武文超，湯麗斯，劉慧霞，崔雨萱，孫強，孫宗玖,3

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)草原總站，新疆 烏魯木齊 830049；3.新疆草地資源與生態(tài)自治區(qū)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

種子活力是檢驗種子品質的重要指標，也是衡量種子壽命長短的重要依據(jù)。高活力種子具有明顯的生長優(yōu)勢和生產(chǎn)潛力，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有十分重要的意義[1]。種子活力以及壽命因植物種類不同而存在明顯差異，如在常溫貯藏下綠豆(Vignaradiata)、小豆(V.ahgularis)種子壽命可達數(shù)十年，而柳樹(Salixbabylohica)種子壽命只有短短幾十個小時[2]。同時，種子活力也與其成熟度、貯藏溫度、貯藏濕度、基質等因素息息相關[3]。如垂穗披堿草(Elymusnutans)在盛花期后25～31 d收獲，其種子活力最大[4]；花生(Arachishypogaea)[5]、於術(Atractylodesmacrocephala)種子低溫貯藏可有效延緩老化[7]；-15 ℃貯藏10個月的扁穗冰草(Agropyroncristatum)種子發(fā)芽率顯著高于20 ℃貯藏處理，而胚根長、胚芽長則因種子含水量差異表現(xiàn)并不一致[6]。因此，尋找適宜貯藏條件對優(yōu)良種質資源長期貯藏具有重要現(xiàn)實意義和應用價值。

目前，不同貯藏方式對種子活力的影響已有較多報道，研究物種多為作物、蔬菜、花卉等，方式主要集中于低溫貯藏、液氮超低溫貯藏、干藏、真空或不同因素組配[8-9]，且其影響種子活力的生理生化機制可能有所不同。種子千粒重、含水率反映種子飽和度及質量[11]，發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)反映其萌發(fā)活力及其整齊度，胚根長、胚芽長和幼苗干重反映種子萌發(fā)后幼苗生長的茁壯度[12]，而可溶性糖含量則為種子萌發(fā)提供能量供給，決定其是否能正常萌發(fā)為成株[13-14]，相對電導率則表征種子細胞膜結構和功能完整性，反映了其活力保持狀態(tài)[15]。真空密封包裝可使普通小麥(Triticumaestivum)種子糖類物質高于室溫貯藏，延長其貯藏期限[8]?；羝交鄣萚9]指出，超干處理后苜蓿(Medicagosativa)種子發(fā)芽率明顯提高，相對電導率顯著降低。液氮超低溫貯藏3年的糧食、蔬菜、花卉等21個品種種子發(fā)芽率無顯著變化，但生長勢降低、酶活性升高[10]。相對而言，有關草種質特別是生態(tài)修復野生種質種子的最佳儲藏方式研究相對較少。

伊犁絹蒿(Seriphidiumtransiliense) 作為菊科絹蒿屬半灌木，具有抗旱、抗寒、耐牧、營養(yǎng)價值高、壽命長和適應性強等特點[16]，是新疆退化荒漠草地補播的首選草種之一。目前，隨荒漠草地生態(tài)修復項目的實施，伊犁絹蒿種子需求量日益增多，導致其種子采收量大幅增加，但其種子多在常溫下貯藏，這可能會影響其種子萌發(fā)活力，進而影響其補播成效。伊犁絹蒿種子多在10月收獲[17]，而播種一般在翌年3月才開始進行，導致其在常溫下貯藏時間達到半年甚至更久。同時，野外退化草地補播時，初期伊犁絹蒿種子會大量發(fā)芽，但后期萌發(fā)的幼苗出現(xiàn)大量死亡[18]，這可能與種子貯藏過程中自身貯藏能量消耗過多，導致其萌發(fā)后期能量供應不足有關。因此，為了更好地保存伊犁絹蒿種子活力，本研究采用貯藏溫度(常溫、零上低溫、零下低溫)、包裝條件(真空、非真空)雙因素實驗設計，以貯藏6個月的種子為對象，通過對其萌發(fā)特征、生長指標、相對電導率及可溶性糖的測定，明確不同貯藏方式對其種子活力相關指標的影響，篩選最佳貯藏方式，以期為生產(chǎn)中伊犁絹蒿種子的高質量保存提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試驗材料

