趙健宇 王鳳新 孟潮彪,2 金 松 彭 敏

(1.中國農(nóng)業(yè)大學水利與土木工程學院，北京 100083；2.浙江大學土水資源與環(huán)境研究所，杭州 310058；3.懷俄明大學工業(yè)與民用建筑工程系，拉勒米 WY 82071；4.元泰豐(包頭)生物科技有限公司，包頭 014199)

0 引言

土壤氮循環(huán)是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的循環(huán)之一，與其密切相關的氨氧化細菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)、氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)、反硝化細菌和固氮菌是參與硝化、反硝化和固氮作用的重要功能微生物，其群落豐度和結構等因素直接調(diào)節(jié)氮素在土壤中的轉化，影響作物對氮素的吸收利用[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，施肥會導致土壤微生物的豐度和結構發(fā)生變化。有機和無機肥料配合施用已被證明是提高土壤肥力和維持農(nóng)作物產(chǎn)量的有效施肥方式[2]。施用糞肥、作物秸稈作為有機肥料還田能顯著增加固氮菌、反硝化菌和AOB豐度[3-6]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)施用糞肥對反硝化菌豐度無影響，無機肥與糞肥配施減少固氮菌豐度，而無機肥與秸稈還田配合對固氮菌豐度無明顯影響[4,7-9]。有機肥料對氮循環(huán)相關微生物的豐度產(chǎn)生不同程度的影響，與土壤理化特性的變化有關。有機肥料的施入直接為反硝化菌等異養(yǎng)微生物生長提供碳源，促進土壤微生物生長[10]。不同有機肥和無機肥配施量對氮素形態(tài)(銨態(tài)氮和硝態(tài)氮)的影響直接關系到硝化作用和反硝化作用底物的濃度，進而對相關微生物的豐度和功能產(chǎn)生影響[11-12]。當土壤中可利用的氮能充分滿足固氮微生物的需求時，固氮微生物的活性將會降低，生物固氮作用受到抑制[13]。此外，施肥造成的土壤pH值變化也是影響微生物變化的主要因素之一[3,14-15]。因此，氮循環(huán)過程相互關聯(lián)，受到土壤環(huán)境因子驅動，不同的肥料類型及施用量會對氮循環(huán)相關微生物的活性和豐度產(chǎn)生重要影響，從而影響土壤養(yǎng)分循環(huán)。

褐煤具有多孔性和較大的比表面積，具有較高的有機質和腐殖酸含量，對各種土壤化合物的吸附作用較強[16]，有助于增加土壤有機碳含量、碳氮比和陽離子交換能力，是有機肥料的基礎[17]。褐煤中的腐殖酸可以提高馬鈴薯對含氮化合物的吸收，促進馬鈴薯生長和塊莖形成。與糞肥等有機肥料相比，褐煤穩(wěn)定性較強，有機質礦化速率有限，短期內(nèi)可能對土壤微生物群落豐度和結構影響較小[18]。土壤養(yǎng)分的供應離不開微生物的參與。隨著生物技術的發(fā)展，出現(xiàn)以褐煤為原料進行微生物發(fā)酵生產(chǎn)的煤基生物有機肥[19-20]。煤基生物有機肥與無機肥料混施，能否促進肥料本身和土壤養(yǎng)分的緩慢釋放，從而提高肥料利用效率；煤基生物有機肥能否改善土壤的理化特性和調(diào)節(jié)土壤氮循環(huán)功能微生物，進而促進馬鈴薯對氮素的吸收利用，實現(xiàn)產(chǎn)量提升，值得研究。

