解丹丹 夏 磊 李松果 潘獻(xiàn)柱

1.安徽省第二人民醫(yī)院病理科，安徽合肥 230041；2.安徽省第二人民醫(yī)院泌尿外科，安徽合肥 230041

前列腺癌是一種嚴(yán)重危害男性生命的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率也逐年上升[1-2]，不同于歐美前列腺癌人群，我國中晚期前列腺癌患者比例更高[3]。非編碼RNAs 是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）等，參與癌變進(jìn)展[4-5]。LncRNA LINC 00355 是新近發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，在胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)，發(fā)揮促癌基因作用[6-7]。生物信息工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-494-3p 可能為LncRNA LINC00355 的靶基因，細(xì)胞周期素D2（cyclin D2，CCND2）可能為miR-494-3p 的靶基因。CCND2 是一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，高表達(dá)可使細(xì)胞異常增殖，與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。本研究旨在分析前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA表達(dá)及臨床意義，以期為研究前列腺癌相關(guān)分子機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取安徽省第二人民醫(yī)院2015 年1 月至2017 年12 月收治的91 例前列腺癌患者，年齡42～83 歲，平均（62.15±7.54）歲；病理類型：腺癌72 例，導(dǎo)管腺癌7 例，導(dǎo)管內(nèi)癌5 例，基底細(xì)胞癌4 例，其他類型3 例；腫瘤直徑：≥5 cm 37 例，＜5 cm 54 例；前列腺特異性抗原：≥10 μg/L 64 例，＜10 μg/L 27 例；分化程度：低未分化46 例，中高分化45 例；TNM 分期[9]：Ⅰ期20 例，Ⅱ期35 例，Ⅲ期21 例，Ⅳ期15 例；轉(zhuǎn)移：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23 例，骨轉(zhuǎn)移15 例，內(nèi)臟轉(zhuǎn)移7 例；Gleason評分1～7 分，平均（3.82±0.75）分。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為前列腺癌；②首次確診，未接受過放化療等免疫靶向治療；③臨床病理資料及隨訪資料完整；④漢族；⑤患者及家屬均知情研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位的惡性腫瘤；②合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾?。虎酆喜⑷砀腥拘约膊?；④并發(fā)血液系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

手術(shù)切除前列腺癌組織及距癌組織≥5 cm 癌旁正常組織，常規(guī)石蠟切片，刮出切片部分組織放至EP管，Trizol 總RNA 抽提試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，貨號：RN0401）提取組織中總RNA，紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 濃度、純度、完整性，TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海易匯生物科技有限公司，貨號：206143）合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系（25 μl）：12.5 μl SYBR Premix Ex TaqⅡ、1 μl 正向引物、1 μl 反向引物、2 μl DNA 模板、8.5 μl dH2O；反應(yīng)條件：95℃2 min、95℃30 s、60℃30 s，72℃30 s，循環(huán)40 次，2-ΔΔCt法計算組織中LncRNA LINC00355（內(nèi)參GAPDH）、miR-494-3p（內(nèi)參U6）、CCND2 mRNA（內(nèi)參β-actin）相對表達(dá)量。引物和內(nèi)參序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3 隨訪

患者出院后通過門診復(fù)查或電話跟蹤對其進(jìn)行為期3 年的隨訪，以均值進(jìn)行分組，比較不同LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達(dá)患者生存狀況，隨訪至2020 年12 月。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間生存率log-rank檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織和癌旁正常組織中LncRNA LINC 00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達(dá)比較

前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、CCND2 mRNA 表達(dá)高于癌旁組織，miR-494-3p 表達(dá)低于癌旁組織（P ＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 電泳條帶

表2 前列腺癌組織和癌旁正常組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達(dá)比較（）

表2 前列腺癌組織和癌旁正常組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達(dá)比較（）

注 LncRNA：長鏈非編碼RNA；miRNA：微小RNA；CCND2：細(xì)胞周期素D2

2.2 前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 的相關(guān)性

前列腺癌組織中LncRNA LINC00355 與miR-494-3p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與CCND2 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r=-0.502、0.458，P ＜0.001）；miR-494-3p 與CCND2 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.493，P ＜0.001）。

2.3 前列腺癌患者LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

隨訪3～36 個月，中位22 個月，死亡33 例，術(shù)后3 年總生存率為63.74%（58/91），LncRNA LINC00355高表達(dá)（≥2.552）患者與低表達(dá)（＜2.552）患者術(shù)后3 年總生存率分別為52.38%（22/42）、73.47%（36/49）；miR-494-3p 高表達(dá)（≥0.272）患者與低表達(dá)（＜0.272）患者術(shù)后3 年總生存率分別為76.09%（35/46）、51.11%（23/45）；CCND2 mRNA 高表達(dá)（≥2.196）患者與低表達(dá)（＜2.196）患者術(shù)后3 年總生存率分別為47.50%（19/40）、76.47%（39/51）。Kaplan-Meier 曲線顯示，LncRNA LINC00355 高表達(dá)、miR-494-3p 低表達(dá)、CCND2 mRNA 高表達(dá)患者術(shù)后3 年總生存率低于LncRNA LINC00355 低表達(dá)、miR-494-3p 高表達(dá)、CCND2 mRNA低表達(dá)患者（log-rank χ2=7.516、6.097、10.016，P=0.006、0.014、0.002）。見圖2。