伊犁絹蒿野生種子于2019年10月31日采自烏魯木齊水磨溝區(qū)伊犁絹蒿荒漠草地(N 43°47′，E 87°41′，海拔453 m)。在試驗區(qū)內隨機布設5個10 m×10 m的樣方，齊地刈割后形成混合樣帶回室內[19]。室內自然風干、脫粒后立即用自封袋進行貯藏。貯藏前伊犁絹蒿種子可溶性糖含量為(11.1±0.1)mg/kg，相對電導率為(10.6±0.3)%，千粒重為(179.4±2.5)mg，種子含水率為(8.1±0.6)%，發(fā)芽率為(88.0±1.6)%。

1.2 實驗設計

采用雙因子(貯藏溫度、包裝條件)實驗設計[20]，貯藏溫度設置常溫(15～25 ℃)、零上低溫(3～5 ℃)、零下低溫(-15～-20 ℃)3個處理，包裝條件設置真空(-50～-60 kPa)、非真空(烏魯木齊地區(qū)的標注大氣壓：0.9 kpa)2個處理，總計6個處理組合，即常溫貯藏(N)、常溫真空貯藏(NZ)、零上低溫貯藏(C)、真空零上低溫貯藏(CZ)、零下低溫貯藏(F)、真空零下低溫貯藏(FZ)。貯藏時間為6個月。

紙上萌發(fā)實驗：萌發(fā)實驗開始前，每種貯藏方式取大小一致、籽粒飽滿的伊犁絹蒿種子4份，每份50粒。種子經(jīng)70%酒精消毒30～60 s，蒸餾水沖洗3～5次后，置于直徑為 90 mm，鋪有雙層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱(GTOP-380B，浙江托普儀器有限公司) 中進行發(fā)芽實驗。發(fā)芽溫度為晝25 ℃/夜15 ℃(晝/夜=12 h/12 h)，光強為110 μmol/(m2·s) 。自種子著床之日起，以胚根突破種皮1 mm，胚芽為種子長1/2作為發(fā)芽標準，每日定時記載種子發(fā)芽數(shù)，補充蒸餾水，15 d結束萌發(fā)實驗，計算種子萌發(fā)指標。

發(fā)芽率%=發(fā)芽種子數(shù)/參試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢%=7天內發(fā)芽種子數(shù)/參試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)Gi=∑Gt/Dt

式中：Gi為發(fā)芽指數(shù)；Gt為在時間t的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應的發(fā)芽天數(shù)。

實驗結束時立即進行胚根長、胚芽長及幼苗干重的測定。每培養(yǎng)皿隨機選取幼苗10株，用精度為1 mm刻度尺測量其胚根長及胚芽長，用精度0.1 mg電子天平稱取10株幼苗干重(80 ℃，24 h)[21]。

盆栽實驗：與種子萌發(fā)實驗同時進行。將各處理下貯藏的伊犁絹蒿種子播種于花盆 (直徑15 cm，深 20 cm，干土重 400 g) 中，每盆 100 粒，播種深度2 mm，重復4次。播后用噴壺均勻灑水，直至土壤濕透，最后將花盆置于室內有日光照射的地方培養(yǎng)。為了避免外界條件的干擾，花盆隨機排列，每天調整位置，并保持表土濕潤。逐日統(tǒng)計出苗數(shù)，15 d結束萌發(fā)實驗，并計算出苗率。出苗率%=出苗種子數(shù)/參試種子總數(shù)×100%。實驗結束時立即隨機選取5株幼苗進行干重(80 ℃，24 h)測定。

1.3 貯藏種子相關指標的測定

對不同貯藏方式下伊犁絹蒿種子進行千粒重、含水率、相對電導率、可溶性糖的測定，其中千粒重用精度0.1 mg電子天平直接稱量，含水率采用烘干法[21]，均重復3次；相對電導率采用電導法[22]，可溶性糖采用蒽酮比色法[22]，均重復4次。

相對電導率的測定[22]：稱取伊犁絹蒿種子0.1 g，用蒸餾水沖洗5次，吸干表面附水后，加雙蒸水6 mL，用電導儀測定浸泡液的初始電導率值(a1)，然后加蓋置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中6 h，測定浸出液電導率(a2)，再將其置于100 ℃水中煮沸1 h，冷卻至室溫，測定浸泡液電導率(a3)，按照公式(1)進行計算。

