白曉珊　仝偉　王建毅　卜兆君　劉文靜　夏尤普·玉蘇甫　徐雪瑩

摘要：? 適量的煙氣能夠促進(jìn)有性繁殖體萌發(fā)，但迄今尚無(wú)輔助煙氣處理探究孢子生活力快速檢測(cè)方法的研究報(bào)道。該文選擇毛緣泥炭蘚（Sphagnum fimbriatum）、中位泥炭蘚（S. magellanicum）和粗葉泥炭蘚（S. squarrosum）作為材料，分別使用亞甲基藍(lán)染色法、四唑（TTC）染色法、碘-碘化鉀（I-KI）染色法和紅墨水染色法對(duì)泥炭蘚孢子進(jìn)行染色，并比照營(yíng)養(yǎng)液、煙溶液+營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的孢子萌發(fā)試驗(yàn)，對(duì)比研究泥炭地苔蘚植物孢子生活力快速檢測(cè)的最佳方法。結(jié)果表明：亞甲基藍(lán)染色法的染色效果最為明顯，TTC和I-KI均未能使泥炭蘚孢子著色，孢子對(duì)紅墨水雖有著色反應(yīng)但不清晰;與營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)相比，添加煙溶液使毛緣泥炭蘚、中位泥炭蘚和粗葉泥炭蘚孢子萌發(fā)率分別提高5%、5%和18%;使用亞甲基藍(lán)染色的孢子染色率與經(jīng)煙溶液處理過(guò)的孢子萌發(fā)率最為接近。綜上認(rèn)為，亞甲基藍(lán)染色法能快速檢測(cè)泥炭蘚孢子的生活力。

關(guān)鍵詞： 泥炭蘚孢子， 萌發(fā)率， 煙氣， 生活力，快速檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：? Q945.34文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2022）04-0676-06

Rapid viability detection of peatland bryophyte spores

BAI Xiaoshan TONG Wei WANG Jianyi BU Zhaojun LIU Wenjing Shuayib YUSUP XU Xueying

（ 1. Key Laboratory of Geographical Processes and Ecological Security in Changbai Mountains， Ministry of Education， School of Geographical

Sciences， Northeast Normal University， Changchun 130024， China; 2. State Environmental Protection Key Laboratory of Wetland Ecology and

Vegetation Restoration， Institute for Peat and Mire Research， Northeast Normal University， Changchun 130024， China; 3. Jilin Provincial

Key Laboratory for Wetland Ecological Processes and Environmental Change in Changbai Mountains， Changchun 130024， China;

4. Jilin Hani National Nature Reserve Administration， Tonghua 134100， Jilin， China ）

Abstract：? Appropriate amount of smoke can promote germination of sexual propagules. However， rapid detection of spore viability combined with smoke treatment has not been reported up to now. In this paper， Sphagnum fimbriatum， S. magellanicum and S. squarrosum were selected as study species. Methylene blue， TTC， I-KI and red ink were used to dye spores， and nutrient solution and smoke + nutrient solution were used to culture spores， to test which is optimal method for rapid detection of peatland bryophyte spore viability. Of the four methods， methylene blue showed the most obvious dyeing effect while TTC and I-KI did not dye the Sphagnum spores and the spores had no clear and sharp reaction to red ink. Compared with those cultured with nutrient solution only， spores cultured with smoke + nutrient solution increased their germination by 5%， 5% and 18% in S. fimbriatum， S. magellanicum and S. squarrosum， respectively. The frequency of Sphagnum spores dyed with methylene blue was the closest to that of spores germinated after smoke solution treatment. The results indicate that methylene blue dyeing is an ideal method to quickly detect viability of Sphagnum spores.

Key words： Sphagnum spores， germination percentage， smoke， viability， rapid detection

植物種質(zhì)資源保存，特別是植物有性繁殖體（種子和孢子）的保存是各種遷地保護(hù)措施中最為經(jīng)濟(jì)有效的方法，在減緩氣候變化對(duì)生物多樣性的影響中發(fā)揮了關(guān)鍵作用（Li et al.， 2011）。生活力維持是植物有性繁殖體保存的關(guān)鍵。國(guó)際上已有一些快速檢測(cè)植物有性繁殖體生活力的方法，主要包括物理特性檢測(cè)法（Zhao et al.， 2016）、生理檢測(cè)法（Manju & Kumar， 2015）、生物化學(xué)檢測(cè)法（胡晉等，2009; Magrini et al.， 2019）以及逆境檢測(cè)法（Komba et al.， 2006）等。在眾多生活力檢測(cè)方法中，染色測(cè)定法最為快速且簡(jiǎn)單。該方法利用有性繁殖體中的胚對(duì)染色劑的不同反應(yīng)，來(lái)判斷繁殖體有無(wú)生活力，應(yīng)用比較普遍的如四唑（TTC）染色法（Kaiser et al.， 2014; Ma et al.， 2019）、噻唑藍(lán)（MTT）染色法（李峰等，2016）、亞甲基藍(lán)染色法（Aniszewski et al.， 2012）、I-KI染色法（Du et al.， 2018）和紅墨水染色法（吳正軍等，2012;蘇蕓蕓等，2016）等。

