展的β-片層結(jié)構(gòu)，因此，膠原肽中的β-片層含量較高。同時，Pro殘基被認為可以改變肽的二級結(jié)構(gòu)，從而增強肽氨基酸殘基的相互作用及其抗氧化性能[24]。綜上，膠原肽富含Pro有利于抗氧化活性的體現(xiàn)。

圖3 不同酶解膠原蛋白肽的二級結(jié)構(gòu)Fig. 3 Secondary structures of collagen peptides prepared with different proteases

表1 不同酶解膠原蛋白肽的二級結(jié)構(gòu)組成Table 1 Secondary structure composition of collagen peptides prepared with different proteases

2.2 膠原肽模擬消化過程中抗氧化活性的變化

肽作為一個整體發(fā)揮其抗氧化活性，在到達目標器官之前很可能被內(nèi)源性酶消化成為氨基酸，從而失去活性。因此，通過模擬胃腸道消化考察膠原肽的抗氧化性，了解抗氧化肽在消化過程中的活性變化對實際應用具有積極的意義。采用鐵氰化鉀還原法測定模擬消化過程中膠原肽的還原能力，如圖4所示，在不同酶解膠原肽中，F(xiàn)CP顯示出最高的還原力，說明風味蛋白酶有利于抗氧化肽的產(chǎn)生。同時，不同酶解膠原肽在體外模擬消化后還原力都大幅下降，且還原力的降低主要由胃消化階段造成，說明胃蛋白酶對肽的水解作用不利于肽還原力的保留。

圖4 模擬胃腸消化前后不同酶解膠原肽的還原力Fig. 4 Reducing power of collagen peptides before and after simulated gastric and gastrointestinal digestion

肽的抗氧化活性也體現(xiàn)在對自由基的清除能力方面。圖5顯示了模擬消化過程中膠原肽DPPH自由基清除率的變化。隨著質(zhì)量濃度的升高，膠原肽的DPPH自由基清除率逐漸增強，當膠原肽質(zhì)量濃度大于6 mg/mL時，酶解膠原肽顯示出較強的DPPH自由基清除率。但不同酶解膠原肽在體外模擬胃腸消化后DPPH自由基清除率都有不同程度的下降，其中模擬消化后NCP和FCP的DPPH自由基清除率下降幅度隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大，而ACP的DPPH自由基清除率下降幅度隨著質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。然而，膠原肽DPPH自由基清除率在胃消化階段的降低幅度明顯低于胃腸消化階段，說明胃蛋白酶對具有DPPH自由基清除率肽段的降解作用在胃、腸消化階段呈現(xiàn)遞減規(guī)律。當酶解膠原肽質(zhì)量濃度低于4 mg/mL時，胃消化后酶解膠原肽的DPPH自由基清除率反而高于酶解膠原肽，說明較低質(zhì)量濃度的膠原肽在胃消化階段有利于具有較高DPPH自由基清除率的肽段釋放。

圖5 模擬胃腸消化前后不同酶解膠原肽的DPPH自由基清除率Fig. 5 DPPH radical-scavenging capacity of collagen peptides before and after simulated gastric and gastrointestinal digestion

圖6 模擬胃腸消化前后不同酶解膠原肽的ABTS陽離子自由基清除率Fig. 6 ABTS radical cation scavenging capacity of collagen peptides before and after simulated gastric and gastrointestinal digestion

圖6顯示了模擬消化過程中膠原肽ABTS陽離子自由基清除率的變化。在不同酶解膠原肽中，隨著質(zhì)量濃度的升高，膠原肽的ABTS陽離子自由基清除率逐漸增強。其中，ACP和NCP顯示較高的ABTS陽離子自由基清除率，說明堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解得到的膠原肽更有利于ABTS陽離子自由基的清除。與膠原肽消化前后DPPH自由基清除率的變化趨勢不同，NCP和FCP在體外模擬消化后，ABTS陽離子自由基清除率呈現(xiàn)上升趨勢，且消化后的膠原肽隨著質(zhì)量濃度的增加，ABTS陽離子自由基清除率基本不變。其中模擬消化后FCP的ABTS陽離子自由基清除率上升幅度最大，ACP在模擬消化前后ABTS陽離子自由基清除率變化不大。膠原肽ABTS陽離子自由基清除率在胃消化階段的上升幅度和胃腸消化階段基本一致，說明胃蛋白酶有利于肽段ABTS陽離子自由基清除率的提高。

反應物質(zhì)、反應機理、反應條件、反應動力學和定量方法的差異使得難以比較不同抗氧化劑測定法之間的結(jié)果。ABTS陽離子自由基清除率與DPPH自由基清除率變化趨勢相反，是由于ABTS陽離子自由基只對含有Tyr和Trp的肽反應靈敏度高，對其他抗氧化氨基酸的敏感度不高[29]。液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示，胃腸消化后膠原肽中含Trp的肽段數(shù)量增加（表2），這與消化后膠原肽ABTS陽離子自由基清除率上升的趨勢一致。分析實驗結(jié)果可知，膠原肽在胃消化后，顯示出高的ABTS陽離子自由基清除能力，說明胃消化后的膠原肽已經(jīng)富含Trp的肽段。

