賀詩琪，范付華，吳宇航，龍 蓉，王君榮，陳美吉

(1.貴州大學(xué) 貴州省森林資源與環(huán)境研究中心/貴州省高原山地林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 林學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是一種可移動(dòng)的遺傳元件，可以引起物種特異性狀變異，在植物基因組中廣泛存在，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的激活對(duì)植物基因組的不斷進(jìn)化有顯著影響，是物種遺傳多樣性的一個(gè)重要因素。與DNA“剪切—粘貼”式的轉(zhuǎn)座機(jī)制不同，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以自身轉(zhuǎn)錄而成的RNA為中間體，通過編碼的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成DNA后插入基因組新位點(diǎn)，原位置成分并不會(huì)被切除，因此能夠在基因組中不斷的自我復(fù)制增加拷貝數(shù)從而影響基因的活性以及基因組的結(jié)構(gòu)。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物發(fā)育過程中通常是轉(zhuǎn)錄沉默的，在外界環(huán)境因素和內(nèi)在生物因子的刺激下能夠激發(fā)其轉(zhuǎn)座功能，引起基因組結(jié)構(gòu)變化甚至相應(yīng)基因功能的變異。

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分為LTR(long terminal repeats)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩大類。其中，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩類成員Ty1-與Ty3-在水稻、梨、桂花、蘋果、梨、枇杷等植物中均有報(bào)道。冬青衛(wèi)矛()種質(zhì)資源豐富、隨處可見，不僅具有經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和觀賞效益，更具有一定藥用價(jià)值。目前，鮮見有關(guān)冬青衛(wèi)矛LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子研究的報(bào)道。植物L(fēng)TR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可以采用同源序列克隆法獲得大量Ty1-類與Ty3-類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)序列，因其多拷貝、高多態(tài)性等特點(diǎn)具有非常高的研究價(jià)值，為植物遺傳進(jìn)化提供了素材；RT序列的測定，不僅可以對(duì)植物轉(zhuǎn)座子的多態(tài)性進(jìn)行監(jiān)測分析，還可以此設(shè)計(jì)分子標(biāo)記對(duì)植物種質(zhì)資源親緣關(guān)系等進(jìn)行分析。

本文利用LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列保守區(qū)簡并引物克隆并分析冬青衛(wèi)矛RT序列特點(diǎn)，揭示LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列在冬青衛(wèi)矛基因組中的異質(zhì)性，為植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因組進(jìn)化關(guān)系中的研究提供依據(jù)，也為冬青衛(wèi)矛分子標(biāo)記的開發(fā)種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性評(píng)價(jià)等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DNA的提取與檢測

以采集的貴州冬青衛(wèi)矛葉片為材料，利用DNA提取試劑盒(DNAsecure Plant Kit(DP320-03)，北京天根生化科技有限公司)提取冬青衛(wèi)矛基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠(1%)電泳和超微量核酸蛋白測定儀(德國Implen，N60 Touch)檢測其質(zhì)量、濃度，并用緩沖液(TE)稀釋提取的DNA直至濃度約為20 ng/μL，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列的PCR擴(kuò)增

冬青衛(wèi)矛RT序列引物參照前人的設(shè)計(jì)，與本課題組克隆枇杷RT序列的引物和反應(yīng)條件一致。Ty1-類RT上游引物為5’-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3’，下游引物為5’-ARCATRTCRTCNACRTA-3’；Ty3-類RT上游引物為5’-AGMGRTATGTGYGTSGAYTAT-3’，下游引物為5’-CAMCCMRAAMWCACAMTT-3’；其中N表示A/G/C/T堿基，M表示A/C，R表示G/T，Y表示C/T，S表示C/G，W表示A/T堿基。PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)5 μL，模板DNA和引物各0.5 μL。PCR程序參照課題組羅昌斌等的研究。取3 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad，ChemiDoc XRS+)觀察并拍照保存。

1.3 PCR產(chǎn)物的回收、轉(zhuǎn)化及測序

使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit,DP209-02)回收純化PCR產(chǎn)物，且通過超微量核酸蛋白測定儀檢測其質(zhì)量和濃度。使用TaKaRa pMD19-T Vector Cloning Kit試劑盒和DH5α Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞將PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。取已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞在37 ℃無菌環(huán)境中倒置培養(yǎng)12～16 h，通過PCR擴(kuò)增篩選陽性克隆，搖菌過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后測序。

1.4 RT序列生物信息學(xué)分析

過濾出RT序列測序結(jié)果中的質(zhì)?；蚪M序列后，將所獲得的Ty1-與Ty3-類RT序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢、對(duì)比，Bioedit翻譯為氨基酸序列且構(gòu)建序列相似矩陣以除去完全重復(fù)序列。采用ClustalX軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)，MEGA7軟件構(gòu)建LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬青衛(wèi)矛RT序列特征

