李田雨，楊遠(yuǎn)霄，劉紅艷，汪魏，周芳，周婷，趙應(yīng)忠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè) 農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢， 430062）

芝麻是我國(guó)的傳統(tǒng)特色油料作物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)雖是世界上芝麻的主產(chǎn)國(guó)之一，但也是最大的芝麻進(jìn)口國(guó)，芝麻原料供給嚴(yán)重不足[1]。利用雜種優(yōu)勢(shì)可以顯著提高作物產(chǎn)量，增強(qiáng)植株抗逆性和抗病性，是可持續(xù)發(fā)展條件下增加作物產(chǎn)量的有效途徑。目前，在水稻、油菜、小麥等多種作物中已建立雜優(yōu)育種體系，顯著提高了作物產(chǎn)量[2～5]。植物雄性不育作為雜種優(yōu)勢(shì)利用的最優(yōu)途徑而受到廣泛研究，而挖掘雄性不育相關(guān)基因，對(duì)于通過(guò)基因工程創(chuàng)制雄性不育材料、選配優(yōu)勢(shì)雜交組合、提高芝麻產(chǎn)量具有重要的意義。

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，簡(jiǎn)稱CYP450）是植物中最大的代謝酶家族，具有廣泛的底物譜和催化活性，催化大量初生和次生代謝物的生物合成及外源毒性化學(xué)物質(zhì)的降解[6]?；谙到y(tǒng)發(fā)育研究，Nelson[7]將陸地植物P450 超家族歸類(lèi)為10 個(gè)獨(dú)立的家族簇（clan），即源于相同祖先的不同基因家族的集合，同時(shí)對(duì)雙子葉植物和單子葉植物中各個(gè)家族簇中家族分布情況做出闡述。每個(gè)家族簇（clan）以簇中最小蛋白家族的編號(hào)作為簇名，包括71 Clan、72 Clan、85 Clan、86 Clan、51 Clan、74 Clan、97 Clan、710 Clan、711 Clan 和727 Clan，其中727 Clan為單子葉植物特有[8,9]。家族和亞家族基因的分類(lèi)與命名主要依據(jù)基因編碼的氨基酸序列之間的相似度[10]。目前在植物基因組中共鑒定出74 個(gè)P450 家族（family），包括127 個(gè)不同的亞家族（subfamily）[11]。

隨著分離和鑒定突變體技術(shù)的發(fā)展，不斷有新的P450 基因功能被發(fā)掘。目前有多個(gè)家族，近40個(gè)P450基因被克隆并鑒定參與了脂肪酸的羥基化、環(huán) 氧 化 等，包 括 家 族CYP703、CYP704、CYP92、CYP81、CYP77、CYP78、CYP96、CYP709、CYP726、CYP86 和CYP94[12]。其中擬南芥CYP704B1是一種長(zhǎng)鏈脂肪酸v-羥化酶基因，對(duì)花粉中孢粉素的合成至關(guān)重要[13]。有研究表明牽?；–YP703A1在花藥發(fā)育早期階段表達(dá)，并催化月桂酸的羥基化[14]。擬南芥CYP703A2在花藥小孢子和絨氈層細(xì)胞表達(dá)，催化中鏈飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的單羥基脂肪酸，被鑒定為是一個(gè)特異參與花粉發(fā)育的P450 家族[15]。另外，水稻CYP703A3作用于花藥角質(zhì)層和花粉外壁的發(fā)育，參與雄性器官發(fā)育所需的月桂酸鏈內(nèi)羥化途徑[16,17]。除了脂肪酸外，CYP450 還主要參與生物體內(nèi)萜類(lèi)化合物的合成，菊科植物黃花蒿的CYP71AV1作為多功能倍半萜類(lèi)氧化酶基因在青蒿素的生物合成途徑中起關(guān)鍵作用[18]。在唇形科植物丹參中，發(fā)現(xiàn)CYP71BE52氧化鐵氨酚，產(chǎn)生了二萜類(lèi)物質(zhì)丹參酚[19]。

本研究鑒定了芝麻P450超基因家族的成員，并克隆了芝麻CYP703 家族成員SiCYP703A2基因，初步揭示了其在花藥發(fā)育中的功能。SiCYP703A2在芝麻花蕾中特異表達(dá)，且在花藥發(fā)育的四分體時(shí)期高量表達(dá)。在擬南芥中超量表達(dá)SiCYP703A2導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥雄性不育，花粉壁發(fā)育異常。研究的結(jié)果期待為芝麻花藥發(fā)育和雜種優(yōu)勢(shì)利用提供有效的基因資源。