相對電導率(%)=(a2-a1)/(a3-a1)×100%

(1)

可溶性糖的測定[22]：稱取研磨至粉末狀的伊犁絹蒿種子0.1 g置于試管中，加入5 mL蒸餾水后封口，置于沸水中提取30 min，冷卻后過濾，定容在25 mL容量瓶內。吸取0.5 mL定容液，加蒸餾水1.5mL,加入1 mL 9%苯酚溶液，搖勻，再快速加入5ml濃硫酸，搖勻，顯色并測定光密度。由標準曲線方程(y=0.904 5x-0.027 2，R2=0.999)計算可溶性糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0 軟件中Two-way ANOVA 分析試驗因素對測試指標的效應；利用One-way ANOVA進行6個處理組合間測試指標差異分析。利用Origin 2018 繪圖，數(shù)據(jù)以“均值±標準差”表示。

采用SPSS 23.0對供試指標進行主成分分析，結合隸屬函數(shù)評價法[23]篩選伊犁絹蒿種子最適貯藏方式。首先按照公式(2)進行指標數(shù)據(jù)標準化處理，然后按照公式(3)、(4)、(5)、(6)依次計算標準差系數(shù)(St)、權重系數(shù)(Ct)、隸屬函數(shù)值(Dt)及綜合評價值(E)。

(2)

(3)

(4)

Dt=R(xt)×Ct

(5)

(6)

式中：t=1,2,3,……，n，xt表示第t個指標值，xmin表示第t個指標的最小值，xmax表示第t個指標的最大值。

2 結果與分析

2.1 貯藏溫度和包裝條件對伊犁絹蒿種子萌發(fā)效應

貯藏溫度、包裝條件對伊犁絹蒿種子的千粒重、含水率、胚芽長、可溶性糖、盆栽出苗率以及盆栽幼苗干重有極顯著影響(P<0.01)，對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)無顯著影響；胚根長、相對電導率僅在不同貯藏溫度間表現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)；而包裝條件顯著影響幼苗干重(P<0.05)。兩者互作顯著影響發(fā)芽率、含水率、胚芽長、可溶性糖、盆栽出苗率以及盆栽幼苗干重(表1)。

表1 貯藏溫度和包裝條件對伊犁絹蒿種子萌發(fā)的主效應和交互作用分析

2.2 種子含水率和千粒重

不同貯藏方式間伊犁絹蒿種子含水率存在顯著差異(P<0.05)，其中CZ種子含水率最高，為5.33%，比其他處理高26.90%～142.27%，而N最低，僅為2.20%。真空貯藏顯著高于非真空貯藏，低溫顯著高于常溫(圖1-A)。千粒重FZ(172.00 mg)、F(163.66 mg)間差異不顯著，顯著高于NZ(132.67 mg)、N(128.67 mg)、C(145.00 mg)，且低溫儲藏顯著高于常溫貯藏，零下低溫貯藏顯著高于零上低溫貯藏(圖1-B)。

2.3 發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)

C、F、NZ、CZ、FZ間伊犁絹蒿種子發(fā)芽率差異不顯著，為85.0%～87.8%，且C、F、NZ顯著高于N(P<0.05)(圖2-A)，而發(fā)芽勢(圖2-B)、發(fā)芽指數(shù)(圖2-C)各處理間差異不顯著(P>0.05)，其值分別為51.0%～68.5%、6.7～8.3。

圖1 不同貯藏方式下伊犁絹蒿種子的含水率及千粒重Fig.1 Seed water content and 1000-grain weight of S.transiliense

圖2 不同貯藏方式下伊犁絹蒿種子萌發(fā)指標Fig.2 Seed germination indexes of S.transiliense

2.4 胚根長、胚芽長及幼苗干重

伊犁絹蒿種子胚根長N、NZ顯著高于其他4種處理34.57%～233.33%，且C(12.84 mm)、CZ(10.48 mm)較F、FZ顯著提高 46.86%～122.38%(圖3-A)。胚芽長FZ(13.21 mm)、CZ(11.09 mm)相對較高，顯著高于其他4種處理47.88%～56.25%，且低溫貯藏顯著高于常溫貯藏，真空貯藏顯著高于非真空貯藏(圖3-B)。幼苗干重FZ、CZ、NZ、N、C間差異不顯著(P>0.05)，而F顯著低于CZ、FZ(P<0.05)(圖3-C)。