表2 體外模擬消化前后含色氨酸（Trp）膠原肽的肽段Table 2 Collagen peptides containing Trp before and after simulated gastrointestinal digestion

2.3 計算機模擬胃腸道消化膠原肽的肽段變化

目前評價蛋白質(zhì)中所包含生物活性肽的兩種主要方法是實驗檢測手段和預測技術[30]。體外消化實驗結(jié)果顯示，膠原蛋白肽在消化過程中會被消化酶水解，從而導致抗氧化活性的降低或喪失。因此，研究消化后能夠維持活性的生物活性肽[31-32]及其在消化過程中的變化具有重要的意義。通過計算機模擬胃腸道消化，分析消化過程中肽段被酶解后的變化，從而確定膠原肽活性損失的消化階段，有針對性地保護肽段從而減少活性的損失。

采用PeptideCutter軟件模擬分子質(zhì)量小于1 kDa膠原肽的胃腸道消化，得到可以被胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解的肽段。如表3所示，在計算機模擬消化過程中，有的肽段先被胃蛋白酶酶解，然后繼續(xù)被胰蛋白酶酶解。如LPQPPQE在胃消化階段被酶解成Leu和PQPPQE；AGROGEA在腸消化階段被酶解成AGR和OGEA；LDGAKGD先在胃消化階段被降解成Leu和DGAKGD，然后DGAKGD在腸消化階段被降解成DGAK和GD。但是總體看來，抗氧化肽在胃消化階段被酶解的比例高于在腸消化階段被酶解的比例，說明抗氧化肽被胃蛋白酶降解的含量較高。結(jié)合圖4、5可知，胃消化后肽段的還原力和DPPH自由基清除率都降低，也說明了部分抗氧化活性肽段在胃消化過程中被降解而失去活性。因此，對抗氧化活性膠原肽在胃腸道消化中的保護可以針對胃消化階段進行。

表3 計算機模擬胃腸消化后膠原肽的肽段變化Table 3 Changes in collagen peptides after in silico simulated gastric and gastrointestinal digestion

續(xù)表3

2.4 腸溶膠囊保護膠原肽模擬消化后抗氧化活性的變化

腸溶膠囊到達腸道之前不會分解，能夠避免胃液的破壞從而提高內(nèi)容物的生物利用度[33-34]。從圖7可以看出，體外模擬消化后，腸溶膠囊保護膠原肽的還原力總體比沒有腸溶膠囊保護的膠原肽高，說明腸溶膠囊的保護有效減少了膠原肽在胃消化過程中還原力的下降。其中，腸溶膠囊對FCP中還原力肽段的保護效果最好，腸溶膠囊保護的膠原肽在消化后的還原力明顯高于無腸溶膠囊保護的膠原肽；并且隨著膠原肽質(zhì)量濃度增加，消化后有腸溶膠囊保護的膠原肽與無腸溶膠囊保護膠原肽間還原力的差異幅度逐漸增大，從0.01升至0.05左右。其次是ACP，腸溶膠囊保護的膠原肽在消化后的還原力比無腸溶膠囊保護的肽有所提高，但差異不明顯。相比之下還原力保護效果最差的是NCP，消化后有腸溶膠囊保護的膠原肽與無腸溶膠囊保護的肽之間還原力無明顯差異。

圖7 有無腸溶膠囊保護的膠原肽模擬胃腸消化后的還原力Fig. 7 Reducing power of collagen peptides protected and not protected by enterosoluble vacant capsules after simulated gastrointestinal digestion

圖8顯示了有無腸溶膠囊保護的膠原肽模擬消化后的DPPH自由基清除率的變化，可以看出腸溶膠囊在胃消化階段有效保護了膠原肽，使DPPH自由基清除率的下降幅度明顯低于無腸溶膠囊保護的膠原肽。其中，腸溶膠囊對ACP的DPPH自由基清除率保護效果最好，腸溶膠囊保護的膠原肽在消化后的DPPH自由基清除率明顯高于無腸溶膠囊保護的膠原肽，消化后有腸溶膠囊保護的膠原肽與無腸溶膠囊保護的膠原肽間DPPH自由基清除率的差異幅度約為20%；其次是NCP，腸溶膠囊保護的膠原肽在消化后的DPPH自由基清除率比無腸溶膠囊保護膠原肽提高10%～20%；保護效果最差的是FCP，有無腸溶膠囊保護的膠原肽消化后DPPH自由基清除率無明顯差異。

圖8 有無腸溶膠囊保護的膠原肽模擬胃腸消化后的DPPH自由基清除率Fig. 8 DPPH radical scavenging capacity of collagen peptides protected and not protected by enterosoluble vacant capsules after simulated gastrointestinal digestion