1 材料和方法

1.1 材料

芝麻材料為隱性細(xì)胞核雄性不育兩用系95ms-5AB，種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗(yàn)田，于自然條件下正常生長(zhǎng)。于盛花期，分別取芝麻根、莖、葉、花蕾和果莢組織，以及可育和不育花藥的四分體時(shí)期、小孢子發(fā)育時(shí)期和成熟時(shí)期的花藥樣品，迅速冷凍于液氮中，用于后續(xù)試驗(yàn)。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥（Col-0）種植于培養(yǎng)室中，溫度為22℃，光照強(qiáng)度為130 μmol·m-2·s-1，光周期為光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng)8 h，濕度控制在60%～70%。在苗期時(shí)取轉(zhuǎn)基因植株和野生型的幼嫩葉片，在花期時(shí)取不同花藥發(fā)育時(shí)期（stage7-8、9-10、11-12、13-14）的花蕾，迅速冷凍于液氮中，所有樣品保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 芝麻CYP450超家族的鑒定

芝麻全基因組氨基酸序列下載自Sinbase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. ocri-genomics. org/Sinbase/）[20]，使 用TBtools 軟件將其建立一個(gè)本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，以擬南芥P450基因的氨基酸序列作為查詢（query），在本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BlastP（E-value = 0.001），初步篩選出芝麻P450候選基因序列，后將搜索比對(duì)得到的所有同源氨基酸序列提交至Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)中的Batch sequence search 程序（E-value= 0.001）中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的分析，檢驗(yàn)其是否含有P450結(jié)構(gòu)域（PF00067），剔除重復(fù)的和錯(cuò)誤序列，最終得到預(yù)測(cè)的芝麻P450氨基酸序列。使用EMBOOS 軟件包的needleall 程序（Needleman-Wunsch 算法）對(duì)303 條芝麻P450 基因的氨基酸序列進(jìn)行全局比對(duì)，得到序列之間的一致度和相似度，參數(shù)均為默認(rèn)值[21]。

模式植物擬南芥的P450 基因的氨基酸序列下載自P450 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://drnelson. uthsc. edu/CytochromeP450.html），共273 條（不包括未分類(lèi)基因）。將得到的芝麻和擬南芥P450氨基酸序列通過(guò)ClustalW 工具進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步通過(guò)IQtree 軟件構(gòu)建芝麻和擬南芥P450 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用最大似然法（maximum likelihood，ML），設(shè)置重復(fù)次數(shù)（bootstrap）為1000。將芝麻P450 基因氨基酸序列逐條提交到擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arabidopsis. org/Blast/index. jsp）中進(jìn)行BLASTP，同時(shí)結(jié)合在NCBI 中BLASTP 的結(jié)果，尋找與其一致性最高的序列。依據(jù)P450 基因國(guó)際命名標(biāo)準(zhǔn)對(duì)預(yù)測(cè)的芝麻P450 基因進(jìn)行家族分類(lèi)：兩個(gè)P450 基因的氨基酸序列一致性（identity）在40%～55%之間則劃分為同一家族，大于55%則歸為同一亞家族[10]。

基因連鎖圖由R 包karyoploteR（1.16.0）繪制，具體方法參見(jiàn)Bernat（2019）[22]。參照其它基因家族研究中關(guān)于基因簇的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)芝麻所有P450基因進(jìn)行基因簇的分析[23,24]。判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）兩個(gè)相鄰的P450 基因的間距≤200 kb;（2）兩個(gè)P450 基因之間間隔的非P450基因個(gè)數(shù)≤8。

1.3 SiCYP703A2基因的序列分析

利用在線軟件ExPASy（http://web. expasy. org/protparam）ProtParam 預(yù)測(cè)SiCYP703A2 蛋白的分子量和理論等電點(diǎn)。運(yùn)用NCBI 中CDD（conserved domain database）程序分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域。采用ClustalX 軟件對(duì)芝麻SiCYP703A2和其它物種中CYP703 家族基因進(jìn)行多重序列比較分析，序列下載自NCBI（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/），Accession number 為：AT1G01280、XP_011093925.1、XP_003624793.1 和XP_015648492.1；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)使用MEGA7.0 軟件的鄰位相連法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建[25]，bootstrap 設(shè)為1000。Accession number 分別為 ： XP_002263965.2、 XP_003541057.1、 XP_003624793.1、XP_003624793.1、BAA92894.1、XP_021319871.1、XP_004248085.1、XP_021968776.1、AT1G01280,XP_015648492.1、NP_001149251.1。