2.5 可溶性糖及相對電導率

伊犁絹蒿種子可溶性糖含量FZ、CZ較N、C、F、NZ顯著增加34.27%～56.18%，而F、NZ則顯著高于N、C 6.31%～16.32%(P<0.05)(圖4-A)。相對電導率N、NZ顯著高于C、CZ、F、FZ(P<0.05)，且C、CZ、F、FZ間差異不顯著(圖4-B)。總體表明，低溫貯藏下種子相對電導率顯著低于常溫貯藏(圖4-B)，而可溶性糖含量則真空處理顯著高于非真空處理(圖4-A)。

圖3 不同貯藏方式下伊犁絹蒿種子胚根長、胚根長、幼苗干重Fig.3 Radical length，germ lengthand seedling dry weight of S.transiliense

2.6 綜合評價

為避免各測試指標間相互干擾，通過主成分分析將測定的10個指標合成3個新的綜合因子，累計貢獻率為79.31%(表2)，其中第一主成分(Ⅰ)中胚芽長、可溶性糖的因子負荷均在0.9以上，可以理解為種子萌發(fā)后生長的健壯程度；第二主成分(Ⅱ)中發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)的因子負荷均在0.8以上，可理解為種子萌發(fā)速度；第三主成分(Ⅲ)中發(fā)芽率的因子負荷最高，可理解為種子發(fā)芽狀況。以新合成的3個變量Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為指標進行隸屬函數(shù)綜合評價(表3)表明，F(xiàn)Z、CZ、NZ處理效果明顯優(yōu)于F、C、N。

2.7 盆栽驗證

盆栽條件下伊犁絹蒿種子出苗率FZ最高，為41.0%，顯著高于其他處理28.13%～115.78%，F(xiàn)、CZ 較N、C、NZ 顯著提高 39.13%～68.42%，而N、C、NZ間無顯著差異(圖5-A)。FZ、CZ處理伊犁絹蒿幼苗干重顯著高于其他處理23.26%～71.03%，且NZ較N、C顯著提高 30.36%～55.72%(圖5-B)。

表2 伊犁絹蒿種子各綜合指標因子負荷量及貢獻率

表3 不同貯藏方式下伊犁絹蒿種子活力特征的綜合評價

3 討論

與收獲初期相比，常溫貯藏6個月后伊犁絹蒿種子發(fā)芽率、含水率、千粒重、可溶性糖均出現(xiàn)降低，降幅依次為6.25%、72.84%、28.28%、40.72%，而相對電導率則增加68.19%，表明常溫貯藏引起伊犁絹蒿種子活力的喪失，需要尋找適宜貯藏方式來緩解種子的活力喪失速度，這與劉雄盛等[24]的研究結果相一致。伊犁絹蒿種子在零上、零下低溫及真空貯藏下其千粒重、含水率、可溶性糖含量等指標與收獲初期比降低幅度相對較小，為3.91%～34.57%，相對電導率增加幅度較低，為55.66%。這可能是由于種子在不同貯藏環(huán)境下的呼吸方式不同，真空條件下種子只能進行無氧呼吸，非真空條件下種子可以進行無氧呼吸及有氧呼吸，且低溫下呼吸相對緩慢，導致其營養(yǎng)物質消耗存在差異[25]，這也為篩選適宜貯藏方式減緩種子活力喪失提供了依據(jù)。

圖5 盆栽條件下不同貯藏方式伊犁絹蒿種子出苗率及幼苗的干重Fig.5 Seedling percentage and seedling weight of S.transiliense under potting condition

對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)而言，王桔紅等[26]指出，室溫貯藏和短期低溫貯藏間旱生灌木種子最終發(fā)芽率基本相同，張鳳[27]也認為，低溫(-20～4 ℃)貯藏不能顯著改變大豆種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢，但王澤等[28]則指出，低溫(-18～4 ℃)貯藏下梭梭種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及胚鮮重均顯著高于常溫貯藏。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫促進了伊犁絹蒿種子的發(fā)芽率，但真空與低溫組合后這種促進作用消失，而對于常溫貯藏的種子經(jīng)真空處理后，其發(fā)芽率也得到明顯提高，貯藏方式對發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)影響不顯著。這可能是由于貯藏溫度與包裝條件間的相互疊加引起種子體內生理生化響應的相互抵消而引起，但其具體原因還有待于進一步研究。

