夏科　趙志國　吳巧芬　郭倫發(fā)　秦洪波　仇碩

摘要：? 為了建立南高叢藍莓‘奧尼爾’工廠化組培快繁技術(shù)體系，該文以帶腋芽的莖段為外植體，研究外植體滅菌、叢生芽誘導(dǎo)、叢生芽增殖培養(yǎng)、瓶內(nèi)生根以及移栽馴化。結(jié)果表明：（1）外植體最佳滅菌方法為10% NaClO處理15 min，污染率降低至14.44%，誘導(dǎo)率達49.38%;同樣添加1.5 mg·LZT，以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的叢生芽明顯多于MS。（2）叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為 WPM+ NAA 0.1 mg·L + ZT 1.5 mg·L ，接種 60 d 后增殖系數(shù)達8.6，長勢良好;瓶內(nèi)生根的最佳處理方式為先用500 mg·L IBA浸蘸20 s，然后接種于WPM+IBA 0.2 mg·L的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)90 d后，生根率、有效生根率、生根數(shù)量和根長分別達到96.3%、96.3%、12.7條和43.3 mm，且根系較發(fā)達、粗壯。（3）生根苗在移栽基質(zhì)Ⅰ（河沙∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1）的移栽成活率最高，達92.22%。以上說明，外植體經(jīng)10% NaClO處理15 min，利用培養(yǎng)基WPM+ ZT 1.5 mg·L和WPM+ NAA 0.1 mg·L + ZT 1.5 mg·L分別進行叢生芽誘導(dǎo)及增殖;叢生芽經(jīng)500 mg·L IBA浸蘸20 s，再接種于WPM+IBA 0.2 mg·L 進行生根，生根苗在河沙∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1的基質(zhì)移栽馴化，是南高叢藍莓‘奧尼爾’最適工廠化組培快繁技術(shù)體系。該研究結(jié)果為今后‘奧尼爾’工廠化種苗快繁奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 藍莓， 組培快繁， 叢生芽誘導(dǎo)， 瓶內(nèi)生根， 移栽馴化

中圖分類號：? Q946文獻標識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2022）04-0691-09

Tissue culture and rapid propagation in factory

of southern highbush blueberry ‘O’Neal’

XIA Ke， ZHAO Zhiguo， WU Qiaofen， GUO Lunfa， QIN Hongbo， QIU Shuo

（ Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization， Guangxi Institute of Botany， Guangxi

Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：? In order to establish a rapid propagation system of southern highbush blueberry? ‘O’ Neal’， the stem section with axillary bud were sterilized as explants， induction of shoot cluster， and proliferation of shoot cluster， test-tube rooting， transplanting and domestication were also studied. The results were as follows： （1） The best sterilization treatment was that the explant was treated by 10% NaClO with 15 min， and the contamination rate decreased to 14.44% and the induction rate reached 49.38%; The best medium for induction of shoot cluster was WPM+ ZT 1.5 mg·L. （2） The optimum medium for proliferation of shoot cluster was WPM+ NAA 0.1 mg·L + ZT 1.5 mg·L， and the coefficient of propagation reached 8.6 after subcultured for 60 d; The best treatment for test-tube rooting was that the shoot cluster dipped in 500 mg·L IBA for 20 s firstly， then cultivated them with the medium WPM+IBA 0.2 mg·L， the rooting rate and effective rooting rate all reached 96.3%， and the rooting number and length were 12.7 and 43.3 mm after cultured for 90 d， at the same time， and the root developed well. （3） The survival rate of rooted seedlings reached 92.22% after transplanted in Media Ⅰ（river sand∶vermiculite∶perlite=1∶1∶1）. Thus， the best rapid propagation system of southern highbush blueberry ‘O’Neal’ was that： the explant treated by 10% NaClO with 15 min， the shoot cluster was inducted and proliferated with WPM+ ZT 1.5 mg·L and WPM+ NAA 0.1 mg·L + ZT 1.5 mg·Lrespectively; The shoot cluster dipped in 500 mg·L IBA for 20 s and cultivated with WPM+ IBA 0.2 mg·L， and rooted seedlings were transplanted in media（river sand∶vermiculite∶perlite=1∶1∶1）. The results play a foundation for providing rapid propagation seedlings and factory production of ‘O’Neal’ in the future.