1.4 SiCYP703A2的克隆和載體構(gòu)建

以芝麻95ms-5B 四分體時(shí)期的花藥cDNA 為模板，依據(jù)Sinbase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.sesame-bioinfo.org/Sinbase2.0/index. html）[25]中SiCYP703A2基 因 的編碼序列（CDS），通過(guò)Primer 5 軟件設(shè)計(jì)CDS 全長(zhǎng)引物SiCYP703A2-forward: 5’-ATGCTCCCCCCAGGCCCTCC-3’和SiCYP703A2-reverse: 5’- CTAATTATACAAATGGGCTGCTAGTCTG -3’，使用I-5TM 2x High-Fidelity Master Mix 高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 程序如下：98℃3 min;98℃10 s,55℃10 s,72℃1 min 35 個(gè)循環(huán)；72℃2 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后使用普通瓊脂糖凝膠DNA 試劑盒（天根生化）進(jìn)行回收純化，然后連接到TSV-007 載體（擎科生物）上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Top10，通過(guò)測(cè)序獲得無(wú)突變的陽(yáng)性克隆T-SiCYP703A2。以獲得的無(wú)突變的陽(yáng)性克隆T-SiCYP703A2 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得帶有酶切位點(diǎn)的目標(biāo)片段，并通過(guò)TA 克隆連接到TSV-007 載體（擎科生物）上，測(cè)序獲得無(wú)突變的陽(yáng)性克隆T-ovSiCYP703A2。使用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和SmaⅠ分別對(duì)表達(dá)載體PRI101-AN（TaKaRa，日本）和T-ovSiCYP703A2 進(jìn)行雙酶切，并將PCR 產(chǎn)物回收純化，后使用T4 連接酶（TaKaRa，日本）進(jìn)行連接，最終獲得過(guò)表達(dá)載體（35S::SiCYP703A2）。

1.5 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得和鑒定

通過(guò)液氮凍融法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)（GV3101），挑選單克隆進(jìn)行PCR 檢測(cè)，后將陽(yáng)性克隆接種于含有利福平（Rif）和卡納（Kan）抗生素的液體LB 培養(yǎng)基中，200 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0。收集菌體并制備蔗糖懸浮液，通過(guò)花序浸染法[26]將過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入野生型擬南芥（Col-0）中，一周后進(jìn)行第2次浸染。

將T0種子于具有卡納抗性的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，待陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子具有2 片真葉時(shí)，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，待種子成熟，收獲T1代。將單株收獲的種子于具有卡納抗性的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上篩選，通過(guò)統(tǒng)計(jì)綠苗和黃苗的分離比（符合3:1）來(lái)篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因家系，并將單拷貝超表達(dá)家系移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，待成熟后收獲各單株種子，各株系通過(guò)卡納抗性篩選，抗性不分離的株系即為純合子，用于后續(xù)的功能驗(yàn)證。

1.6 基因表達(dá)分析

所有植物材料的RNA 提取使用Trizol 試劑（Invitrogen，美國(guó)），cDNA 合成利用HiScipt II One Step RT-PCR Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊生物）。半定量PCR（RT-PCR）試驗(yàn)使用Taq Master Mix（諾唯贊生物）。RT-PCR 程序如下：95℃3 min;95℃10 s,55℃10 s,72℃1 min 30個(gè)循環(huán);72℃5 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）體系配制使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（諾唯贊生物），在Roche Light Cycler 480 系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR 分析。qRT-PCR 程序如下：95℃30 s; 95℃10 s, 60℃30 s,72℃1 min 40 個(gè)循環(huán)。以芝麻Si-Actin（SIN_1009011）的表達(dá)作為內(nèi)參，檢測(cè)SiCYP703A2在芝麻組織和花藥中的相對(duì)表達(dá)水平。以擬南芥At-Actin（AT3G18780）的表達(dá)作為內(nèi)參，檢測(cè)擬南芥花粉壁發(fā)育相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平。qRT-PCR 試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，使用2-△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平[27]。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析使用Excel 2010和SPSS11.5軟件。本研究中使用的引物列于表1。