研究表明[29]，真空低溫處理白菜種子的胚芽長和幼苗干重高于非真空處理，在常溫低濕處理下的烤煙(FluecuredTobacco)，種子萌發(fā)后的胚根長度與新采收種子無顯著差異[30]，而室溫貯藏的大豆種子幼苗干重會隨含水量的下降呈現(xiàn)下降趨勢[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，常溫及真空常溫貯藏比低溫及真空低溫貯藏顯著促進了伊犁絹蒿種子萌發(fā)后胚芽的伸長，抑制了胚根的增長，而對幼苗干重影響不顯著，這可能是由于種子在萌發(fā)過程中，真空減少了種子呼吸能量消耗，低溫處理下種子細胞酶的活性受到抑制，從而使種子體內能量保留相對較多[31]，同時由于種子在萌發(fā)時是胚芽首先突破種皮，種子體內的營養(yǎng)物質首先會維持胚芽的生長，從而抑制胚根的生長[32-33]；而幼苗干重在各處理之間不顯著可能與種子貯藏時間相對較短有關，因此還需進一步研究。

種子在貯藏過程中，相對電導率與種子活力呈現(xiàn)負相關，種子活力強，萌動時細胞修復受損能力強，種子浸出液的電導率低，反之則電導率高[34]。張俊等[35]研究發(fā)現(xiàn)低溫、真空貯藏條件下種子相對電導率明顯低于室溫貯藏，且可溶性糖含量顯著增加。本研究表明，低溫、真空貯藏下伊犁絹蒿種子相對電導率顯著降低，而可溶性糖含量則顯著增加，這與前人研究[34-35]基本一致。可能是由于種子在貯藏過程中其體內的可溶性糖可以增加細胞質的濃度及質量，可以降低種子的生理活動速率[36]，從而使種子可溶性糖含量消耗和相對電導率增加減慢，最終緩解種子的老化。

盆栽條件下真空零下低溫貯藏、零下低溫貯藏、零上低溫貯藏的伊犁絹蒿出苗率顯著高于室溫貯藏、零上低溫貯藏、室溫真空貯藏，且盆栽出苗率遠低于紙上發(fā)芽率，這可能一方面與萌發(fā)種子體內貯藏能量的多少決定幼苗的生長狀態(tài)相關[37]，低溫、真空下伊犁絹蒿種子體內可溶性糖含量顯著高于常溫、非真空條件；另一方面可能是由于自然環(huán)境下種子出苗不僅取決于其體內的營養(yǎng)物質的積累狀況，還與其生長環(huán)境條件存在一定關系[38]。與紙上發(fā)芽所處適宜生長條件相比，盆栽試驗條件下伊犁絹蒿種子萌發(fā)所處室溫環(huán)境及土壤中的不確定因素均會對其種子萌發(fā)出苗產(chǎn)生負面影響，進而導致其出苗率降低[39]。盆栽真空貯藏下伊犁絹蒿幼苗重顯著高于非真空處理，且以真空零上低溫貯藏最好，其次為零上低溫貯藏。可能是由于真空貯藏降低了種子部分生理活動，使其體內可溶性糖含量保留相對較多[40]，細胞膜受損程度降低，引起種子萌發(fā)后幼苗生長較為旺盛。

主成分分析可以利用測試指標間內在聯(lián)系，通過降維減少其信息的重疊，隸屬函數(shù)分析可以消除單一指標評價產(chǎn)生的片面性，使評價結果更為客觀準確，與實際較為接近[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，紙上發(fā)芽條件下真空貯藏的伊犁絹蒿種子活力明顯優(yōu)于非真空貯藏，而低溫貯藏明顯高于常溫儲藏，這與本研究的盆栽試驗結果基本吻合。

4 結論

6個月存貯時間下真空、低溫貯藏均可延緩伊犁絹蒿種子千粒重、含水率、可溶性糖含量的降低，阻礙細胞膜透性的增加，延長了種子萌發(fā)活力。6種貯藏方式下，伊犁絹蒿種子以真空零上和零下低溫為最佳貯藏方式。