圖2 不同LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達(dá)前列腺癌患者術(shù)后3 年的生存曲線

3 討論

LncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本＞200 個核苷酸的非編碼RNA，參與調(diào)控染色質(zhì)修飾、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄與抑制、基因組印記等過程，與細(xì)胞生長、分化、增殖等過程密切相關(guān)[10-11]。LncRNA LINC00355 是近年新發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，有研究指出，其能通過靶向調(diào)控miRNA 影響下游靶基因的表達(dá)，以參與肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤的癌變進(jìn)展[12-14]。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織中LncRNA LINC00355 表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，提示LncRNA LINC00355 在前列腺癌中發(fā)揮促癌基因作用。進(jìn)一步分析顯示，LncRNA LINC00355 高表達(dá)患者術(shù)后3 年總生存率明顯降低，提示LncRNA LINC00355表達(dá)上調(diào)可能是前列腺癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。Jiang 等[15]利用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，LncRNA LINC00355 為前列腺癌差異表達(dá)LncRNA，并與患者生存率相關(guān)。張建育等[16]通過小干擾RNA 下調(diào)前列腺癌細(xì)胞（DU145）LncRNA LINC00355 發(fā)現(xiàn)，DU145 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力明顯降低。再次證實LncRNA LINC00355 參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。

miRNA 在多種腫瘤中均有表達(dá)，轉(zhuǎn)錄后可以參與腫瘤病理生理過程[17-18]。Zhu 等[19]研究報道，miR-494-3p 能通過調(diào)節(jié)磷酸酶與張力蛋白同源物/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移、入侵。Chen 等[20]研究報道，miR-494-3p 能通過抑制Bmi1 蛋白表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖能力。提示miR-494-3p 在不同腫瘤中表達(dá)及功能均有差異。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織中miR-494-3p表達(dá)低于癌旁正常組織，miR-494-3p 高表達(dá)患者術(shù)后3 年總生存率明顯升高，提示miR-494-3p 在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，miR-494-3p 表達(dá)下調(diào)可能是前列腺癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。其機(jī)制可能與miR-494-3p 能靶向CXC 趨化因子受體4 抑制前列腺癌細(xì)胞惡性行為有關(guān)。CXC 趨化因子受體4 是一種趨化因子受體，研究表明，癌細(xì)胞上大量表達(dá)CXC 趨化因子受體4 時，能促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[20-21]。Shen 等[22]通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CXC 趨化因子受體4 為miR-494-3p 的靶基因，上調(diào)miR-494-3p 表達(dá)能靶向下調(diào)CXC 趨化因子受體4 抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和促進(jìn)凋亡。

CCND2 作為一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其異常表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞異常增殖、遷移、侵襲的作用已被證實[8,23]，本研究亦證實前列腺癌組織中CCND2 高表達(dá)，同時CCND2 高表達(dá)患者術(shù)后3 年總生存率明顯降低。lncRNA可作為內(nèi)源競爭RNA 競爭占有胞內(nèi)miRNA，像海綿樣緩沖削減并干涉靶基因mRNA 編碼蛋白的能力[24]。研究表明，miR-34、miR-21、miR-155、miR-221 等能靶向調(diào)節(jié)CCND2 參與前列腺癌發(fā)生發(fā)展[25]。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 指標(biāo)間均有一定的關(guān)系，提示三者可能共同參與前列腺癌進(jìn)展。上調(diào)前列腺癌細(xì)胞LncRNA LINC00355 表達(dá)能抑制miR-494-3p 表達(dá)，上調(diào)CCND2 表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。雙熒光素酶報告實驗證實LncRNA LINC00355 與miR-494-3p 存在靶向關(guān)系，miR-494-3p 與CCND2存在靶向關(guān)系[16]。提示LncRNA LINC00355 可能通過競爭內(nèi)源RNA 抑制miR-494-3p 表達(dá)，從而上調(diào)CCND2 表達(dá)，參與前列腺癌的發(fā)展。

綜上所述，前列腺癌組織中LncRNA INC00355、CCND2 mRNA 表達(dá)上調(diào)，miR-494-3p 表達(dá)下調(diào)，LncRNA LINC00355 可能通過抑制miR-494-3p 上調(diào)CCND2 mRNA 表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。