1.7 花粉育性觀察

在植株生長(zhǎng)第8 周時(shí)，拍攝植株整體長(zhǎng)勢(shì)圖。取當(dāng)天早上正在開(kāi)花的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的花蕾，利用0.5%醋酸洋紅染色，每朵花觀察3個(gè)視野，飽滿、暗紅色的計(jì)為正?；ǚ郏菪?、染色淺或未染上色的計(jì)為不育花粉，在熒光倒置顯微鏡（IX71，Olympus）下觀察并拍照。

取當(dāng)天正在開(kāi)花的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的花蕾，加入4℃預(yù)冷的2.5%～3%戊二醛試劑，在4℃條件下進(jìn)行固定（＞4 h），之后使用PBS 緩沖液（0.1 mol/L、不含NaCl）浸洗3～5次。用系列梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）進(jìn)行脫水，之后使用醋酸異戊酯浸洗兩次。脫水后的花蕾采用臨界干燥法進(jìn)行干燥，用真空噴鍍法對(duì)樣品進(jìn)行包金，最后使用掃描電鏡（VEGA3，Tescan）觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻細(xì)胞色素P450超家族成員的鑒定

將模式植物擬南芥的P450 蛋白序列與芝麻基因組進(jìn)行比對(duì)和預(yù)測(cè)，獲得了322條候選基因，通過(guò)Pfma數(shù)據(jù)庫(kù)分析候選基因的結(jié)構(gòu)域，剔除不含P450保守結(jié)構(gòu)域的基因，最終在芝麻基因組中鑒定到了303個(gè)芝麻P450基因。氨基酸序列的全局比對(duì)分析結(jié)果顯示，這些P450 基因之間的相似度范圍在0.6%～99.8%之間，基因之間的相似度差異較大（附表1，首頁(yè)OSID 二維碼）。將273 條擬南芥P450 基因與預(yù)測(cè)的芝麻P450基因進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1 所示。芝麻303 個(gè)P450基因在雙子葉植物特有的9個(gè)家族簇中均有分布，且主要分布在71 Clan、72 Clan、85 Clan 和86 Clan 這4 個(gè) 家 族 簇 中，71 Clan 包 含192 個(gè)P450 基因，占63.0%，其次是72 Clan，占12%，而擬南芥中除71 Clan外，在86 Clan中基因分布最多。

表1 本研究中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

芝麻P450 基因在其它5 個(gè)家族簇中分布較少，這與擬南芥P450基因的分布情況一致（圖1）。依據(jù)P450 基因國(guó)際命名標(biāo)準(zhǔn)[10]，氨基酸序列一致性在45%～55%之間為同一家族，以及基因的進(jìn)化分析結(jié)果，對(duì)預(yù)測(cè)的芝麻P450 基因逐條進(jìn)行一致性鑒定，并進(jìn)行家族劃分，家族分布情況如表2，此外，預(yù)測(cè)的芝麻P450 基因分布在9 個(gè)家族簇的43 個(gè)P450基因家族中，且主要分布于家族CYP71、CYP76、CYP72、CYP706和CYP81中（表2）。

圖1 芝麻CYP450基因與擬南芥CYP450基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of CYP450 genes in Sesame and Arabidopsis

2.2 芝麻CYP450基因的染色體定位

本研究所鑒定到的303 個(gè)芝麻P450 基因全部是非重復(fù)基因，依據(jù)這些基因在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的位點(diǎn)信息，將這些基因的物理位置信息可視化。如圖2 所示，277 個(gè)P450 基因在芝麻染色體16 個(gè)連鎖群（LGs）上都有分布，并且呈現(xiàn)隨機(jī)不均勻分布的特點(diǎn)，有26 個(gè)P450 基因被定位到了未被錨定的片段上，未在圖中顯示。這些基因在LG1、LG2、LG3和LG6上的分布較為密集，分別包括36、31、34和36個(gè)基因，而在LG13 和LG16 上均只有3 個(gè)基因分布。對(duì)應(yīng)表2 的基因分布情況，可知71 Clan 的基因在每個(gè)連鎖群上都有分布，且數(shù)目均勻；72 Clan 的基因在LG6 上分布較多，在其它連鎖群上零星分布；86 Clan和85 Clan的基因在多個(gè)連鎖群上無(wú)分布。