采用PCR擴(kuò)增，將特征片段回收、測序，再去除重復(fù)和短序列后，獲得冬青衛(wèi)矛LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1-類RT(EJT1)序列40條，Ty3-類RT(EJT3)序列39條，此次得到的序列與其他植物RT序列長度大致一樣。序列長度、A/G比例及登錄號(hào)見表1。

表1 冬青衛(wèi)矛Ty1-copia與Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列信息Tab.1 The information of RT sequences of LTR retrotransposon in E. japonicus

2.2 Ty1-copia類RT序列分析

本研究得到40條Ty1-類RT序列，長度范圍為231～267 bp，其中AT所占的比例為48.85%～65.27%。核酸序列的相似性為8.05%～97.7%，平均相似性為40.2%，其中序列EJT1-5、EJT1-30與EJT1-2的相似性最高，為97.7%；序列EJT1-4與EJT 1-7的相似性最低，為8.05%。這表明冬青衛(wèi)矛Ty1-類RT堿基序列差異較大，具有較高的異質(zhì)性。利用MEGA7軟件的最大似然法將克隆所得到的冬青衛(wèi)矛Ty1-類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，可將40條序列分為5類(圖1)。其中第Ⅰ類有27條序列，第Ⅱ類有6條序列，第Ⅲ類僅有1條序列為EJT1-22，第Ⅳ類包含4條序列，第Ⅴ類有2條序列為EJT1-34和EJT1-45。第Ⅰ類所包含的序列條數(shù)最多且分散，而第Ⅲ類序列EJT1-22相較于其他類別中的序列的遺傳距離較大。

注：樹枝長度表示估算得到的遺傳距離，樹的分支處數(shù)值表示1000次重復(fù)的自展值(下同)。圖1 冬青衛(wèi)矛Ty1-copia-RT核酸序列進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of RT nucleotide sequences of Ty1-copia retrotransposons in E. japonicus

將所獲得的 RT序列分別翻譯為氨基酸序列，可以發(fā)現(xiàn)沒有終止密碼子突變。參照Ty1-類RT氨基酸的保守序列，發(fā)現(xiàn)多處移碼突變。例如EJT1-37的50位氨基酸處；EJT1-19的5位氨基酸處；EJT1-3、EJT1-6、EJT1-12、EJT1-14等8條氨基酸序列的19位氨基酸處；EJT1-30、EJT1-31的24位氨基酸處等(圖2)。

圖2 冬青衛(wèi)矛Ty1-copia-RT氨基酸(aa)序列多重比對(duì)分析Fig.2 The amino sequence alignment of RT of Ty1-copia retrotransposons in E. japonicus

從NCBI中下載已登錄的來源于蘋果(ABD76 543，)、棗(JQ003714，)、鐵皮石斛(KJ147111，)、辣椒(JQ026381，)、李(AGX455 20，)、梨(JN639033，)、小麥(BAA02264，)等12條其他植物的Ty1-類反轉(zhuǎn)錄氨基酸序列，將它們與本文所得的冬青衛(wèi)矛Ty1-類RT氨基酸序列進(jìn)行多序列比較，構(gòu)建相應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹，可將所有序列分為4類(圖3)。其中第Ⅰ類包含18條冬青衛(wèi)矛Ty1-類RT序列，占所測序列的近一半，同時(shí)還有10條其他植物RT氨基酸序列在內(nèi)，蘋果、李、辣椒等三條序列比起其他序列與此次目標(biāo)序列的遺傳距離近，也說明他們的親緣關(guān)系較近；第Ⅱ類有3條序列分別為EJT1-37、EJT1-38和EJT1-14，還包含有棗序列JQ003714，三者在進(jìn)化關(guān)系中比較接近，聚為一類；第Ⅲ類僅有1條序列為EJT1-6；第Ⅳ類包含18條序列且沒有其他植物的氨基酸序列聚在一起，這18條序列之間具有較高的相似性，與其他植物的差異明顯。

圖3 其他植物與冬青衛(wèi)矛Ty1-copia-RT氨基酸(aa)序列進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of RT aa sequences of Ty1-copia between other plants and E. japonicus

2.3 Ty3-gypsy類RT序列分析

從冬青衛(wèi)矛DNA中克隆得到39條Ty3-類RT序列，長度范圍為365～499 bp，這些序列中AT所占比例為46.29%～63.47%，核酸序列的相似性為10.04%～99.31%。其中序列EJT3-14與EJT3-17、EJT3-20與 EJT3-30的相似性最高，為99.31%，序列EJT3-3與 EJT3-27的相似性最低，為10.04%。將39條Ty3-類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，總共可以分為5類(圖4)。其中第Ⅰ類有25條序列，第Ⅱ類包含2條序列，第Ⅲ類僅有1條序列為EJT3-38，第IV類含有9條序列，第V類也僅有2條序列為EJT3-11和EJT3-46。