Key words： blueberry， tissue culture and rapid propagation， induction of shoot cluster， test-tube rooting， transplanting and domestication

藍莓（Vacciniums pp.）屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬，為多年生落葉或常綠漿果類灌木（方瑞征，1986）。藍莓果實呈深藍色，果肉細膩、酸甜、風(fēng)味獨特，藍莓果漿中富含大量的脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物等成分，具有較高的營養(yǎng)價值;此外，果漿中還含有較高的花青素、黃酮類、多酚類和多種維生素等，具有改善視力、抗氧化及抗癌等保健和藥用功效（Bornsek et al.， 2012）。因此，藍莓被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一（Kader et al.， 1996），被譽為“水果皇后”，具有較高的深加工應(yīng)用前景。藍莓‘奧尼爾’屬南高叢品種，果實品質(zhì)優(yōu)良，產(chǎn)量較高，經(jīng)近幾年的推廣種植發(fā)現(xiàn)，該品種比較適合在廣西桂北地區(qū)發(fā)展，特別適合鮮果銷售或觀光采摘。

目前，國內(nèi)對藍莓的組培快繁技術(shù)研究已有較多報道，如高叢藍莓（劉慶忠和趙紅軍，2002）和兔眼藍莓（董朝莉，2009;李麗容和金開正，2010）等。胡選萍等（2018）總結(jié)了外植體的滅菌、培養(yǎng)基的選擇、誘導(dǎo)再生及增殖、試管苗生根等。藍莓外植體滅菌多采用0.1%的升汞處理，但容易引起殘留而影響其生長，而NaClO處理藍莓可以降低污染率，提高誘導(dǎo)率（王小敏等，2020）。不同的生長調(diào)節(jié)劑對藍莓‘奧尼爾’叢生芽增殖系數(shù)影響較大，使用ZT的效果要好于6-BA、TDZ或2iP等（陳冰心等，2014;岳健等，2015），但ZT使用濃度過高會導(dǎo)致叢生芽長勢弱且出現(xiàn)玻璃化（陳冰心等，2014）。因此，如何提高藍莓‘奧尼爾’的增殖系數(shù)，同時又能保持較好的生長勢一直是亟待解決的關(guān)鍵問題之一。藍莓組培苗瓶內(nèi)生根相對困難，多采用瓶外生根，王雪嬌等（2017）報道藍莓‘美登’瓶外生根率達78%，而藍莓‘奧尼爾’瓶外生根率不足60%（朱世銀等，2016），因此，如何突破藍莓‘奧尼爾’生根相對困難的瓶頸也是需要解決的關(guān)鍵問題。藍莓品種繁多，不同基因型瓶內(nèi)生根對培養(yǎng)基和外源生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度要求均不同（孫書偉，2009;陽翠等，2016），因此，藍莓‘奧尼爾’能否誘導(dǎo)出數(shù)量眾多、根系健壯的生根苗是工廠化組培快繁技術(shù)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。鑒于此，本研究以藍莓‘奧尼爾’帶腋芽的莖段為外植體，研究外植體的滅菌方法，篩選適合叢生芽增殖的培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑，并研究提高瓶內(nèi)生根率及移栽成活率等關(guān)鍵技術(shù)，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗提供工廠化組培快繁技術(shù)體系。

