劉曉斌 唐裕福 陳明洋 辛建 張巍

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是生長速度快、發(fā)生率較高的腫瘤，有20%～25%的HCC患者可通過手術切除、肝移植進行治療，但多數(shù)患者首次就診時已喪失手術機會[1-2]。臨床多采用肝動脈插管化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)治療中晚期HCC患者，但部分患者可發(fā)生耐藥現(xiàn)象，影響TACE治療效果[3-4]。乙醛脫氫酶1A1(acetaldehyde dehydrogenase 1A1, ALDH1A1)在肝門部膽管癌中呈高表達，具有評估肝門部膽管癌患者預后的價值[5]。微小RNA-140-5p(microRNA-140-5p，miR-140-5p)在HCC中表達水平較低，其經(jīng)LncRNA AK002107負調(diào)控進而影響HCC的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[6]。HCC組織ALDH1A1、miR-140-5p表達水平可能與TACE的化療敏感性有關。本研究測定ALDH1A1、miR-140-5p在HCC組織中的表達，并分析二者與TACE的化療敏感性的關系。

資料與方法

一、臨床資料

選取2016年4月至2021年1月解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院行TACE治療的Ⅲ期HCC患者91例，男63例，女28例，年齡為(50.9±12.0)歲。納入同期非HCC患者91例，男65例，女26例，年齡為(51.8±12.2)歲。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。收集HCC患者腫瘤分化程度、腫瘤直徑、是否合并肝炎、腫瘤部位及血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)等臨床資料。本研究符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)倫理委員會批準，且受試對象知情同意。

納入標準：①符合《2010年美國肝病年會(AASLD)肝細胞癌診療指南》[7]中HCC診斷標準，經(jīng)病理檢查證實；②腫瘤分期為Ⅲ期；③TACE治療前未進行靶向治療、根治性切除術、射頻消融治療等；④檢查資料完整。排除標準：①有中重度肝動脈-肝靜脈瘺/門靜脈瘺者；②有其他惡性腫瘤者；③肺、腎、心功能不全、胃腸道潰瘍者；④妊娠期哺乳期女性、有免疫系統(tǒng)疾病者。

二、方法

(一)Ualcan數(shù)據(jù)庫檢索 使用Ualcan數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)檢索ALDH1A1表達情況，gene symbol：ALDH1A1，TCGA：Liver hepatocellular carcinoma。

(二)TACE治療及療效觀察 使用Seldinger法進行TACE治療，HCC患者術前禁食6 h，取仰臥位，消毒，利多卡因局麻，穿刺股動脈，置入導管鞘，利用平板血管造影機(ALLura Xper FD20，德國飛利浦公司)行DSA造影檢查，了解腫瘤血管分布、位置、大小等情況，經(jīng)導管注入表阿霉素、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C和超液化碘油，拔出導管、加壓包扎。

HCC患者TACE治療前后1個月均行CT檢查。兩位高年資影像醫(yī)生使用雙盲法對CT圖像進行分析，分析腫瘤與周圍血管的關系、腫瘤形態(tài)大小、強化程度、部位、強化形式。參照文獻[8]對TACE療效進行評價，完全緩解(complete response, CR)：腫瘤完全壞死，無強化區(qū)域；部分緩解(partial response, PR)：腫瘤部分壞死，強化區(qū)面積減少>50%；疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)：腫瘤反應強度處于PD與PR之間；進展(progressive disease, PD)：為新病灶出現(xiàn)或原有病灶>25%。將TACE療效屬于PD、SD的HCC患者納入化療耐藥組(53例)，將TACE療效達到CR、PR的HCC患者納入化療敏感組(38例)。

(三)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測組織ALDH1A1 mRNA、miR-140-5p表達水平 將HCC組和非HCC組活檢時留取的組織研碎，用TRIzol試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司)抽提總RNA，之后用First Strand cDNA Synthesis Kit(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)制成cDNA。最終，用qRT-PCR儀(ABI公司)及Hieff qPCR SYBR?Green Master Mix(翌圣生物科技有限公司)將cDNA擴增、檢測。擴增參數(shù)：97℃預變性4 min；96℃變性20 s，63℃退火/延伸15 s，40個循環(huán)。ALDH1A1、miR-140-5p分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，引物序列見表1。ALDH1A1 mRNA、miR-140-5p相對表達量以2-ΔΔCT法計算。

(四)生物信息學軟件預測ALDH1A1與miR-140-5p的關系 ALDH1A1與miR-140-5p的關系使用生物信息學網(wǎng)站(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)進行檢索預測。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、Ualcan數(shù)據(jù)庫中正常肝組織、HCC組織ALDH1A1 mRNA表達水平比較

Ualcan數(shù)據(jù)庫顯示，正常肝組織ALDH1A1 mRNA為(559.76±138.67)，低于HCC組織的(851.70±245.89)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 ALDH1A1、miR-140-5p、GAPDH、U6引物序列

二、兩者ALDH1A1、miR-140-5p表達情況

HCC組ALDH1A1 mRNA表達水平高于非HCC組，miR-140-5p表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 HCC組與非HCC組患者組織ALDH1A1、miR-140-5p表達水平比較(±s)

三、HCC組織中ALDH1A1 mRNA表達水平與miR-140-5p的相關性

Pearson法分析顯示，HCC組織中ALDH1A1 mRNA水平與miR-140-5p呈負相關(r=-0.583，P<0.05)，見圖1。生物信息學分析顯示，ALDH1A1與miR-140-5p存在靶向結合位點，見圖2。