目前的研究很少關注生物有機肥聯(lián)合化肥施用對作物生長及土壤氮循環(huán)微生物的影響。本研究擬通過大田試驗，利用分子微生物學方法標記相關功能基因，研究增施煤基生物有機肥對滴灌馬鈴薯產(chǎn)量和土壤理化特性以及氮循環(huán)相關功能微生物豐度的影響，揭示煤基生物有機肥對作物產(chǎn)量和土壤氮循環(huán)的作用機制，為土壤科學管理和提高氮素利用率及制定合理施肥制度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2019年5月11日—9月10日在內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市固陽縣舊城村(41°1′N，110°3′E，海拔1 356 m)，該地區(qū)屬于溫帶大陸性氣候，年平均氣溫為4℃，年平均降雨量為300 mm，多年平均20 cm蒸發(fā)皿蒸發(fā)量為2 270 mm左右，年日照總時數(shù)為3 130 h，無霜期為95～110 d。該試驗地土壤質地為砂壤土，0～80 cm處土層平均干容重為1.35 g/cm3，平均田間持水率約為21.67%(體積含水率)。前茬作物為馬鈴薯，耕作層(0～40 cm)土壤pH值8.10，有機碳質量比3.71 g/kg，全氮質量比0.39 g/kg，全磷質量比0.61 g/kg，硝態(tài)氮質量比12.0 mg/kg，速效鉀質量比141.0 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗共計4個處理：單施化肥(CF)、化肥增施1 500 kg/hm2煤基生物有機肥(BF1)、化肥增施3 000 kg/hm2煤基生物有機肥(BF2)、化肥增施4 500 kg/hm2煤基生物有機肥(BF3)，每個處理重復3次，共計12個小區(qū)，隨機布置。所用化肥為尿素(含N 46%)、磷酸二銨(含N 16%，P2O544%)、硫酸鉀(含K2O 50%)，施用量為210、150、180 kg/hm2。煤基生物有機肥由元泰豐(包頭)生物科技有限公司生產(chǎn)，主要原料為褐煤，其pH值為8.48，有機質質量比為976 g/kg，全氮質量比為30.9 g/kg，全碳質量比為366 g/kg，碳氮比為11.9。

1.3 農(nóng)藝措施

試驗所用馬鈴薯品種為克新一號，每個小區(qū)種植7壟，壟長6.00 m，壟底寬0.80 m，壟高0.30 m，一壟單行，株距約為0.25 m，播種深度為0.15 m，種植密度為52 500 株/hm2，所有處理小區(qū)均采用黑色地膜(寬約0.70 m，厚約0.008 mm)覆蓋。馬鈴薯于2019年5月11日播種，9月10日收獲。采用滴灌灌溉，壟的中央、滴頭的正下方埋設負壓計，陶土頭埋深為20 cm，土壤水勢低于-25 kPa時開始灌水，每次灌水量取5 mm[21]。馬鈴薯全生育期共灌水56次，灌水總量為280 mm，各生育期(除A外)灌水量如圖1(圖中A～E分別表示芽條生長期、幼苗期、塊莖形成期、塊莖膨大期、成熟期)所示。有機肥和全部磷肥、30%氮肥和30%鉀肥在旋耕起壟前人工撒施，剩余氮肥和鉀肥平均分成2份分別在塊莖形成期(6月24日)和塊莖膨大期(7月20日)隨水追施。

圖1 全生育期累計灌水量Fig.1 Accumulated irrigation amount in growth period

1.4 測定項目及方法

1.4.1作物干物質量及塊莖產(chǎn)量

干物質量：塊莖成熟期從每個小區(qū)隨機選取10株馬鈴薯，將植株莖、葉、根和塊莖分離并稱鮮質量，植株的莖、葉、根和塊莖置于105℃干燥箱中殺青30 min，然后80℃恒溫干燥至質量恒定，再冷卻至室溫(20℃)，分別稱量得莖、葉、根和塊莖的干物質量。

塊莖產(chǎn)量及分級：收獲時每個小區(qū)隨機取10株馬鈴薯，用電子天平(精度為0.01 g)稱量單株塊莖質量和商品薯質量(≥75 g)；每個小區(qū)選取中間3壟稱取鮮質量，計算單位面積上塊莖總產(chǎn)量。

1.4.2土壤樣品采集

塊莖成熟收獲前，各小區(qū)選取3個代表樣點采集0～20 cm深度土樣，混合均勻后分成2份裝入無菌袋低溫保存帶回實驗室。一份鮮土4℃保存，用于測定土壤理化性質；另一份鮮土-20℃保存，用于提取土壤DNA。

1.4.3土壤理化性質測定

土壤理化性質的測定參照《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》[22]中的相關方法進行。土壤pH值用土壤pH計測定，水土質量比為5∶1；土壤含水率采用干燥法測定；有機碳含量采用重鉻酸鉀容量法測定；全氮、全磷和全鉀含量分別采用凱氏定氮法、氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法和氫氧化鈉熔融-火焰光度法測定；2 mol/L氯化鉀溶液浸提土壤后用連續(xù)流動分析儀測定硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量。