1材料與方法

1.1 試驗材料

供試的南高叢藍莓優(yōu)良品種‘奧尼爾’從浙江藍美農(nóng)業(yè)有限公司引進的2年生苗木，種植于桂林市雁山區(qū)廣西植物研究所。約6月中旬，待天氣放晴2～3 d后，于早上（9：00—11：00）采集鮮嫩枝條放入保鮮袋，然后立刻放置于裝有冰袋的冰盒內(nèi)保鮮，當天內(nèi)需將材料進行滅菌處理后培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的滅菌及誘導(dǎo)將采集的藍莓進行預(yù)處理后，先在超菌臺上使用75%的乙醇處理50 s，然后分別使用NaClO和HgCl滅菌處理，備用。將滅菌的外植體分別接種于MS和WPM誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均加入1.5 mg·L 玉米素（ZT），每個處理接種30個外植體，3個重復(fù)。培養(yǎng)條件，LED光源，光照時間12 h、光強1 500～2 000 lx、溫度（25±2）℃。培養(yǎng)30 d左右，統(tǒng)計萌芽數(shù)、污染率（污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%）和誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出的外植體數(shù)/未污染的外植體數(shù)×100%），取平均值。

1.2.2 叢生芽的增殖培養(yǎng)誘導(dǎo)出的叢生芽生長到一定大小后，剪成帶單個腋芽的莖段，分別以MS和WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加1-萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、ZT等不同濃度及組合的外源生長調(diào)節(jié)劑，pH為5.4，每個處理接種30個，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件，LED光源，光照時間12 h、光強1 500～2 000 lx、溫度（25±2）℃。繼代培養(yǎng)60 d左右，統(tǒng)計增殖數(shù)和增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=增殖數(shù)/接種數(shù)），取平均值。

1.2.3 瓶內(nèi)生根培養(yǎng)選擇生長健壯的叢生芽苗，剪成帶2～3個腋芽的莖段，備用。處理一：直接接種到添加不同3-吲哚乙酸（IBA）濃度的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。處理二：浸蘸處理，即把帶腋芽的莖段經(jīng)高濃度的IBA浸蘸處理，再接種到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH為5.4，每個處理接種30個，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件，LED光源，光照時間12 h、光強1 500～2 000 lx、溫度（25±2）℃。繼代培養(yǎng)90 d左右，統(tǒng)計生根率、有效生根率（每株生根數(shù)≥3條）、根長和根生長狀況等，取平均值。

1.2.4 移栽馴化 將生根后的瓶苗，于3—4月室外煉苗，開瓶馴化7 d后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)多菌靈滅菌處理的以下 3 種移栽基質(zhì)中，移栽基質(zhì)Ⅰ [河沙∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1（體積比）];移栽基質(zhì)Ⅱ [泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1（體積比）];移栽基質(zhì)Ⅲ（苔蘚）。用底部帶孔的塑料杯（9 cm × 10 cm）種植，然后置于塑料大棚內(nèi)，初期用塑料薄膜蓋好，后期逐漸通風(fēng)，每個處理種植90 株，3 次重復(fù)，移栽60 d后統(tǒng)計組培苗成活率及生長情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用Excel軟件和SPSS 19.0軟件處理。

2結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌及誘導(dǎo)

外植體不同滅菌方式結(jié)果統(tǒng)計見表1。由表1可知，使用10%的NaClO時，隨著處理時間的延長，污染率逐漸降低，同時誘導(dǎo)率也逐漸降低，但萌芽總數(shù)逐漸增多，處理時間為15 min時，效果最好，污染率僅有14.44%，誘導(dǎo)率49.38%，萌芽數(shù)平均12.67個。同樣，外植體隨0.1%的HgCl2處理時間的延長，污染率和誘導(dǎo)率也均下降，但萌芽數(shù)減少，處理15 min時，污染率降低至13.33%，但誘導(dǎo)率僅有19.20%，萌芽數(shù)僅有4.33個。這說明不同滅菌方式及不同處理時間均對外植體污染率、誘導(dǎo)率及萌芽數(shù)影響較大。綜合分析認為，10% NaClO處理15 min是比較理想的滅菌處理方法，降低污染率的同時也能保證相對較高的誘導(dǎo)率，最后誘導(dǎo)出的材料最多。本研究還發(fā)現(xiàn)，WPM的誘導(dǎo)效果要好于MS，誘導(dǎo)出的叢生芽較多，如圖1所示。

