楊 莎，蔡仁蓮,，陳緒美，趙 帥，田 瑩，郭建軍*

(1.貴州大學 昆蟲研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.遵義醫(yī)科大學 組織學與胚胎學教研室，貴州 遵義 563000)

肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，對人類的健康構(gòu)成了嚴重的威脅。統(tǒng)計顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例與死亡病例分別為905 677與830 180例，且死亡率超過胃癌，從2018年的第三順位提升至2020年的第二順位；在中國，肝癌的形勢則更加嚴峻，2020年發(fā)病率與死亡率接近世界平均水平的兩倍。目前肝癌的西醫(yī)療法主要有手術(shù)切除、動脈介入、放射療法等，但面臨復發(fā)與轉(zhuǎn)移的風險，并伴隨著一系列副作用；傳統(tǒng)中醫(yī)具有防癌變、抑惡化、促修復等作用，常成為癌癥治療的有效補充。

九香蟲(Dallas,1851)隸屬于昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae，為民間常見蟲類中藥，具有理氣止痛、溫中助陽的功效。隨著現(xiàn)代藥理學的發(fā)展，九香蟲抗癌、抗菌、抗凝血等功能逐漸得以研究。研究表明，九香蟲具有抗乳腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等作用。在傳統(tǒng)中藥復方中，九香蟲常與其他藥物配伍使用，且水煎液為常用的給藥方式，但對其水煎液單獨作用于癌癥的研究較少，僅見田瑩等對乳腺癌的研究報道，對九香蟲水煎液作用于肝癌的研究更是鮮有報道。本研究通過體外細胞試驗，研究了九香蟲水煎液對肝癌細胞HepG2體外生長作用的影響，以期為九香蟲水煎液在肝癌的臨床應用上奠定理論基礎，進一步為九香蟲藥用價值的深層次開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

生物材料

人肝癌HepG2細胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司；九香蟲成蟲采集于貴州凱里市黃平縣重安鎮(zhèn)(E 107.80°，N 26.52°)。

試驗試劑

含1%青霉素、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基(武漢博士德生物工程有限公司)、胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、二甲基亞砜(DMSO，美國Amresco公司)、Hoechst 33258染料(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、細胞自噬染色檢測試劑盒-MDC法(北京索萊寶科技有限公司)。

試驗儀器

0.22 μm針管式過濾器(美國Millipore公司)、超低溫冰箱(浙江捷盛制冷科技有限公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)、生物安全柜(西班牙Telstar公司)、離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)、倒置相差顯微鏡(廈門麥克奧迪公司)、酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 試驗方法

九香蟲水煎液的制備

-80 ℃冰箱取出九香蟲成蟲，純水沖洗兩遍，烘干研磨成粉，取50 g蟲粉加入100 mL純水，浸泡30 min后于砂鍋中煎煮60 min，小火濃縮至1 g/mL的九香蟲水煎液。所得液體先后經(jīng)紗布與濾紙過濾，6000×g、10 min離心2次，吸取上清于生物安全柜經(jīng)0.22 μm濾頭過濾除菌，用1.5 mL無菌離心管分裝并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HepG2細胞的培養(yǎng)

用含10%胎牛血清與1%青霉素、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細胞。

形態(tài)學觀察及MTT法檢測九香蟲水煎液對肝癌HepG2細胞的影響

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，胰酶消化處理，接種于96孔培養(yǎng)板(1×10個/孔)。設置空白組(未接種細胞)、對照組(未加藥物)以及試驗組(10、20、30、40 mg/mL)共6個處理，每個處理設置5個復孔。待細胞鋪滿至孔底總面積的80%～90%后，棄掉培養(yǎng)液，空白組與對照組每孔加入100 μL MEM培養(yǎng)基，試驗組分別加入不同九香蟲水煎液濃度的培養(yǎng)液100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)并拍照記錄。拍照后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10% MTT(5 g/L)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上10 min，待藍紫色結(jié)晶完全溶解后用酶標儀檢測其在570 nm波長下的吸光值。試驗重復3次。細胞活力(%)=(試驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

九香蟲水煎液對肝癌HepG2細胞自噬作用的影響

采用MDC法檢測九香蟲水煎液對HepG2細胞自噬的影響。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，消化細胞接種于24孔板(2×10個/孔)，培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔按1.2.3加入相同濃度含九香蟲水煎液的培養(yǎng)液500 μL，每個處理設置4個復孔。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入300 μL 1×Wash buffer洗1次，加入10 μL MDC染液，37 ℃避光染色30 min，每孔加入300 μL 1×Wash buffer洗1次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。試驗重復3次。

九香蟲水煎液對肝癌HepG2細胞凋亡作用的影響

采用Hoechst 33258染色法檢測九香蟲水煎液對HepG2細胞凋亡的影響。待細胞生長至對數(shù)期后，細胞處理同1.2.4。加藥培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入300 μL甲醇固定30 min，棄甲醇，加入100 μL Hoechst 33258染液37 ℃避光染色15 min，PBS洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。試驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，結(jié)果以Mean±SEM表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以<005為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學觀察及MTT法檢測九香蟲水煎液對肝癌HepG2細胞的影響

不同濃度九香蟲水煎液作用于HepG2細胞24 h后，對照組的細胞飽滿圓潤，輪廓清晰，貼壁性良好且細胞分布致密，無細胞碎片產(chǎn)生(圖1-a)，而試驗組(圖1-b～e)則出現(xiàn)不同程度細胞皺縮，細胞碎片，細胞漂浮以及分布稀疏的現(xiàn)象，且隨著濃度的增加，細胞皺縮、漂浮與細胞碎片數(shù)量增多，當濃度為40 mg/mL時幾乎無貼壁細胞(圖1-e)。

MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，九香蟲水煎液對肝癌HepG2細胞增殖具有顯著抑制作用。隨著九香蟲水煎液濃度的增加，細胞活力逐漸降低(<001)，表明九香蟲水煎液具有顯著抑制HepG2細胞增殖的作用，且呈濃度依賴性(圖2)。九香蟲水煎液作用于肝癌HepG2細胞24 h的半抑制濃度(IC)為26.23 mg/mL。

注：a-e分別為0、10、20、30、40 mg/mL，下同。圖1 九香蟲水煎液作用24 h對HepG2細胞形態(tài)的影響(100x)Fig.1 Effect of A.chinensis decoction on the morphology of HepG2 cells for 24 h (100x)

注：“*”表示P<0.05；“***”表示P<0.001。圖2 九香蟲水煎液作用24 h對HepG2細胞增殖的影響Fig.2 Effect of A.chinensis decoction on the proliferation of HepG2 cells for 24 h

2.2 九香蟲水煎液對肝癌HepG2細胞自噬作用的影響

MDC染色結(jié)果顯示，對照組細胞呈現(xiàn)均勻的黃綠色熒光，試驗組則熒光強度增加，染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂呈大小不一的點狀，被染成致密的藍綠色顆粒(圖3)。隨著九香蟲水煎液濃度的增加，細胞數(shù)量減少，細胞核碎片增加，表明九香蟲水煎液促進HepG2細胞自噬體形成。

圖3 MDC法檢測九香蟲水煎液對HepG2細胞自噬的影響(200 x)Fig.3 Effect of A.chinensis decoction on the autophagy of HepG2 cells for 24 h detected by MDC method (200 x)

2.3 九香蟲水煎液對肝癌HepG2細胞凋亡作用的影響

Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，對照組呈彌散均勻熒光(圖4-a)，低濃度九香蟲水煎液(圖4-b、c)作用下細胞出現(xiàn)少量致密濃染，細胞形態(tài)相對完整；高濃度九香蟲水煎液(圖4-d、e)作用下細胞出現(xiàn)明顯裂解，可見濃染致密的塊狀熒光。較對照組，試驗組細胞染色質(zhì)出現(xiàn)皺縮，細胞核染色增強，且隨著濃度增加，細胞出現(xiàn)破碎。綜上所述，九香蟲水煎液能顯著促進肝癌HepG2細胞的凋亡。s

圖4 Hoechst 33258染色法檢測九香蟲水煎液對HepG2細胞凋亡的影響(100x)Fig.4 Effect of A.chinensis decoction on the apoptosis of HepG2 cells for 24 h detected by Hoechst 33258 staining method (100x)

3 結(jié)論與討論

近年來，中醫(yī)藥在腫瘤的研究與運用逐漸受到重視。藥用昆蟲是指其蟲體或產(chǎn)物具有治療疾病的昆蟲，是癌癥治療藥物重要的組成部分。研究表明，斑蝥素、蜣螂毒素、蟑螂油等具有良好的抗癌活性；此外，蜜蜂、螞蟻、胡蜂等膜翅目及部分蝶類昆蟲體內(nèi)也具有一定的抗癌活性物質(zhì)。

九香蟲作為一種傳統(tǒng)藥食兩用昆蟲，其傳統(tǒng)中藥復方多有用于抗癌，如九香巖痛寧(九香蟲、鼠婦、元胡等)、癌痛克(金蝎、九香蟲、土元等)、復方香龍散(九香蟲、半夏、天龍等)，等。隨著研究的不斷深入，針對其單獨抗癌作用也開展了諸多研究：如九香蟲含藥血清可誘導結(jié)腸癌細胞凋亡與凋亡相關(guān)因子的表達；九香蟲血淋巴可顯著抑制乳腺癌細胞體外增殖；九香蟲三氯甲烷浸出物、水提液、乙醇粗提物等可通過阻滯細胞周期達到抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞的增殖作用；并進一步從其體內(nèi)純化獲得可顯著抑制乳腺癌細胞的生長并誘導其凋亡的CHP蛋白。本研究則進一步明確了其對肝癌的抑制作用，也是九香蟲單藥水煎液模式對肝癌抑制作用的首次探索。本研究可為九香蟲這一優(yōu)良中藥的深入系統(tǒng)應用提供參考。

其次，在已獲得的九香蟲多種組分中，水煎液的制作方式更加簡單、快速。因而本文探討了九香蟲水煎液對肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡與自噬作用的影響。研究發(fā)現(xiàn)九香蟲水煎液對肝癌細胞形態(tài)、細胞活力以及對細胞凋亡與自噬作用的影響與藥物濃度呈顯著正相關(guān)，說明九香蟲水煎液具有顯著抑制肝癌細胞體外生長的作用，且其肝癌HepG2細胞的IC為26.23 mg/mL。而田瑩等發(fā)現(xiàn)，九香蟲單藥水煎液對乳腺癌MDA-MB-453、4T1細胞的IC分別為34 mg/mL、101 mg/mL，初步表明九香蟲水煎液相較于乳腺癌MDA-MB-453、4T1細胞更有效果。另外，侯曉暉等利用九香蟲乙醇粗提物對HepG2細胞的IC為582 μg/mL，相較于水煎液，其抗癌功效似乎更高，這可能與昆蟲體內(nèi)物質(zhì)更多是醇溶性有關(guān)，乙醇可以更有效地萃取出九香蟲體內(nèi)的抗癌活性物質(zhì)，其具體原因有待進一步研究。

此外，作為一種湯劑，水煎液具有易吸收、見效快以及隨癥加減的特點，在臨床上具有良好的應用潛能，但水煎液中可溶解的藥物成分多種多樣，確切的藥用成分及其對肝癌細胞抑制的具體分子機制仍不明確，也有待進一步研究。