韓東衛(wèi) 楊琴琴 王利芳 梁欣 張洪波 張維君

黑龍江中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040

慢性阻塞性肺疾?。ㄒ韵潞喎Q“慢阻肺”）是指持續(xù)性的氣流受限及相應(yīng)呼吸系統(tǒng)癥狀[1]。慢阻肺急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）在肺功能減退基礎(chǔ)上，合并有氣道黏液高分泌、管腔內(nèi)滲出、小氣道炎癥等急性并發(fā)癥[2]。中醫(yī)可將AECOPD 歸屬于“喘證”“肺脹”范疇，本虛標實是其發(fā)病的基本病機。小青龍湯出自張仲景《傷寒論》，具有解表散寒、溫肺化飲之效。多項研究表明，小青龍湯治療AECOPD 效果確切，且優(yōu)于單獨應(yīng)用西藥治療[3-4]。

1 材料與方法

1.1 藥物成分與靶標

中醫(yī)藥整合藥理學平臺（integrative pharmacologybased research platform of traditional Chinese medicine，TCMIP）V2.0 平臺檢索小青龍湯（麻黃、芍藥、細辛、干姜、甘草、桂枝、半夏、五味子），構(gòu)建化學成分庫。與DrugBank 化學指紋特征比對，以相似性系數(shù)Tanimoto≥0.8 篩選藥物候選靶標。以“AECOPD”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建疾病靶標。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學科研倫理委員會審核通過。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

藥物-疾病交集靶標，通過度中心性、接近中心性、中介中心性中位數(shù)卡值得到核心靶標，導入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.3 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

STRING 數(shù)據(jù)庫下載潛在靶標的GO 及KEGG 數(shù)據(jù)，借助微生信在線平臺進行富集分析。

1.4 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與可視化分析

借助Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建小青龍湯治療AECOPD 多維網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 分子對接

借助AutoDock 軟件進行分子對接處理，ZINC 數(shù)據(jù)庫下載活性成分“mol2”文件，PDB 數(shù)據(jù)庫下載靶點蛋白的3D 晶體結(jié)構(gòu)，用Pymol 軟件進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 小青龍湯化學成分及靶標

TCMIP V2.0 平臺檢索得到小青龍湯化學成分401 個，候選藥物靶標595 個。GeneCards（相關(guān)分數(shù)＞30 分）與OMIM 檢索得到疾病靶標825 個。

2.2 核心靶標篩選

藥物-疾病交集靶標58 個，根據(jù)中位數(shù)卡值得到23 個核心靶標。見圖1。

圖1 藥物-疾病核心靶標

2.3 GO 和KEGG 富集分析

GO 富集分析結(jié)果顯示，核心靶標主要參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、對含氧化合物反應(yīng)等生物過程。KEGG 富集分析結(jié)果涉及腫瘤壞死因子、AGEs-RAGE 等信號通路，多與炎癥免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激及能量代謝過程相關(guān)。見圖2。

圖2 GO 和KEGG 富集分析

2.4 活性成分篩選

以核心靶標反向查找，且滿足類藥性等級為“Good”“Moderate”的活性成分有41 個。見表1。

表1 小青龍湯治療AECOPD 的潛在活性成分

2.5 網(wǎng)絡(luò)可視化

利用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“小青龍湯-活性成分-核心靶標-表型-AECOPD”多維網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。

圖3 多維網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接

結(jié)合能＜-6 kcal/mol 的對接結(jié)果，見表2。結(jié)果顯示芍藥二酮、異甘草素、2，4，4’-Trihydroxychalcone 與核心靶標中的表皮生長因子、AKT 激酶1、腫瘤壞死因子具有較好的結(jié)合能力。見圖4。

圖4 分子對接可視化

表2 分子對接結(jié)果

3 討論

炎癥與免疫、氧化應(yīng)激均被認為是AECOPD 發(fā)病的關(guān)鍵機制[5-8]，本研究經(jīng)篩選得到23 個核心靶標。其中腫瘤壞死因子、白細胞介素-6 在介導免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9]。多項研究表明，AECOPD 進程中腫瘤壞死因子、白細胞介素-6 的表達顯著升高[10-13]。張月[14]研究發(fā)現(xiàn)給予AECOPD 患者小青龍湯治療后，血清中腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6 水平顯著下降。多項研究表明，肺上皮細胞PI3K、AKT 激酶過度激活與慢阻肺進展密切相關(guān)[15-17]。莫碧文等[18]研究表明，小青龍湯可抑制p-AKT 激酶表達改善哮喘氣道重塑。有研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子及其受體表皮生長因子R高表達與慢阻肺氣道上皮杯狀細胞增殖和黏液產(chǎn)生呈正相關(guān)[19-20]。

近年來研究表明，黃酮類成分多具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[21-23]。于維漢等[24]研究表明，槲皮素能抑制細胞炎癥介質(zhì)的形成，抑制白細胞介素-1β、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α 等炎癥因子的分泌及表達。山柰酚可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號通路對AECOPD 起到保護作用[25]。生物堿類成分可抑制白細胞介素-4、腫瘤壞死因子-α 等細胞因子的釋放，減輕氣道炎癥反應(yīng)，松弛支氣管平滑肌，解除痙攣[26]。

綜上所述，本研究通過整合藥理學分析小青龍湯的多種活性成分，主要包括黃酮類、生物堿、酚類及少數(shù)有機酸類等，可通過抑制肺部炎癥及氧化應(yīng)激恢復肺的正常代謝功能，進而改善AECOPD 進程。