圖4 冬青衛(wèi)矛Ty3-gypsy-RT核酸序列進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of RT nucleotide sequences of Ty3-gypsy retrotransposons in E. japonicus

將所得39條RT序列翻譯為氨基酸。參照Ty3-類RT氨基酸的保守序列，可以發(fā)現(xiàn)所得的冬青衛(wèi)矛Ty3-類RT氨基酸序列有移碼突變的情況。例如EJT3-24的8位氨基酸處，EJT3-25的49位氨基酸處，EJT3-6、EJT3-32、EJT3-35等6條的90位氨基酸處，EJT3-40的116位氨基酸處等(圖5)。

圖5 冬青衛(wèi)矛Ty3-gypsy-RT氨基酸(aa)序列多重比對(duì)分析Fig.5 The amino sequence alignment of RT of Ty3-gypsy retrotransposons in E. japonicus

通過NCBI下載已登錄的鋸齒列當(dāng)(ABD43 099，)、梅(ACU42192，)、草莓(EF443064，)、銀杏(AJ228325，)、李(AGX45505，)、馬尾松(AGD93162，)、火龍果(KU977005，)、桂花(KY401399，)等其他植物Ty3-類RT氨基酸序列，與本文獲得相關(guān)序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可將所有序列分為4類(圖6)。其中第Ⅰ類包含10條冬青衛(wèi)矛Ty3類RT序列，還包含馬尾松AGD93162、鋸齒列當(dāng)ABD43099、桂花KY401399、銀杏AJ228325和梅ACU42192等RT氨基酸序列在內(nèi)；第Ⅱ類僅有1條序列為EJT3-32；第Ⅲ類有9條序列，且無其他植物分入此類，這9條序列相似性高；第Ⅳ類包含17條序列具有較高的相似性，其同源性較高，此類還有其他植物草莓、火龍果。由上述結(jié)果可知，冬青衛(wèi)矛反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子除了物種內(nèi)的縱向傳遞外，還可能在不同物種間進(jìn)行橫向傳遞。

圖6 其他植物與冬青衛(wèi)矛Ty3-gypsy-RT氨基酸(aa)序列進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic tree of RT aa sequences of Ty3-gypsy retrotransposons between other plants and E. japonicus

3 結(jié)論與討論

植物體內(nèi)存在大量且類型多樣的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。這種可以移動(dòng)的DNA元件先通過RNA聚合酶合成一條RNA，再經(jīng)其自身編碼的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在整合酶的作用下插入到基因組其他位置，進(jìn)而改變了目標(biāo)物種的基因組結(jié)構(gòu)，對(duì)進(jìn)化發(fā)揮了巨大作用。前人研究表明，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子廣泛分布于植物基因組中，且占有極大的比例，其編碼區(qū)多存在堿基缺失、重復(fù)、替換等各種突變，從而導(dǎo)致物種內(nèi)基因組序列具有較大差異。本研究所獲得的冬青衛(wèi)矛Ty1-與Ty3-類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列多重比對(duì)結(jié)果顯示，各類型RT序列相似度普遍偏低，序列平均相似性均為40%左右。其中Ty1-類RT序列EJT1-4與EJT1-7的相似性為8.05%；Ty3-類RT序列EJT3-3與 EJT3-27的相似性為10.04%。產(chǎn)生序列異質(zhì)性的原因可能是由于轉(zhuǎn)座子序列中堿基本身在插入新位置時(shí)的缺失或移碼突變，使得冬青衛(wèi)矛LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT堿基順序存在一定程度的差異。除此以外，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能編碼反轉(zhuǎn)錄酶與整合酶，其轉(zhuǎn)座機(jī)制與反轉(zhuǎn)錄病毒(遺傳信息儲(chǔ)存在RNA上)復(fù)制和傳播機(jī)制相似，與DNA復(fù)制不同的是RNA可能缺乏核糖核酸復(fù)制酶與轉(zhuǎn)錄酶的校對(duì)修復(fù)，使其復(fù)制與反轉(zhuǎn)錄過程中具有較高的突變率。

本研究獲得冬青衛(wèi)矛Ty1-類和Ty3-類RT序列分別為40條和39條，將其與部分其他物種同種類型反轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。通過進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，Ty1-類RT序列分類中的第Ⅰ類里蘋果、李、梨、辣椒等植物與冬青衛(wèi)矛目標(biāo)序列的遺傳距離很近，具有較近的親緣關(guān)系，其中蘋果AAX56349與EJT1-17、EJT1-18距離最近，可能同源；Ty3-類RT序列分類中馬尾松AGD93162與EJT3-31可能同源，桂花KY401399等與EJT3-9、EJT3-28、EJT3-37等序列具有較近的遺傳距離，可能同源。以上結(jié)果表明不同類型的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子都可能在不同的物種間進(jìn)行橫向傳遞，才導(dǎo)致他們具有同一起源的關(guān)系。