圖2 芝麻P450基因在芝麻基因組中的分布特征Fig.2 Distribution characteristics of CYP450 genes in sesame genome

表2 預(yù)測(cè)的303個(gè)芝麻細(xì)胞色素P450基因的分布Table 2 Distribution of 303 predicted CYP450 genes in Sesamum indicum

芝麻P450 基因在連鎖群上呈明顯排列成簇的現(xiàn)象。依據(jù)基因簇的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，被定位的287 個(gè)P450 基因中，共有169 個(gè)基因以基因簇的形式分布在連鎖群上，占P450基因總數(shù)的58%?；虼乜倐€(gè)數(shù)為46個(gè)，主要出現(xiàn)在除LG13和LG16外的14個(gè)連鎖群上，LG6上存在最多的基因簇。

2.3 SiCYP703A2的克隆與序列分析

進(jìn)化分析結(jié)果顯示芝麻SIN_1014166 基因與擬南芥CYP703A2基因聚為一類(lèi)（圖1），比對(duì)結(jié)果表明兩個(gè)基因的氨基酸序列一致性為77%，符合同一亞家族的劃分標(biāo)準(zhǔn)，因此，將芝麻SIN_1014166基因命名為SiCYP703A2。通過(guò)對(duì)芝麻全基因組序列比對(duì)，SIN_1014166與芝麻P450基因之間的氨基酸序列一致性最高為37%（附表1，首頁(yè)OSID 二維碼），低于同一家族的劃分標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，芝麻P450 基因的聚類(lèi)分析顯示（附圖1，首頁(yè)OSID 二維碼），SIN_1014166為單獨(dú)的分枝，表明SIN_1014166 基因是芝麻CYP703 家族的唯一成員，這與報(bào)道的植物CYP703家族通常只包含一個(gè)成員一致。

研究表明在擬南芥和水稻中CYP703 家族的基因都特異參與了花藥發(fā)育[20,22]。為探究SiCYP703A2在芝麻中的功能，我們比較了SiCYP703A2在芝麻雄性不育兩用系95ms-5AB 之間的序列差異，結(jié)果表明，SiCYP703A2在可育和不育株植株中的DNA 序列不存在差異。該基因CDS序列長(zhǎng)度為1449 bp，編碼482 個(gè)氨基酸?；蚪M結(jié)構(gòu)分析表明，SiC?YP703A2含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子（圖3A）。將SiCYP703A2的氨基酸序列提交至NCBI 的CDD程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的分析，結(jié)果如圖3B 所示，在氨基酸位點(diǎn)2-482 的位置存在一個(gè)P450 蛋白結(jié)構(gòu)域，域名為PLN03112。預(yù)測(cè)的分子量為54.94kDa，理論等電點(diǎn)為6.24。氨基酸序列多重比較分析發(fā)現(xiàn)，SiCYP703A2與擬南芥、紫花苜蓿和水稻中的CYP703A 蛋白相似，在其C 末端都含有一個(gè)高度保守的血紅素結(jié)合域（Heme binding domain）“FSAGKRKCPG”，此外還包含C 螺旋結(jié)構(gòu)（C-Helix）“W×R×R”、PERF 結(jié)構(gòu)域“P×R×”和K 螺旋結(jié)構(gòu)（K-Helix）“E××R”（圖3C）。SiCYP703A2與其它作物中已知的CYP703家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4所示，依據(jù)單子葉植物和雙子葉植物的進(jìn)化關(guān)系而分為兩類(lèi)，SiCYP703A2與茄科植物的番茄、牽?；ê兔阑煵莸挠H緣關(guān)系較近。

圖3 SiCYP703A2的序列結(jié)構(gòu)和多序列比對(duì)分析Fig.3 Gene structure and multiple sequence alignment analysis of SiCYP703A2

圖4 SiCYP703A2基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenic analysis of SiCYP703A2

