賴志昆 馮其茂 王 骕 胡曉貞

上海市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200071

缺血所引起的組織損傷是致死性疾病的主要原因，如冠狀動(dòng)脈硬化導(dǎo)致的心肌梗死、腦卒中等。有研究發(fā)現(xiàn)[1]，對(duì)組織造成損傷的主要因素并非缺血本身，而是恢復(fù)血液供應(yīng)后，過(guò)量的自由基攻擊這部分重新獲得血液供應(yīng)的組織內(nèi)的細(xì)胞所造成的。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AA）是傳統(tǒng)中藥黃芪的重要活性成分之一，具有多種藥理活性，如提高損傷心肌細(xì)胞的存活率[2]、抗病毒、心臟保護(hù)[3]、抗氧化、抗老化[4]等作用。AA 在多種溶劑中溶解度較差[5]，這限制了其臨床應(yīng)用。脂質(zhì)聚合物納米粒（lipid polymerhybrid nanoparticles，LPNs）作為一種新型給藥系統(tǒng)，可以提高難溶性藥物的溶解性及生物利用度[6]，近年來(lái)備受關(guān)注。本研究通過(guò)構(gòu)建缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的大鼠模型，評(píng)價(jià)AA-LPNs 對(duì)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

AA、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]（購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司，貨號(hào)：MB1955、MB5649）；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20200103、20200407、20200206、20200216）；TUNEL 檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)羅氏公司，貨號(hào)：11684795910）。

1.2 主要儀器

低溫離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，H2050R）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，R206 型）；全自動(dòng)血生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BS-220）；透射電子顯微鏡（日本JEOL，JEM-2100）；高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司，Agilent 1260）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠，清潔級(jí)，體重（180±20）g，購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。合格證號(hào)：SYXK（京）2019-0024。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)化條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)前自由飲水和進(jìn)食。本研究遵循了上海市中醫(yī)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南，并經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 制劑制備及表征 參考文獻(xiàn)[7]制備AA-LPNs。將20 mg AA 溶于20 ml 丙酮，加入100 mg PLGA 作為油相。將15 mg 合成磷脂和15 mg 大豆卵磷脂用無(wú)水乙醇溶解（100 mg/ml），加入到40 ml 超純水中，65℃加熱至脂質(zhì)充分分散均勻，作為水相。將油相邊攪拌邊倒入水相中，渦旋3 min。磁力攪拌器（300 r/min）室溫下攪拌2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮。經(jīng)0.8 μm 濾膜濾過(guò)，得到AA-LPNs。用透射電子顯微鏡及粒徑儀對(duì)其形態(tài)和粒徑分布進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究 選取16 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為常規(guī)組（8 只）和研究組（8 只）。實(shí)驗(yàn)前，大鼠禁食不禁水過(guò)夜。將AA 和AA-LPNs 以40 mg/kg的劑量灌胃給藥，給藥體積1.5 ml。于灌胃0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00、48.00 h后分別從眼球靜脈叢中取血0.3 ml，分離血漿，采用高效液相色譜法分析兩組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)[藥物半衰期（t1/2）、藥峰時(shí)間（Tmax）、藥峰濃度（Cmax）、濃度-時(shí)間曲線下面積（area under the curve，AUC）（AUClast、AUCall）、平均滯留時(shí)間（mean residence time，MRT）（MRTlast、MRTall）]，數(shù)據(jù)采用winNonlin（6.1）軟件進(jìn)行處理，并繪制濃度-時(shí)間曲線。

1.4.3 模型構(gòu)建及給藥 選取60 只大鼠，從中隨機(jī)選取15 只作為假手術(shù)組，其余構(gòu)建缺血再灌注損傷大鼠模型，造模成功后按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組、AA 組、AA-LPNs 組，每組15 只。參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行動(dòng)物模型建立：實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行大鼠麻醉，隨后以仰臥位進(jìn)行固定，開(kāi)胸暴露出心臟，用無(wú)創(chuàng)縫合絲線穿過(guò)左心耳廓下方2 mm 處進(jìn)行縫合結(jié)扎，30 min 后結(jié)扎下方的心肌呈現(xiàn)灰白色，心電圖出現(xiàn)S-T 段抬高后釋放縫合絲線，心臟再灌注2 h，構(gòu)建大鼠缺血再灌注損傷模型。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為缺血再灌注后，心肌舒縮功能出現(xiàn)障礙，形態(tài)上出現(xiàn)心肌梗死?？p合消毒后放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不進(jìn)行結(jié)扎外其余操作與模型組完全相同。造模24 h 后，AA 組和AA-LPNs 組以40 mg/kg 劑量灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液，給藥1 次/d，連續(xù)給藥4 周。