1.4.4土壤微生物DNA提取和功能基因熒光定量分析

從土樣中取0.5 g，通過PowerSoil DNA提取試劑盒(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA,美國)按操作步驟提取土壤總DNA。提取的DNA保存在-20℃下備用。通過瓊脂糖凝膠電泳((Bio-Rad,Hercules,CA,美國)和ND-2000型分光光度計(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,美國)檢測所提DNA片段大小和質量。PCR反應體系為20 μL，其中包含4 μL的5×FastPfu緩沖液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，上下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL，0.4 μL的FastPfu聚合酶(Promega,Fitchburg,WI,美國)和10 ng的DNA模板，最后用雙蒸水補齊至20 μL。16S rRNA、ITS、nirS、AOB-amoA和nifH基因熒光實時定量PCR分析所用的引物及反應條件見表 1。質粒及標準曲線的制備參照文獻[23]。

表1 PCR擴增引物及反應條件Tab.1 Primers and reaction conditions of PCR analysis

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行計算，Origin 2017進行繪圖，SPSS 20統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和LSD法分析處理間顯著性差異(P<0.05)，相關性分析采用Pearson法。

2 結果與分析

2.1 煤基生物有機肥對馬鈴薯成熟期干物質量和塊莖產(chǎn)量的影響

由圖2(圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同)可知，BF3處理馬鈴薯植株干物質積累總量最大，比CF處理多27.11%。在塊莖成熟期時，干物質積累量主要集中于塊莖，占干物質積累總量的62.21%～71.65%；其次是莖，占干物質積累總量的17.56%～25.76%；根和葉干物質積累量分別占總量的2.31%～2.98%、8.30%～9.73%。煤基生物有機肥對塊莖干物質積累量具有極顯著影響(P<0.01)，BF3和BF2處理塊莖干物質量分別比CF處理多10.37%、9.32%，BF1較CF處理多6.05%；BF2與BF3間無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 馬鈴薯成熟期干物質積累量Fig.2 Dry matter accumulation at potato maturation stage

由圖3可知，增施煤基生物有機肥處理的產(chǎn)量均高于單施化肥處理且差異顯著(P<0.05)，隨著煤基生物有機肥量的增加，單株薯質量、商品薯質量和塊莖總產(chǎn)量均有不同程度增加。與CF處理相比，BF3處理顯著提高了單株薯質量、商品薯質量和塊莖總產(chǎn)量，分別增加了22.62%、17.73%和9.49%。就塊莖總產(chǎn)量來說，增施1 500～4 500 kg/hm2的煤基生物有機肥，較單施化肥增產(chǎn)幅度為5.30%～9.49%。

圖3 不同處理對馬鈴薯單株薯質量、商品薯質量和塊莖總產(chǎn)量的影響Fig.3 Tuber weight per plant,commodity potato weight and yield in responding to different treatments

2.2 煤基生物有機肥對土壤基本理化性質的影響

不同煤基生物有機肥增施量對0～20 cm土壤pH值和有機碳、全氮、全磷、全鉀、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量的影響，如表2所示。與CF處理相比，BF1、BF2和BF3顯著降低了土壤pH值，顯著增加了有機碳含量。增施煤基生物有機肥對土壤全氮、全鉀、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量變化沒有產(chǎn)生顯著差異，但隨著增施量的增加，呈現(xiàn)出土壤全氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮遞增趨勢。

表2 不同處理的土壤基本理化性質Tab.2 Physical and chemical properties of soils under different treatments