圖1 91例HCC患者組織中ALDH1A1 mRNA表達水平與miR-140-5p的相關性

圖2 miRTarBase預測ALDH1A1與miR-155的靶向結合位點

四、化療耐藥組與敏感組臨床特征比較

化療耐藥組、化療敏感組患者在性別、腫瘤分化程度、年齡、腫瘤直徑、是否合并肝炎、腫瘤部位方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在腫瘤數(shù)目、血清AFP水平、HCC組織ALDH1A1 mRNA、miR-140-5p表達水平方面，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且化療敏感組腫瘤多發(fā)、AFP≤ 20 μg/L、ALDH1A1 mRNA≤1.97、miR-140-5p> 0.50的患者高于化療耐藥組(P<0.05)。見表3。

五、logistic回歸分析HCC化療敏感的影響因素

單因素logistic回歸分析顯示，腫瘤數(shù)目、血清AFP、ALDH1A是影響HCC患者化療敏感的危險因素(P<0.05)，miR-140-5p是影響HCC患者化療敏感的保護因素(P<0.05)；多因素logistic回歸分析結果顯示，ALDH1A是影響HCC患者化療敏感的獨立危險因素(P<0.05)，miR-140-5p是影響HCC患者化療敏感的獨立保護因素(P<0.05)。見表4。

表3 HCC患者化療耐藥組與化療敏感組臨床特征比較[例(%)]

表4 影響HCC化療敏感性的logistic回歸分析

討 論

HCC血管多、惡性程度高、易轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者就診時已處于中晚期[9-10]。中晚期HCC患者多以TACE化療為主，TACE雖然可改善部分HCC患者生存狀況，但部分患者因產(chǎn)生耐藥導致化療效果較差[11-12]。ALDH1A1可參與細胞分化、血管生成、影響腫瘤細胞耐藥性，可通過影響DNA修復進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的治療抗性[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1在胃癌中表達上調(diào)，與腫瘤侵襲及預后相關，其可能在胃癌中發(fā)揮促癌作用[15-16]。本研究中HCC組織ALDH1A1 mRNA表達水平較高，與Ualcan數(shù)據(jù)庫檢索結果相符，提示ALDH1A1表達失調(diào)可能與HCC發(fā)生發(fā)展相關，推測高表達ALDH1A1通過促進血管生成，影響癌細胞浸潤、轉(zhuǎn)移，進而影響HCC病變進程。Gong等[17]研究發(fā)現(xiàn)ALDH1A1可經(jīng)miR-625靶向調(diào)節(jié)后，進而影響胃癌細胞的多藥耐藥性。本研究顯示，化療敏感組ALDH1A1 mRNA≤1.97的患者占比較高，提示ALDH1A1表達水平與HCC患者化療敏感性密切相關，其表達水平越低，HCC患者化療越敏感，ALDH1A1有望成為評估HCC患者化療效果的輔助指標。

miRNA可在自噬、細胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮調(diào)控作用，其與腫瘤病理變化關系密切[18-19]。miR-140-5p在黑色素瘤中呈低表達，其可通過靶向結合相關基因，調(diào)節(jié)NF-κB等信號通路從而影響黑色素瘤發(fā)展過程[20-21]。本研究顯示，HCC組織miR-140-5p表達水平較低，提示miR-140-5p在HCC中具有重要調(diào)節(jié)作用。既往研究顯示，miR-140-5p可靶向調(diào)節(jié)有關基因表達，影響自噬，從而影響骨肉瘤細胞的化療敏感性，其可能是治療骨肉瘤化療耐藥的潛在靶標[22]。本研究中化療敏感組miR-140-5p>0.50的HCC患者占比較高，提示miR-140-5p可能與HCC患者化療敏感性有關，其表達水平越高，HCC患者TACE越敏感，推測miR-140-5p可能通過靶向調(diào)節(jié)相關基因表達，影響自噬、HCC細胞侵襲能力和糖酵解過程，從而影響HCC患者TACE的治療作用，其機制仍需深入探討。

本研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中miR-140-5p水平與ALDH1A1 mRNA呈負相關，提示miR-140-5p、ALDH1A1 mRNA可能共同影響HCC進展，至于二者是否共同影響HCC患者化療敏感性有待結合基礎研究加以證實。此外，化療敏感組中血清AFP水平≤ 20 μg/L的HCC患者占比較高，與孫晗等[23]研究結果相符。AFP可能通過調(diào)節(jié)耐藥基因表達，抑制細胞凋亡等進而影響HCC化療效果。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中ALDH1A表達水平升高，miR-140-5p表達水平降低均可能會降低HCC患者化療敏感性，使HCC患者TACE治療效果較差，測定HCC組織中ALDH1A、miR-140-5p表達水平有助于及早判定HCC患者化療敏感性，選擇更佳治療方案。

綜上，HCC組織中ALDH1A1表達上調(diào)，miR-140-5p表達下調(diào)，ALDH1A1、miR-140-5p均與化療敏感性相關，可作為判斷HCC患者化療效果的指標。但本研究樣本較少，后期需擴大樣本量從多角度探究ALDH1A1、miR-140-5p表達與HCC患者化療敏感性的關系，為臨床預防化療耐藥提供依據(jù)。