謝亞平 葉瑩 余楓 夏洪 李銳 張?jiān)?熊瑛 (武漢市武昌醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430000)

在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，糖尿病腎病(DN)已成為終末期腎病(ESRD)的主要原因，它被認(rèn)為是慢性微血管并發(fā)癥，同時(shí)發(fā)生在1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)中〔1〕。高血糖可通過多種分子機(jī)制介導(dǎo)糖尿病中的腎臟損害，其中包括氧化應(yīng)激，促炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1表達(dá)，成纖維細(xì)胞和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活化等〔2〕。有學(xué)者認(rèn)為DN在中醫(yī)學(xué)屬“消渴”范疇，而尿毒清顆粒具有活血化瘀、通腑降濁、健脾利濕之功效，可用于DN早期腎衰竭患者的治療，該研究已取得滿意療效〔3〕。芍藥苷(PF)是尿毒清顆粒的主要活性成分〔4〕，具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化等〔5，6〕。本研究旨在探討PF是否通過抗氧化及抗炎作用對(duì)高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞(SV40 MES 13)產(chǎn)生保護(hù)作用，揭示其可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SV40 MES 13小鼠腎小球系膜細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；PF購(gòu)自Sigma公司；DMEM、F-12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；CCK-8試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α 、白細(xì)胞介素(IL)-6 、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)(ELISA)試劑盒、兔抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)多克隆抗體、兔抗磷酸化(p)-ERK多克隆抗體、兔抗p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)多克隆抗體、兔抗p-p38MAPK多克隆抗體購(gòu)自bioswamp公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 352型酶標(biāo)儀(芬蘭LabSystems Multiskan MS公司)、AC-8洗板機(jī)(芬蘭Thermo LabSystems公司)、NovoCyte流式細(xì)胞儀(艾森)、TG16W微量高速離心機(jī)(愛來寶(濟(jì)南)醫(yī)療科技)、MD1000正置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)等。

1.3細(xì)胞模型構(gòu)建及分組處理 細(xì)胞以含5%胎牛血清的DMEM(71.25%)和F-12(23.75%)培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組如下：①正常對(duì)照組；②高糖組：以60 mmol/L葡萄糖處理細(xì)胞48 h；③低、中、高劑量PF組：在高糖組基礎(chǔ)上給予2.5、10.0、30.0 μmol/L PF預(yù)處理細(xì)胞6 h，之后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4CCK-8法檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞增殖情況 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于96孔板(每孔180 μl，細(xì)胞密度5×103個(gè)/孔)，每組細(xì)胞接種3個(gè)復(fù)孔，按1.3中分組方式培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后向每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的光密度值。計(jì)算細(xì)胞增殖率(增殖率=試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%)。

1.5炎性因子的測(cè)定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒使用說明書測(cè)定TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.6DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞ROS水平 調(diào)整DCFH-DA濃度為10 μmol/L，細(xì)胞濃度為1×107/ml，于37℃避光孵育20 min，待探針和細(xì)胞充分接觸后，以無血清培養(yǎng)基洗滌，以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，收獲細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用NovoCyte數(shù)據(jù)分析軟件定量分析各組細(xì)胞ROS相對(duì)水平。

1.7Western印跡 收集各組細(xì)胞裂解液，煮沸10 min，離心，取上清進(jìn)行蛋白定量。之后，取20 μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)抗體，4℃過夜。洗膜后，用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，1 h后洗膜，進(jìn)行顯色。將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，通過 TANON GIS 軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖情況的影響 與正常對(duì)照組細(xì)胞增殖率〔(1.00±0.01)%〕相比，高糖組〔(0.66±0.01)%〕顯著降低(P<0.01)；與高糖組細(xì)胞增殖率相比，低、中、高劑量PF組〔(0.71±0.01)%、(0.82±0.01)%、(0.83±0.01)%〕均顯著升高(均P<0.01)；中、高劑量PF組顯著高于低劑量PF組(P<0.05)。

2.2PF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子的影響 與正常對(duì)照組相比，高糖組IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與高糖組比較，低、中、高劑量PF組IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.01)。見表1。

表1 各組細(xì)胞炎性因子水平

2.3PF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞ROS水平的影響 與正常對(duì)照組相比，高糖組ROS水平顯著升高(P<0.01)；與高糖組比較，低、中、高劑量PF組ROS表達(dá)水平顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.01)。見表2。

2.4PF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞ERK及p38MAPK蛋白磷酸化水平的影響 與正常對(duì)照組相比，高糖組p-ERK/ERK、p-MAPK/MAPK水平顯著升高(P<0.01)；與高糖組比較，低、中、高劑量PF組p-ERK/ERK、p-MAPK/MAPK水平顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.01)。見表2。

表2 各組ROS、p-ERK/ERK、p-MAPK/MAPK水平比較

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致DN的原因不僅是血流動(dòng)力學(xué)和代謝紊亂，也是機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的結(jié)果〔7〕。并且氧化應(yīng)激反應(yīng)的水平與DN所造成的腎臟損傷呈正相關(guān)〔8〕。氧化應(yīng)激是體內(nèi)過度發(fā)生的氧化反應(yīng)，可生成較多的ROS，ROS可直接氧化并破壞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，還通過激活許多細(xì)胞應(yīng)激敏感途徑如JNK、ERK1/2和p38MAPK間接誘導(dǎo)對(duì)組織的損害〔9〕。

研究發(fā)現(xiàn)PF在關(guān)節(jié)炎〔10〕、肝臟疾病〔11〕中均顯著抑制炎性因子。Jia等〔10〕發(fā)現(xiàn)PF可通過調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥因子水平及環(huán)氧酶(COX)2的表達(dá)來改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。Fan等〔12〕研究表明PF可通過ROS介導(dǎo)的ERK1/2和p38信號(hào)通路抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子BB誘導(dǎo)的原代大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖。Xie等〔13〕通過構(gòu)建大鼠肝臟缺血再灌注(I/R)模型，發(fā)現(xiàn)PF在肝臟I/R損傷中起延緩作用，與下調(diào)ERK1/2、JNK1/2、 p38的磷酸化表達(dá)有關(guān)。 Lin等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)PF可顯著減少血清中丙二醛(MDA)含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)含量，減弱氧化應(yīng)激水平。腎小球系膜細(xì)胞是維持腎小球正常形態(tài)和功能的重要組成部分，其主要作用是維持腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整。在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)MES-13細(xì)胞，將會(huì)使細(xì)胞內(nèi)ROS的含量升高從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔15〕。

綜上，PF能減輕高糖誘導(dǎo)下腎小球系膜細(xì)胞所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，可顯著降低細(xì)胞炎癥水平和ROS含量，其機(jī)制可能與ERK/p38MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。