2.3 煤基生物有機肥對土壤微生物豐度的影響

與單施化肥相比，增施煤基生物有機肥可以使0～20 cm深度土壤細菌和真菌總量增加26%～97%，其中細菌豐度增加33%～104%，真菌豐度增加11%～80%(圖4)，但無顯著差異(P>0.05)。而隨著煤基生物有機肥增施量的增加，土壤細菌和真菌豐度均呈現(xiàn)減少趨勢，但均高于CF處理。各處理中土壤細菌/真菌豐度比為2.4～3.3，隨生物有機肥增施量的增加呈現(xiàn)出先降后升的趨勢；BF3處理較BF2處理真菌豐度減少26%，細菌豐度幾乎不變，致使BF3處理土壤細菌/真菌豐度比提高；而BF2處理比BF1處理真菌豐度減少17%，細菌豐度減少31%，造成BF2處理土壤細菌/真菌豐度比大為降低，甚至低于CF處理。說明適量增施煤基生物有機肥可以增加土壤細菌和真菌的豐度，進一步增施會導致其豐度減少；由于微生物豐度減少的比例不同，細菌/真菌豐度比發(fā)生變化。

圖4 不同處理土壤中細菌和真菌豐度及細菌/真菌豐度比Fig.4 Abundance and ratio of bacteria and fungi in soil under different treatments

2.4 煤基生物有機肥對土壤氮循環(huán)相關微生物功能基因豐度的影響

由亞硝酸鹽還原酶基因(nirS)、氨氧化細菌(AOB)的氨單加氧酶基因(amoA)和固氮酶基因(nifH)豐度測定表明(圖5)，試驗土壤中nifH基因和AOB-amoA基因拷貝數(shù)高出nirS基因拷貝數(shù)1個數(shù)量級，與CF處理相比，增施煤基生物有機肥的0～20 cm深度土壤中上述3種與氮循環(huán)相關的功能基因豐度均有所提高，但nifH基因和AOB-amoA基因在統(tǒng)計學上無顯著差異(P>0.05)。與CF處理相比，對于nifH基因和AOB-amoA基因豐度，以BF3處理提高幅度最大，分別達74%和77%，BF2處理提高幅度最小，為29%和40%；對于nirS基因豐度，以BF2處理提高幅度最大，為90%，BF3處理提高幅度最小，為33%。隨著煤基生物有機肥增施量的增加，nifH基因和AOB-amoA基因豐度呈現(xiàn)先減后增，nirS基因豐度呈現(xiàn)先增后減的趨勢。

圖5 不同處理土壤中nirS、AOB-amoA和nifH基因拷貝數(shù)Fig.5 Copies of nirS,AOB-amoA and nifH genes in soil under different treatments

2.5 土壤理化性質與氮循環(huán)相關微生物功能基因的相關分析

土壤微生物豐度與土壤基本理化性質的相關分析(表3)表明，細菌16S rRNA、真菌ITS和nifH基因豐度與土壤含水率、pH值、有機碳含量、全氮含量、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量均無顯著相關性。除nirS基因豐度與有機碳含量呈顯著正相關，AOB-amoA基因豐度與全氮含量呈顯著正相關外，nirS、AOB-amoA基因豐度與其他土壤理化性質無顯著相關性。

表3 土壤微生物豐度與土壤基本理化性質的相關系數(shù)Tab.3 Correlation coefficients between soil microbial abundances and physical and chemical properties of soil

3 討論

3.1 煤基生物有機肥對馬鈴薯干物質積累和產(chǎn)量的影響

3.2 煤基生物有機肥對土壤微生物豐度的影響

土壤微生物在一定程度上能反映土壤肥力水平，土壤細菌豐度高，表明土壤性質和水肥條件好，可以作為評價土壤健康的指標[35]。倪雷[36]研究發(fā)現(xiàn)，作物生育時期是影響土壤細菌豐度變化的首要因素，施加有機肥后增加了細菌豐度，而自小麥拔節(jié)期后豐度遞減且無顯著差異。本研究結果與之相似，增施煤基生物有機肥較單施化肥不同程度增加了土壤細菌和真菌豐度，但無顯著差異。一方面由于施加有機肥帶入了有機質和碳源，促進了土壤團粒結構形成，進而促進微生物生命活動和生長繁殖，細菌和真菌豐度增加[37]；另一方面可能是作物生育期內(nèi)氣候變化和產(chǎn)生的根系分泌物導致成熟期各處理土壤細菌和真菌豐度無顯著差異。隨著煤基生物有機肥施用量的增加，土壤中細菌和真菌豐度均呈現(xiàn)減少趨勢，這可能是由于煤基生物有機肥本身含有大量腐殖酸、大中小分子系列有機物和有益活性菌，這些組分均可加劇微生物活動，造成微生物間相互爭奪養(yǎng)分，優(yōu)勢群體逐漸占主導地位，抑制其他種群繁殖，并充當關鍵物種(Keystone species)，起到穩(wěn)定微生物生態(tài)平衡的作用[38]。其次，褐煤在堿性土壤中可能釋放出一些化合物，如酚類、鄰苯二甲酸鹽、多芳香烴、苯類和脂肪族化合物等，其中一些對細胞代謝有毒害作用[18]。這也是隨著煤基生物有機肥施用量增加，微生物生長受到抑制的原因之一。