2.2 叢生芽的增殖培養(yǎng)

叢生芽的增殖培養(yǎng)情況統(tǒng)計見表2和表3。表2是以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了不同組合的生長調(diào)節(jié)劑。當NAA為0.1 mg·L、6-BA為1.0～2.0 mg·L時，叢生芽增殖效果較差，培養(yǎng)60 d后，增殖系數(shù)僅為2.1～2.8，顯著低于其他處理組合（ P<0.05）。當MS培養(yǎng)基中僅添加1.0～2.0 mg·L ZT時，其增殖效果較好，1.5 mg·L的增殖系數(shù)達到4.5。添加0.1 mg·L NAA后，同濃度的ZT處理，增殖系數(shù)均有不同程度的提高，其中效果最好的為MS+NAA 0.1 mg·L + ZT 1.5 mg·L，增殖系數(shù)高達4.6，增殖苗較粗壯，如圖2：A所示。

表3是以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同樣添加了不同組合的植物生長調(diào)節(jié)劑。當NAA為0.1 mg·L、6-BA為1.0～2.0 mg·L時，叢生芽增殖效果同樣較差，增殖系數(shù)僅有2.8～3.1，顯著低于其他處理組合（ P<0.05）。當培養(yǎng)基僅添加1.0～2.0 mg·L ZT時，其增殖效率顯著提高，增殖系數(shù)達到7.1～7.8。添加0.1 mg·L NAA后，同濃度的ZT處理，增殖系數(shù)均有不同程度的提高，其中處理效果最好的為WPM + NAA 0.1 mg·L+ ZT 1.5?mg·L處理組，增殖系數(shù)高達8.6，長勢良好，說明此培養(yǎng)基為叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基（圖2：B）。從表2和表3還可以看出，添加相同植物生長調(diào)節(jié)劑的情況下，WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的增殖系數(shù)均優(yōu)于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.3 瓶內(nèi)生根誘導(dǎo)

將生長健壯且大小一致的叢生芽，剪成帶2～3個腋芽的莖段，接種于生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不定根的生長數(shù)量和生長速度隨培養(yǎng)基不同而異，培養(yǎng)90 d后觀察統(tǒng)計瓶內(nèi)生根情況如表4所示。由表4可知，將帶腋芽的莖段直接接種在WPM中培養(yǎng)，未能誘導(dǎo)出不定根。在培養(yǎng)基中添加0.1～0.5 mg·L IBA后，莖段基部切口處能誘導(dǎo)不定根，約7 d后開始有少量的不定根長出，但生根數(shù)較少，根系較粗（圖3：A-D）。生根率及有效生根率均呈先升高后降低的趨勢，其中0.3 mg·L的IBA處理組，生根率和有效生根率均最高，分別為50.3%和25.2%;但根系長度隨IBA濃度的升高而變短，從44.3 mm降低到29.3 mm，差異顯著（P<0.05）。此外，IBA濃度為0.3和0.5 mg·L時，莖段基部切口處產(chǎn)生較多的愈傷組織，濃度越高，愈傷組織越多（圖3：C，D）。

從表4還可以看出，先將待接種的帶腋芽的莖段于不同濃度的IBA浸蘸20 s，再接種到含0.2 mg·L IBA的WPM培養(yǎng)基中，生根率、有效生根率及生根數(shù)均明顯好于直接接種于WPM中培養(yǎng)（圖3）。從表4還可看出，浸蘸不同濃度IBA后，生根率和有效生根率均高達95%;生根數(shù)量隨處理濃度升高而逐漸增多，1 000 mg·L 的IBA處理組，生根數(shù)量達每株17.3條;根長呈先升高后降低的趨勢，500 mg·L的 IBA浸蘸處理根系最長（43.3 mm）。綜合分析認為，帶腋芽的莖段先經(jīng)500 mg·L的 IBA浸蘸20 s，再接種于WPM+ IBA 0.2 mg·L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，是誘導(dǎo)瓶內(nèi)生根的最佳的培養(yǎng)方式，其生根率、有效生根率、生根數(shù)量和根長分別達96.3%、96.3%、12.7條和43.3 mm，且根系較發(fā)達、粗壯，如圖3：G所示。