1.4.4 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集四組動(dòng)脈血，分離上層血清，通過(guò)全自動(dòng)血生化分析儀對(duì)血清中CK、LDH、SOD、MDA 進(jìn)行檢測(cè)，然后每組選取5 只大鼠處死并快速剖取心臟組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，用于TUNEL 檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA-LPNs 表征

制備的AA-LPNs 呈類(lèi)球形，均一圓整，平均動(dòng)態(tài)直徑為（180±23）nm。見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪甲苷脂質(zhì)聚合物納米粒表征

2.2 常規(guī)組和研究組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

常規(guī)組和研究組濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。研究組的t1/2、Tmax、AUClast、AUCall、MRTall均高于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 常規(guī)組和研究組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（）

表1 常規(guī)組和研究組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（）

注 AUC：曲線下面積；MRT：平均滯留時(shí)間

圖2 常規(guī)組和研究組濃度-時(shí)間曲線（n=8）

2.3 假手術(shù)組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組血生化指標(biāo)比較

模型組血清CK、LDH、MDA 含量均高于假手術(shù)組，SOD 含量低于假手術(shù)組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。AA 組 和AA-LPNs 組血清CK、LDH、MDA 含量均低于模型組，SOD 含量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。AA-LPNs 組血清CK、LDH、MDA 含量均低于AA 組，SOD 含量高于AA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 假手術(shù)組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組血生化指標(biāo)比較（）

表2 假手術(shù)組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組血生化指標(biāo)比較（）

注 與假手術(shù)組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與AA 組比較，cP ＜0.05，ccP ＜0.01。AA：黃芪甲苷；AA-LPNs：黃芪甲苷脂質(zhì)聚合物納米粒；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

2.4 假手術(shù)組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組心肌細(xì)胞凋亡比較

假手術(shù)組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組中均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，見(jiàn)圖3。模型組的細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。AA 組和AA-LPNs 組的細(xì)胞凋亡率均低于模型組，且AA-LPNs組低于AA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖3 四組心肌細(xì)胞凋亡（200×）

圖4 四組心肌細(xì)胞凋亡率比較（n=5）

3 討論

難溶性藥物的低生物利用度對(duì)藥物的臨床應(yīng)用產(chǎn)生不利影響。近年來(lái)，AA 已應(yīng)用于各種新型藥物遞送系統(tǒng)，例如納米乳[10]、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體[11]和自微乳[12]。上述新型藥物載體可在一定程度上提高AA 的溶解度和生物利用度，但仍然存在一定問(wèn)題，如藥物易泄露、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短等。本研究構(gòu)建的AA-LPNs作為新的藥物遞送系統(tǒng)，旨在提高AA 的生物利用度，增強(qiáng)其對(duì)于缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。藥物被LPNs 包載后可提高小腸上皮細(xì)胞的攝取[13]，一方面是由于增大了AA 的溶解度，另一方面表面修飾增強(qiáng)了其在胃腸道的黏液層擴(kuò)散，實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)緩慢釋放[14]。

LPNs 具有核-殼結(jié)構(gòu)，核通常由可生物降解的材料如PLGA[13]和聚乳酸[15]形成，而殼通常由脂質(zhì)材料如磷脂酰膽堿和甲氧基（聚乙二醇）-二硬脂?；姿嵋掖及穂16]組成。PLGA 對(duì)疏水性藥物具有很高的包載能力，可以控制藥物的釋放速率[17]。磷脂層的殼在生理功能上類(lèi)似于細(xì)胞膜的表面，其可以增加納米顆粒的生物相容性，同時(shí)減緩藥物的泄漏[18]。LPNs 的雙層結(jié)構(gòu)不僅可以包載單一藥物，而且可以實(shí)現(xiàn)不同性質(zhì)藥物的共遞送[19]。此外，納米粒子的表面還可以被官能團(tuán)修飾[20-21]，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞吸收并增強(qiáng)藥效。

基于上述理論，本研究制備的AA-LPNs 不僅可以提高AA 的溶解度，還可以提高其生物利用度，且對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。缺血再灌注損傷重要的病理機(jī)制之一是氧化應(yīng)激[22-23]，血清中CK 和LDH 含量降低，會(huì)造成體內(nèi)的氧化和抗氧化的平衡被打破，導(dǎo)致心肌功能損傷及細(xì)胞死亡。氧化應(yīng)激過(guò)程中，有大量MDA 產(chǎn)生，抗氧化物酶SOD 被消耗[24]。因此，SOD 活性可間接反映心臟損傷程度[25-26]。綜上所述，AA-LPNs對(duì)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)大鼠的心肌細(xì)胞具有保作用，其機(jī)制可能為AA-LPNs 提高大鼠SOD 含量，降低MDA含量，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。因此，AA-LPNs 作為抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡是一種很有前途的納米遞送系統(tǒng)。