本研究中，增施4 500 kg/hm2和1 500 kg/hm2煤基生物有機肥土壤細菌/真菌豐度比高于單施化肥，而增施3 000 kg/hm2煤基生物有機肥土壤細菌/真菌豐度比低于單施化肥，說明土壤微生物區(qū)系可以通過施用生物有機肥進行調(diào)控，適宜的有機肥施用量對細菌/真菌豐度比有增加趨勢。然而增施該種煤基生物有機肥對土壤微生物區(qū)系的調(diào)控規(guī)律仍需進一步研究。

3.3 煤基生物有機肥對土壤理化性質和氮循環(huán)功能基因的影響

增施煤基生物有機肥對土壤pH值和有機碳含量影響顯著。增施煤基生物有機肥后土壤有機碳含量增加了4.8%～18.4%，這與肥料本身碳含量豐富密切相關；土壤pH值降低了0.10～0.17，這可能是由于在有機肥分解過程中有機酸和CO2釋放到土壤中所致[39]。

本研究利用PCR技術定量檢測了nirS、AOB-amoA和nifH3個關鍵氮循環(huán)功能基因，以研究增施煤基生物有機肥對參與反硝化作用、硝化作用和固氮作用微生物的影響。土壤pH值、有機碳含量、氮含量等理化性質是影響氮循環(huán)的重要環(huán)境因子。先前的研究表明pH值是決定土壤微生物豐度與群落的最主要因素[3,14,40]，而本研究中土壤pH值與氮循環(huán)相關微生物豐度無顯著相關關系，說明增施煤基生物有機肥雖然顯著降低了土壤pH值，但未能改變土壤酸堿度對微生物豐度變化產(chǎn)生影響。

作為氨氧化作用的主要承擔者，AOB在土壤氮循環(huán)中起到重要作用。先前有研究表明，肥料類型顯著影響AOB豐度[45]，而本研究結果表明，增施煤基生物有機肥對AOB-amoA基因拷貝數(shù)增加不顯著。AOB是一類化能自養(yǎng)型微生物，一般不以有機碳為能源生長。因此，本研究中土壤有機碳含量增加沒有導致AOB豐度顯著提高。據(jù)報道，氨氧化作用的底物——氨的可利用性是氨氧化微生物生長的重要原因，無機氮作為能源物質，AOB的生長易受到其影響[12,40]。本研究中，AOB-amoA基因拷貝數(shù)與土壤全氮含量呈顯著正相關，則進一步說明了氮素對AOB生長的重要性。

3.4 土壤氮循環(huán)特征與馬鈴薯增產(chǎn)機制

4 結論

(1)增施煤基生物有機肥可以調(diào)節(jié)土壤氮循環(huán)過程，增加土壤有機質和有效養(yǎng)分，顯著提高馬鈴薯成熟期干物質積累量，顯著提高單株薯質量、商品薯質量和塊莖總產(chǎn)量，以增施4 500 kg/hm2煤基生物有機肥最佳。

(2)增施煤基生物有機肥較單施化肥不同程度增加了土壤細菌和真菌豐度，而隨增施量增加，土壤細菌和真菌豐度均呈現(xiàn)出減少趨勢，但無顯著差異；適宜的生物有機肥增施量對細菌/真菌豐度比有增加趨勢。

(3)增施煤基生物有機肥能顯著降低土壤pH值，提高有機碳含量和nirS型反硝化菌豐度，而對AOB和固氮菌豐度影響不顯著。相關性分析表明，nirS基因拷貝數(shù)與土壤有機碳含量顯著正相關，AOB-amoA基因拷貝數(shù)與土壤全氮含量顯著正相關，土壤有機碳是驅動nirS型反硝化菌豐度的重要環(huán)境因子。