傳統(tǒng)的種子生活力的檢測(cè)通常采用室內(nèi)萌發(fā)試驗(yàn)，以萌發(fā)率表征生活力。此方法操作要求高、耗時(shí)較長(zhǎng)，且休眠往往低估了種子的真實(shí)生活力。苔蘚植物中，孢子的生活力也常采用萌發(fā)率來(lái)衡量（Bu et al.， 2017）。李秋萍等（2013）曾采用6種非泥炭地苔蘚植物為受試物種，開(kāi)展生活力快速檢測(cè)研究，通過(guò)對(duì)比染色率和萌發(fā)率發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍(lán)染色法是測(cè)定蘚類(lèi)植物孢子生活力的有效方法。但目前，關(guān)于泥炭地苔蘚植物孢子生活力測(cè)定的研究很少。

由于適量的煙溶液浸泡能夠有效促進(jìn)苔蘚植物孢子的萌發(fā)，提高孢子萌發(fā)率（康媛等，2019），因此能夠更為準(zhǔn)確地通過(guò)萌發(fā)率來(lái)估測(cè)生活力。目前，關(guān)于結(jié)合煙氣處理探討快速檢測(cè)苔蘚植物孢子生活力方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選擇4種常用于種子生活力快速檢測(cè)的染色法，以3種泥炭蘚屬（Sphagnum）植物為試驗(yàn)材料，結(jié)合煙溶液浸泡孢子進(jìn)行解眠，嘗試尋找測(cè)定泥炭地苔蘚植物孢子生活力的簡(jiǎn)單、快捷的方法，為未來(lái)苔蘚孢子生態(tài)學(xué)研究提供基礎(chǔ)支撐。

1材料與方法

1.1 孢蒴材料采集

研究采用的受試物種為毛緣泥炭蘚（Sphagnum fimbriatum）、中位泥炭蘚（S. magellanicum）和粗葉泥炭蘚（S. squarrosum）。2018年7月，于小興安嶺東段南坡的湯北林場(chǎng)泥炭地（129°04′ E，48°25′ N）采集毛緣泥炭蘚和粗葉泥炭蘚的孢蒴;于長(zhǎng)白山西麓哈泥泥炭地（126°31′ E，42°13′ N）采集中位泥炭蘚孢蒴。孢蒴采回后，均放入冰箱4 ℃暗保存。

1.2 煙溶液制備

銹色泥炭蘚（S. fuscum）為哈泥泥炭地常見(jiàn)物種，易于采集，以該植物為材料制備煙溶液。將390 g銹色泥炭蘚置于不銹鋼爐中燃燒，產(chǎn)生的煙氣通過(guò)導(dǎo)管導(dǎo)入裝有350 mL蒸餾水的瓶中直到煙氣溶液飽和，作為煙儲(chǔ)備液，室溫密閉保存。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 孢子初始萌發(fā)率與生活力測(cè)定孢子懸液的制作參照康媛等（2019）的方法，3次重復(fù)。將接種孢子懸液的培養(yǎng)皿置于PRX-450C型人工氣候箱中。溫度周期、光照周期和光強(qiáng)周期依次設(shè)為27 ℃/22 ℃、16 h/8 h以及8 000 lx/0 lx，空氣相對(duì)濕度為60%（Bu et al.， 2017）。于培養(yǎng)的第21天（Feng et al.， 2017），顯微鏡下統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.3.2 不同染色方法的比較挑選發(fā)育成熟且保存完好的3種受試物種的孢蒴，分別置于12個(gè)燒杯中（4種檢測(cè)方法 × 3個(gè)物種），充分搗碎以備染色使用。

1.3.2.1 亞甲基藍(lán)染色法亞甲基藍(lán)染色劑的配制參照楊發(fā)君等（2010）的方法，濃度配置成0.1%。分別取2 mL染液依次滴入裝有3種泥炭蘚孢子的燒杯中，攪拌均勻，靜置染色2 h。染色結(jié)束后，利用5 cm × 5 cm的聚乙酰胺篩布將孢子從染液中過(guò)濾出，利用3 mL蒸餾水反復(fù)沖洗制成孢子懸液。取1 mL滴入制作好的培養(yǎng)皿中（3個(gè)重復(fù)）。顯微鏡下統(tǒng)計(jì)染色率。孢子若染成藍(lán)色，則計(jì)為有生活力，未染色的則計(jì)為無(wú)生活力。