2.4 SiCYP703A2的組織表達(dá)模式

為了解SiCYP703A2的表達(dá)模式，設(shè)計(jì)了SiC?YP703A2的特異引物，即將引物序列提交到NCBI的Primer-BLAST 程序，選擇芝麻的基因組DNA 為模板，通過(guò)比對(duì)結(jié)果顯示該引物的唯一產(chǎn)物為基因SiCYP703A2，表明該引物特異檢測(cè)SiCYP703A2的表達(dá)。首先通過(guò)RT-PCR 和qRT-PCR 檢測(cè)了SiC?YP703A2在芝麻不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5A 和5B 所示，SiCYP703A2在花蕾組織中表達(dá)量最高，在根、莖、葉和果莢中幾乎不表達(dá)，表明SiC?YP703A2可能參與生殖發(fā)育。進(jìn)一步比較了SiC?YP703A2在芝麻雄性不育兩用系95ms-5AB 的不同發(fā)育時(shí)期的花藥中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，SiC?YP703A2在花藥發(fā)育四分體時(shí)期的表達(dá)量最高，在小孢子發(fā)育和花粉成熟期表達(dá)量較低。并且在不育植株四分體時(shí)期的表達(dá)水平顯著高于可育植株，在小孢子時(shí)期和成熟花粉時(shí)期，二者之間沒(méi)有差異（圖5C 和5D)，表明SiCYP703A2可能與芝麻雄性生殖器官的發(fā)育有關(guān)。

圖5 SiCYP703A2的表達(dá)模式分析Fig.5 Expression patterns of SiCYP703A2

2.5 SiCYP703A2 超量表達(dá)擬南芥植株的育性鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證SiCYP703A2在花藥發(fā)育中的功能，構(gòu)建SiCYP703A2超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，共獲得19 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子，并篩選到6 個(gè)單拷貝（綠苗和黃苗的分離比為3:1）的超表達(dá)家系并進(jìn)一步獲得其純合株系（圖6A）。選取表達(dá)量相對(duì)較高并且為純系的的超表達(dá)家系OE-4 用于后續(xù)功能分析。通過(guò)觀察OE-4 過(guò)表達(dá)家系與野生型對(duì)照的生長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，二者在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)上無(wú)明顯差異，但與野生型植株角果（圖6C）相比，SiCYP703A2超表達(dá)植株的角果變短(圖6D)。進(jìn)一步通過(guò)醋酸洋紅染色觀察花粉活力，發(fā)現(xiàn)野生型（WT）的花粉粒圓潤(rùn)飽滿，并且被染成紅色，表明野生型花粉活力正常(圖6E)，而SiC?YP703A2超表達(dá)植株的花粉粒未被染上色（圖6F），表明SiCYP703A2轉(zhuǎn)基因植株的花粉活力降低。掃描電鏡觀察進(jìn)一步表明，野生型的花粉粒飽滿且具有規(guī)則的紋飾結(jié)構(gòu)（圖6G），而SiCYP703A2超表達(dá)植株的花粉粒表面布滿不規(guī)則的凸起物，呈現(xiàn)異常的花粉壁結(jié)構(gòu)(圖6H)，這些結(jié)果表明SiCYP703A2在轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，并且可能影響正?；ǚ郾诘男纬伞?/p>

圖6 SiCYP703A2超表達(dá)植株鑒定和表型分析Fig.6 Identification and phenotypic analysis of SiCYP703A2-overexpressing plants

2.6 qRT-PCR檢測(cè)花藥發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平

為進(jìn)一步了解SiCYP703A2在花粉發(fā)育中的作用，檢測(cè)了一些花粉壁發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括AtFLP1（AT5G57800）、AtCYP704B1（AT1G69500）、AtPKSA（AT1G02050）、AtPKSB（AT4G34850）、AtTK?PR1（AT4G35420）和AtTKPR2（AT1G68540）[28～31]。如圖7 所示，與野生型相比，在SiCYP703A2超表達(dá)植株中，AtFLP1、AtTKPR1、AtTKPR2和AtPKSA的表達(dá)水平在花粉發(fā)育的7～14時(shí)期都出現(xiàn)明顯下調(diào)，而AtCYP704B1和AtPKSB的表達(dá)水平在花粉發(fā)育前期即7、8 時(shí)期出現(xiàn)上調(diào)，在發(fā)育成熟時(shí)期即13、14 時(shí)期又出現(xiàn)下調(diào)。這些結(jié)果說(shuō)明SiCYP703A2的過(guò)表達(dá)擾亂了花粉壁發(fā)育相關(guān)基因的正常表達(dá)，SiC?YP703A2可能參與了花粉壁發(fā)育。