有無腸溶膠囊保護的膠原肽模擬消化后的ABTS陽離子自由基清除率變化如圖9所示，和DPPH自由基清除率不同的是，腸溶膠囊保護的膠原肽在體外模擬消化后，ABTS陽離子自由基清除率的上升幅度減緩。其中，腸溶膠囊對ACP的ABTS陽離子自由基清除率的影響最小，腸溶膠囊保護的膠原肽在消化后ABTS陽離子自由基清除率和無腸溶膠囊保護的膠原肽之間差異不明顯。NCP和FCP中，腸溶膠囊保護的膠原肽在消化后的ABTS陽離子自由基清除率比未消化的ABTS陽離子自由基清除率總體有所提高，但是明顯低于無腸溶膠囊保護膠原肽；并且隨著膠原肽質(zhì)量濃度的升高，有腸溶膠囊保護的膠原肽與無腸溶膠囊保護膠原肽消化后ABTS陽離子自由基清除率的差異幅度逐漸減小，其中，F(xiàn)CP從約25%降至約2%，NCP從約35%降至約10%。

圖9 有無腸溶膠囊保護的膠原肽模擬胃腸消化后的ABTS陽離子自由基清除率Fig. 9 ABTS radical cation scavenging capacity of collagen peptides protected and not protected by enterosoluble vacant capsules after simulated gastrointestinal digestion

結(jié)合有無腸溶膠囊保護的膠原肽消化前后分子質(zhì)量分布數(shù)據(jù)分析可知，消化前NCP的分子質(zhì)量低于1 000 Da的肽段含量最少（圖10），還原力最低，但是DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率與ACP和FCP相差不大；消化后NCP與ACP和FCP的分子質(zhì)量分布基本一致，還原力也一致。說明肽段分子質(zhì)量的分布對還原力的影響較大，對自由基的清除率影響不大，自由基清除率主要取決于氨基酸側(cè)鏈的抗氧化活性[25]。消化后膠原肽中有40%～50%的游離氨基酸（分子質(zhì)量低于180 Da），與未保護組相比，腸溶膠囊保護的膠原肽在消化后的游離氨基酸含量明顯降低，降低幅度在75%左右。與膠原肽消化后的寡肽（180 Da＜分子質(zhì)量＜1 000 Da）相比，腸溶膠囊保護的膠原肽消化后寡肽含量明顯增加，最大增加60%左右（NCP）。有文獻報道，適當?shù)牡头肿淤|(zhì)量肽對抗氧化活性的產(chǎn)生有重要影響，同一物質(zhì)的不同組分中，分子質(zhì)量低于1 000 Da肽段的抗氧化能力明顯高于較高分子質(zhì)量肽段[24,35]。綜上，腸溶膠囊保護的膠原肽在模擬消化后極大地減少了游離氨基酸的產(chǎn)生，增加了寡肽含量，這與腸溶膠囊保護后膠原肽抗氧化活性的提高密切相關。

圖10 有無腸溶膠囊保護的膠原肽模擬胃腸消化前后的分子質(zhì)量分布Fig. 10 Molecular mass distribution of collagen peptides protected and not protected by enterosoluble vacant capsules before and after simulated gastrointestinal digestion

3 結(jié) 論

羊皮中提取的膠原蛋白肽的基本組成和結(jié)構(gòu)顯示了其具有抗氧化活性的特征。首先，Ala、Leu、Val和Pro等疏水氨基酸含量較高，具有高抗氧化活性肽的氨基酸組成結(jié)構(gòu)；其次，Leu和Val在肽段N端的切割頻率較高，具有抗氧化肽的典型結(jié)構(gòu)特征；再次，膠原肽的二級結(jié)構(gòu)組成主要以β-片層和無規(guī)卷曲為主，具有生物活性肽的高級結(jié)構(gòu)性質(zhì)。通過測定不同酶解膠原肽在體外模擬消化前后的抗氧化性可知，膠原肽在體外模擬消化后，還原力和DPPH自由基清除率大幅下降，且還原力的降低主要在胃消化階段完成，說明胃蛋白酶對肽的酶解作用不利于肽段還原力和DPPH自由基清除能力的保留。然而，膠原肽ABTS陽離子自由基清除率在消化后卻呈現(xiàn)上升趨勢，且在胃消化階段的上升幅度和胃腸消化階段基本一致，說明胃蛋白酶有利于肽段ABTS陽離子自由基清除率的提高，這可能是DPPH自由基和ABTS陽離子自由基對肽鏈中氨基酸的敏感度不同造成的，同時也說明了選取合適的抗氧化活性評價指標的重要性。對消化前后膠原肽肽段進行了液相色譜-質(zhì)譜分析，結(jié)合計算機模擬胃腸消化探討了膠原肽在胃、腸消化過程中的肽段變化，發(fā)現(xiàn)胃消化階段的酶解肽段比例高于腸消化階段。因此，采用腸溶膠囊包裹膠原肽，對膠原肽的胃消化階段進行針對性保護，與未保護的膠原肽，腸溶膠囊保護后的膠原肽在體外消化過程中的還原力和DPPH自由基清除能力都有一定程度的保留。其中，腸溶膠囊對ACP中還原力高的肽段和對FCP中DPPH自由基清除能力高的肽段在消化過程中具有顯著的保護效果。因此，腸溶膠囊有望成為保護膠原肽抗氧化活性的一種有效方式。