1.3.2.2 TTC染色法TTC染液的配制方法參照張志良等（2003）的方法，濃度配制成0.5%，避光保存。染色過(guò)程與觀察方法同上。若染成紅色，則認(rèn)為其具有生活力，其他情況認(rèn)為孢子無(wú)生活力。

1.3.2.3 I-KI染色法參照胡晉等（2009）對(duì)種子生活力的測(cè)定原理和方法，染色過(guò)程及觀察方法同上。若孢子壁呈淡藍(lán)色，計(jì)為有生活力，否則計(jì)為無(wú)生活力。

1.3.2.4 紅墨水染色法紅墨水用蒸餾水20倍稀釋?zhuān)瞥?%的紅墨水染液（張志良和瞿偉菁，2003），染色時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為1 h，并進(jìn)行水浴處理，溫度設(shè)定為35 ℃。孢子若被染成紅色，則計(jì)為無(wú)生活力，否則計(jì)為有生活力。

1.3.3 煙溶液處理對(duì)染色結(jié)果的影響將制作好的孢子小包（參照1.3.1）置于煙溶液中，濃度設(shè)置同1.3.1，浸泡24 h。對(duì)照為未經(jīng)煙溶液浸泡處理直接染色的孢子。浸泡結(jié)束后，用蒸餾水沖洗小包外部，并將每種泥炭蘚的4個(gè)孢子小包分別用上述染液反復(fù)沖洗置于干凈燒杯中。重復(fù)1.3.2試驗(yàn)內(nèi)容，觀察孢子的染色率，并與1.3.2中的染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同染色法的染色率差異、煙溶液處理與未經(jīng)煙溶液處理的萌發(fā)率差異、經(jīng)煙溶液處理與未經(jīng)煙溶液處理的染色率差異以及染色率與加煙溶液或未加煙溶液培養(yǎng)的萌發(fā)率差異，均采用t檢驗(yàn)（α=0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1 不同染色方法的效果比較

使用4種不同的染色方法對(duì)3種泥炭蘚孢子進(jìn)行染色試驗(yàn)，以測(cè)定孢子的生活力，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TTC染色法和I-KI染色法對(duì)3種泥炭蘚孢子均無(wú)效果（圖1：b，c），即使延長(zhǎng)染色時(shí)間等處理也無(wú)法使孢子著色。紅墨水染色法雖然能夠使孢子著色，但需要進(jìn)行1 h、35 ℃的水浴處理（圖1：d），從而使試驗(yàn)增加了復(fù)雜性。然而，利用亞甲基藍(lán)染色法處理的孢子（圖1：a），染色效果十分明顯，且清晰度很高。

2.2 孢子萌發(fā)率的測(cè)定

培養(yǎng)21 d觀察發(fā)現(xiàn)，煙溶液的處理對(duì)3種泥炭蘚孢子的萌發(fā)率都存在顯著的正效應(yīng)（表2）。其中，煙溶液的處理使毛緣泥炭蘚和中位泥炭蘚孢子的萌發(fā)率提高均在5%以上，經(jīng)煙溶液處理過(guò)的孢子萌發(fā)率與對(duì)照相比具有顯著差異（P<0.05，表2）。由表2可知，煙溶液處理對(duì)于粗葉泥炭蘚孢子的促萌作用最明顯，且表現(xiàn)出極顯著的差異性（P<0.001）。

2.3 染色率與萌發(fā)率的比較

3種泥炭蘚孢子經(jīng)4種不同的染色方法處理后所得的染色率差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。由表2可知，亞甲基藍(lán)、I-KI和TTC染色法的染色率及紅墨水染色法的未染色率與3種泥炭蘚孢子的初始萌發(fā)率之間都存在著顯著差異。在染色效果較好的亞甲基藍(lán)染色法和紅墨水染色法中，利用紅墨水染色法所測(cè)定的3種泥炭蘚孢子未染色率與將其進(jìn)行煙溶液處理后所得到的萌發(fā)率依然存在顯著性差異（P<0.05）;而亞甲基藍(lán)染色率與煙溶液處理后的孢子萌發(fā)率之間無(wú)差異，且高度相關(guān)（R=0.990）。另外，使用亞甲基藍(lán)染色法所得染色率高于煙溶液浸泡處理后的孢子萌發(fā)率，更高于孢子的初始萌發(fā)率（表2）。