2.4 生根苗室外移栽馴化

生根后的瓶苗于3—4月份移栽，60 d后統(tǒng)計成活率如表5所示。由表5可知，生根苗在基質(zhì)Ⅰ（河沙∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1）的配比中成活率最高，達92.22%，新生芽較健壯、葉片淡黃（圖4：A）;基質(zhì)Ⅱ（泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1）的配比，移栽成活率次之，達88.89%，新生芽健壯、葉片較綠（圖4：B）;基質(zhì)Ⅲ（苔蘚）的移栽成活率為82.22%，但長勢最好，表現(xiàn)為新生芽健壯、葉片深綠（圖4：C）。

3討論與結(jié)論

MS和WPM是藍莓組培快繁研究常用的2種培養(yǎng)基，本研究發(fā)現(xiàn)，在生長調(diào)節(jié)劑相同的情況下，以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)和增殖效果遠好于MS培養(yǎng)基，可能是WPM 培養(yǎng)基中無機鹽濃度較低，適合木本植物組織培養(yǎng)（Wolfe et al.， 1983;胡選萍等，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，1.0～2.0 mg·L? ZT對藍莓‘奧尼爾’的增殖培養(yǎng)效果均明顯好于NAA和6-BA;在1.5 mg·LZT基礎(chǔ)上，添加0.1 mg·L NAA能有利于提高增殖系數(shù)，最高達8.6，雖略低于增殖系數(shù)10.45的報道（陳冰心等，2014），但本研究誘導(dǎo)的叢生芽無玻璃化現(xiàn)象，長勢好，叢生芽粗壯。綜合分析認為，藍莓‘奧尼爾’叢生芽增殖培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為WPM + NAA 0.1 mg·L+ ZT 1.5 mg·L。

本研究發(fā)現(xiàn)，將藍莓‘奧尼爾’帶腋芽的莖段直接在0.1～0.5 mg·LIBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，不定根僅在基部切口處形成，生根率較低（最高為50.3%），有效生根率（平均生根數(shù)≥3條）更低（最高為25.2%）;采用500 mg·L的 IBA浸蘸20 s，再接種到含有0.2 mg·L IBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生根率及有效生根率均達到96.3%，且生根條數(shù)較多，根系粗壯，好于直接在IBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的報道（陳原國等，2016）。除了基部切口外，還能在培養(yǎng)基以上的腋芽和節(jié)間處誘導(dǎo)出大量不定根， 從而有效提高了瓶內(nèi)生根率和有效生根率。據(jù)報道，這是由于IBA濃度對根的形成影響較大，能刺激側(cè)根原基形成并掀起其表皮，生根數(shù)量隨著IBA濃度的增加而增加（李欣欣等，2013）。

不同的移栽基質(zhì)，對藍莓成活率的影響不同，藍莓的移栽馴化常采用腐殖土、草炭灰和苔蘚等基質(zhì)。藍莓進行瓶內(nèi)生根后再移栽，成活率可達85%左右（鄭琪等， 2011），這表明藍莓瓶內(nèi)生根能有效提高移栽馴化成活率。廣西桂北地區(qū)春夏季節(jié)高溫高濕，易引起移栽馴化過程中的爛根等問題，因此，篩選適宜的移栽基質(zhì)對提高移栽成活率至關(guān)重要。而本研究的生根苗在河沙∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1的成活率可達92.22%，但移栽苗在苔蘚中的長勢最好，今后可在移栽基質(zhì)中加入適量苔蘚，在提高成活率的同時，移栽苗長勢可能更好。

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（責(zé)任編輯周翠鳴）