圖7 花藥發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平Fig.7 Relative expression levels of genes related to anther development

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，研究人員不斷從植物中分離出新的CYP450 家族和基因，Nelson 等人[32]構(gòu)建的細(xì)胞色素P450 數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了動(dòng)物、植物和真菌等生物，包括擬南芥、番茄、玉米和大麥等在內(nèi)的66 種植物。擬南芥基因組中含有286 個(gè)P450 基因（包括未分類(lèi)的基因），分為45 個(gè)家族和72 個(gè)亞家族，水稻和煙草中分別包含47 和44 個(gè)P450 家族[32～34]。并且在擬南芥基因組數(shù)據(jù)中已有245 個(gè)P450 基因被注釋，煙草中有173個(gè)P450基因已經(jīng)找到EST證據(jù)[34]。本研究中，我們?cè)谥ヂ橹需b定到了303 個(gè)可能的P450 基因（圖1），系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，芝麻的303 個(gè)可能的P450 基因歸屬于43 個(gè)基因家族（表2），這與一般雙子葉植物中的P450 基因分布情況相似。芝麻中CYP51、CYP75、CYP85、CYP711、CYP734 等家族的成員個(gè)數(shù)與擬南芥相同，但芝麻中不含有在擬南芥中存在的CYP708 和CYP709 家族。而在芝麻基因組中鑒定到的CYP736 家族，在擬南芥和水稻中均不存在，而CYP736 家族在苜蓿中也被鑒定到[12,35]。此外，研究表明擬南芥和水稻中共有的P450基因家族只有2/3，這可能與P450 基因在物種間的差異性和進(jìn)化程度有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)芝麻P450 基因在16 個(gè)連鎖群上是隨機(jī)分布的，71 Clan 作為最大的簇，其簇內(nèi)基因在每一個(gè)連鎖群上都有分布。同時(shí)，14 條連鎖群上出現(xiàn)多個(gè)基因密切排列的基因簇，這些基因一般具有較高的相似度，多數(shù)屬于同一個(gè)基因家族。基因簇的出現(xiàn)一般是由于基因復(fù)制產(chǎn)生的，芝麻P450 基因較多的聚集在LG1、LG2、LG3 和LG6 這四個(gè)連鎖群上，因此，推測(cè)它們相應(yīng)的染色體上可能發(fā)生過(guò)P450基因的大量復(fù)制。

細(xì)胞色素P450 是生物界廣泛存在的超大蛋白家族，蛋白結(jié)構(gòu)和功能多樣。P450 基因一般具有500 個(gè)左右的氨基酸，分子量在46～60 kDa，不同家族的氨基酸序列存在差異，但三級(jí)結(jié)構(gòu)一般都由N端的折疊結(jié)構(gòu)和C 端的螺旋束構(gòu)成[36,37]。同時(shí)功能結(jié)構(gòu)域也具有很高的保守度，特別是起接受電子作用的血紅色素結(jié)合位點(diǎn)（Heme binding domain），該位點(diǎn)含有一個(gè)絕對(duì)保守的半胱氨酸（Cys）殘基，與鐵元素形成硫醇鹽離子鍵，以及與血紅素形成電子拉鏈的螺旋C（helix-C）和起到穩(wěn)定血紅素核心結(jié)構(gòu)作用 的 螺 旋K（helix-K）[38]。 本 研 究 克 隆 到SiC?YP703A2，其編碼482 個(gè)氨基酸，含有一個(gè)保守的P450 家族結(jié)構(gòu)域，屬于細(xì)胞色素P450 家族的成員（圖3B）。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示SiCYP703A2含有多個(gè)在P450 蛋白中保守的結(jié)構(gòu)域和螺旋結(jié)構(gòu)（圖3C），這些結(jié)構(gòu)與P450 基因特征結(jié)構(gòu)一致。SiC?YP703A2的系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明SiCYP703A2與茄科植物的親緣關(guān)系較近（圖4），并且牽?；–YP703A1基因已被揭示在花藥發(fā)育階段表達(dá)，推測(cè)SiC?YP703A2可能具有相似的表達(dá)模式。

芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)分析顯示許多擬南芥P450 基因的表達(dá)具有組織特異性，如CYP88A3和CYP706A2在葉片組織中的表達(dá)水平較高，CYP77A6僅在花中特異表達(dá)，CYP708A2僅在根中特異表達(dá)，CYP81F4和CYP83B1在營(yíng)養(yǎng)組織中特異表達(dá)[39]。煙草中，部分P450基因在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)水平都較高，如CYP73A1、CYP51G1、CYP82E2、CYP90A2和CYP97B1等，推測(cè)這些基因可能參與內(nèi)源生理代謝途徑[40]。本研究對(duì)芝麻SiCYP703A2進(jìn)行組織表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)SiCYP703A2在花蕾組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其它組織，進(jìn)一步檢測(cè)SiCYP703A2在整個(gè)花藥發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在芝麻花藥發(fā)育的四分體時(shí)期表達(dá)量最高（圖5）。這與擬南芥、水稻和牽?；ㄖ蠧YP703A基因的表達(dá)模式相符[14～17]，因此，推測(cè)SiCYP703A2可能發(fā)揮與這些基因相似的功能，參與芝麻雄性生殖器官的發(fā)育。

敲除CYP703A2基因的擬南芥植株呈現(xiàn)部分雄性不育表型，超微結(jié)構(gòu)觀察顯示敲除系植株的花粉壁發(fā)育嚴(yán)重受損，外壁缺失[15]。水稻cyp703a3-2突變體的花藥較小并且不產(chǎn)生花粉粒，電鏡觀察顯示花藥的表皮層出現(xiàn)缺陷[17]。我們?cè)跀M南芥中超量表達(dá)SiCYP703A2，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的莢果長(zhǎng)度與野生型相比明顯縮短（圖6C、D），并且花粉活力顯著降低（圖6E 和6F）。進(jìn)一步通過(guò)掃描電鏡觀察花粉粒結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株花粉粒表面出現(xiàn)異常突起物，花粉壁結(jié)構(gòu)存在嚴(yán)重缺陷（圖6G 和6H）。這可能是由于轉(zhuǎn)基因植株花藥中SiCYP703A2持續(xù)表達(dá)導(dǎo)致AtCYP703A2的精確表達(dá)被破壞。有研究也表明，ABORTED MICROSPORES（AMS）作為擬南芥絨氈層特定的擬南芥轉(zhuǎn)錄因子，其正確的表達(dá)時(shí)機(jī)對(duì)于絨氈層和花粉發(fā)育至關(guān)重要[41]。花粉外壁是花粉最外層的結(jié)構(gòu)，其主要組成成分為孢粉素。目前在擬南芥、水稻、煙草等作物中存在一條保守的孢粉 素 生 物 合 成 路 徑，由FLP1、ACOS5、PKSA/B、CYP703A、CYP704B、TKPR1/2等基因順序作用，最終合成孢粉素的前體物質(zhì)[42,43]。檢測(cè)這些基因在SiCYP703A2過(guò)表達(dá)擬南芥中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示（圖7）這些基因的表達(dá)水平都被擾亂，并且多個(gè)基因的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下調(diào)，可能由于SiCYP703A2的過(guò)表達(dá)干擾了這些基因的正常表達(dá)，擾亂了正常的孢粉素代謝途徑，最終導(dǎo)致花粉外壁異常。

綜上所述，本研究鑒定了303 個(gè)芝麻細(xì)胞色素P450 基因，分布在43 個(gè)基因家族中。SiCYP703A2具有保守的P450 結(jié)構(gòu)域和螺旋結(jié)構(gòu)，可能是芝麻CYP703 家族的唯一成員。組織表達(dá)模式顯示該基因在芝麻花蕾組織中高量表達(dá)。在擬南芥中超量表達(dá)SiCYP703A2導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉壁發(fā)育異常，植株育性降低，花粉結(jié)構(gòu)異常，并且多個(gè)與花粉壁發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化。這些結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中SiCYP703A2可能通過(guò)影響花粉壁發(fā)育進(jìn)而影響花粉育性。本研究對(duì)芝麻中P450 超家族進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其家族分類(lèi)和進(jìn)化進(jìn)行分析，為芝麻P450基因的功能研究奠定了良好基礎(chǔ)。同時(shí)揭示了芝麻SiCYP703A2基因在花粉發(fā)育中的功能，為芝麻雜種優(yōu)勢(shì)的利用提供基因資源和新思路。