2.4 煙溶液處理對(duì)孢子染色的影響

在亞甲基藍(lán)染色法的應(yīng)用中，3個(gè)物種表現(xiàn)出一致的規(guī)律，即經(jīng)煙溶液處理后再染色所得的染色率顯著低于直接染色的染色率（P<0.05，圖2），且與萌發(fā)率之間存在顯著差異（P<0.05，表2和圖2）。在紅墨水法的應(yīng)用中，經(jīng)煙溶液處理后再染色所得的未染色率均高于直接紅墨水染色的未染色率;除毛緣泥炭蘚外，在有無(wú)煙溶液處理的不同情況下，同一物種的未染色率之間存在顯著差異（P<0.05，圖2）;與萌發(fā)率對(duì)比來(lái)看，中位泥炭蘚和粗葉泥炭蘚孢子經(jīng)煙溶液處理后的未染色率與其萌發(fā)率之間無(wú)差異（均P>0.05，表2和圖2）。

3討論與結(jié)論

4種染色方法中，亞甲基藍(lán)染色法和紅墨水染色法具較清晰的染色效果，但亞甲基藍(lán)染色法染色率與經(jīng)煙溶液處理后的萌發(fā)率最接近，且大于未經(jīng)煙溶液浸泡處理的孢子初始萌發(fā)率。由此反映出，煙溶液可促進(jìn)孢子萌發(fā)，而亞甲基藍(lán)染色率能指示煙溶液浸泡后的孢子萌發(fā)率。

在進(jìn)行TTC染色時(shí)，依據(jù)前人研究結(jié)果所選擇的染液濃度和浸泡時(shí)間對(duì)孢子染色并無(wú)效果（Mendes et al.， 2009; Kaiser et al.， 2014）。這與孢子壁阻礙TTC進(jìn)入、孢子脫氫酶含量過(guò)低或呼吸代謝不強(qiáng)有關(guān)。另外，Kaiser等（2014）對(duì)單花番櫻桃（Eugenia uniflora）種子進(jìn)行TTC染色時(shí)發(fā)現(xiàn)，附著在種子上的被膜起到物理屏障的作用，阻止了內(nèi)部組織與TTC溶液的直接接觸，且苔蘚植物孢子壁具有成層性（Brown et al.， 1982）。因此，在使用TTC染色時(shí)，需使用去角質(zhì)、破除屏障等方法使種皮具有滲透性（Magrini et al.， 2019），即需對(duì)孢子進(jìn)行預(yù)處理。

由于泥炭蘚孢子中的淀粉含量比較低， 利用I-KI并不能使泥炭蘚孢子染色。有研究表明，蘚類(lèi)植物孢子中的脂肪含量很高，明顯高于其他成分（Fang & Zhu， 2012）。利用紅墨水染色法的確可以使孢子著色，但將未染色率、煙溶液浸泡后的萌發(fā)率、孢子初始萌發(fā)率相比，三者都具有顯著差異。并且，利用紅墨水染色的孢子顏色深淺不一，存在較大誤差。

孢子的自身代謝老化、環(huán)境的溫度、水分、埋藏深度、氧、微生物、化感作用、pH和養(yǎng)分等都會(huì)對(duì)孢子的生活力造成影響（Feng et al.， 2018），使孢子的萌發(fā)率低于生活力。一定濃度的煙溶液處理可促進(jìn)泥炭蘚孢子的萌發(fā)（康媛等，2019），使煙溶液處理后的孢子萌發(fā)率更能表征孢子生活力。本試驗(yàn)中，亞甲基藍(lán)染色法的染色效果最明顯，染色快速，無(wú)需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的恒溫水浴等操作，且染色率與煙溶液處理后的萌發(fā)率無(wú)差異，表明該方法可以作為泥炭地苔蘚植物孢子生活力的快速檢測(cè)方法。

在本試驗(yàn)的3個(gè)物種中，除毛緣泥炭蘚外，由于經(jīng)煙溶液處理后再利用紅墨水進(jìn)行染色所得到的未染色率與孢子煙溶液處理后的萌發(fā)率無(wú)差異，因此煙溶液處理后的生活力測(cè)定可以利用此法進(jìn)行操作。另外，盡管清晰度略低，但測(cè)定孢子生活力仍可使用紅墨水染色法與亞甲基藍(lán)染色法相互佐證，避免單一測(cè)定出現(xiàn)的誤差，增加準(zhǔn)確度。

經(jīng)煙溶液處理后使用亞甲基藍(lán)染色所得染色率遠(yuǎn)低于直接染色的染色率。一方面，煙氣中的某些化學(xué)成分優(yōu)先與亞甲基藍(lán)發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致孢子無(wú)法顯色;另一方面，亞甲基藍(lán)是一種堿性的活體染色劑，能與核酸結(jié)合令細(xì)胞核呈藍(lán)色，而煙溶液的浸泡可能影響核酸物質(zhì)，使孢子無(wú)法染上色。因此，將此法用于泥炭地地層中經(jīng)歷過(guò)野火煙氣影響的孢子會(huì)低估其生活力。

致謝范貝貝同學(xué)在試驗(yàn)過(guò)程中給予了幫助，謹(jǐn)致謝意。

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（責(zé)任編輯蔣巧媛）