王 東 沈楷程 范葉滿 龍博偉

(1.西北農(nóng)林科技大學機械與電子工程學院，陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)重點實驗室，陜西楊凌 712100)

0 引言

水分脅迫可直接影響植物光合作用，進而影響其干物質(zhì)積累效率[1]。葉綠素熒光參數(shù)可反映葉片的光能吸收、轉(zhuǎn)化、傳遞及分配能力[2-3]。葉綠素熒光參數(shù)中的Fv/Fm表示PSⅡ反應中心內(nèi)的最大光能轉(zhuǎn)換效率，該指標在植物生理變化和逆境脅迫研究中具有重要意義[4-5]。POUDYAL等[6]在高溫脅迫條件下使用Fv/Fm對不同基因型番茄耐熱性進行篩選，以實現(xiàn)番茄耐熱性的早期檢測。BADR等[7]基于玉米葉片相對含水率和Fv/Fm參數(shù)研究了不同基因型玉米的干旱脅迫響應分析。王振華等[8]對棉花進行了不同梯度水分脅迫和氮素脅迫研究，發(fā)現(xiàn)二者均可造成Fv/Fm值的降低。姚潔妮[9]基于綠葉素熒光動力學圖像、序列前向選擇、線性分類判別器算法完成了擬南芥干旱程度的可視化分析，準確率最高可達92%。Fv/Fm的快速測量在植物逆境脅迫研究中意義重大，而當前的Fv/Fm測量方法需對植物進行20～30 min暗適應[10]，無法實現(xiàn)實時測量。

針對Fv/Fm無法實時測量的問題，國內(nèi)外學者對以光譜技術(shù)預測Fv/Fm進行了研究。ZHANG等[11]在不同鹽堿化程度的海灘測量多種植物葉片的葉綠素熒光參數(shù)和高光譜數(shù)據(jù)，并用植被指數(shù)對各葉綠素熒光參數(shù)進行回歸分析，其中植被指數(shù)(R680-R935)/(R680+R935)和R680/R935可用于預測葉綠素熒光中的Fo、Fm、Fv/Fm、qP和UPSII等參數(shù)，植被指數(shù)NDSI(680,935)可用于預測Fv/Fm，其預測回歸系數(shù)為-0.828，均方根誤差為0.020。譚昌偉等[12]對田間玉米進行不同梯度氮肥處理，并在生長期的4個階段采集光譜和Fv/Fm數(shù)據(jù)，分析了植被指數(shù)和Fv/Fm的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)植被指數(shù)(R800-R445)/(R800-R680)和Fv/Fm相關(guān)性最高，其決定系數(shù)R2為0.813，均方根誤差RMSE為0.082。以上研究表明了可見-近紅外光譜反射率預測Fv/Fm的可行性，但當前研究多使用植被指數(shù)或紅邊參數(shù)預測Fv/Fm，且均以單點或多點葉綠素熒光參數(shù)代表葉片整體指標。然而脅迫條件下葉片的不同位置葉綠素熒光參數(shù)存在明顯差異，其單點或多點采樣方法導致預測精度受損。

為實現(xiàn)Fv/Fm的實時獲取，本文以辣椒幼苗(加長六號)為研究對象，測量其葉片高光譜圖像數(shù)據(jù)和葉綠素熒光Fv/Fm圖像數(shù)據(jù)，通過特征點匹配完成高光譜圖像和Fv/Fm圖像匹配。使用標準正態(tài)變換(SNV)、多元散射校正(MSC)和Savitzky-Golay卷積平滑(SG)3種光譜預處理算法濾除隨機噪聲，采用連續(xù)投影算法提取特征波段，對比偏最小二乘(PLSR)、徑向基函數(shù)(RBF)神經(jīng)網(wǎng)絡和分析誤差反向傳播(BP)神經(jīng)網(wǎng)絡3種建模算法的模型精度，選出最優(yōu)建模方式，以期為實現(xiàn)基于高光譜圖像的葉綠素熒光Fv/Fm圖像準確預測提供一種方法。

1 數(shù)據(jù)采集與匹配

1.1 試驗設計

試驗于2021年8月4—9日在西北農(nóng)林科技大學南校區(qū)科研溫室進行。以辣椒幼苗(加長六號)為試驗材料，挑選長勢一致的四葉一心辣椒幼苗40株作為試驗對象。為避免強光直曬葉片，試驗期間對溫室進行遮光處理。試驗共設置4個水分梯度，將含水率控制在田間含水率的60%～80%(對照組)、40%～60%(輕度脅迫)、20%～40%(中度脅迫)和0～20%(重度脅迫)，每組選取10株長勢相近的幼苗，為試驗提供Fv/Fm數(shù)值不同的葉片。采用土壤水分傳感器(GHHB-001-485型，威海晶合數(shù)字礦山技術(shù)有限公司)連續(xù)監(jiān)測各組土壤含水率，確保土壤含水率始終在設置范圍內(nèi)。為排除植株個體差異，采集數(shù)據(jù)前剔除長勢最好和最差的各1株幼苗，隨機選取剩余幼苗的一片功能葉，每天測量同一葉片上的高光譜和Fv/Fm數(shù)據(jù)，由于測量Fv/Fm數(shù)據(jù)需將葉片摘下，故每株幼苗只測量一次。

1.2 高光譜數(shù)據(jù)采集

RENSONON PikaXC2為本試驗的高光譜成像設備，在圖1所示的高光譜成像系統(tǒng)中采集高光譜數(shù)據(jù)。相機光譜范圍為392.34～1 009.43 nm，光譜分辨率為1.3 nm。設置曝光時間為19.83 ms、增益系數(shù)為5、幀率為28 f/s、掃描行數(shù)為700，高光譜圖像分辨率為700像素×1 600像素。數(shù)據(jù)采集計算機配置為：CPU i7-7700hq、GPU GTX1070、16 GB 2 400 MHz內(nèi)存和512 GB Intel 760P SSD硬盤。光譜圖像校正、處理、分析均使用Matlab R2014a 軟件。

圖1 高光譜成像系統(tǒng)Fig.1 Hyperspectral imaging system1.載物臺 2.測試架 3.鎢鹵素燈光源 4.燈架 5.鏡頭 6.高光譜成像儀 7.數(shù)據(jù)采集計算機 8.辣椒樣本

試驗于每日17：00開始測量，為降低環(huán)境光影響，測量時關(guān)閉室內(nèi)其他光源，將葉片葉柄固定在載物臺上進行活體測量，載物臺與鏡頭固定距離為60 cm。為降低相機暗電流噪聲對光譜圖像質(zhì)量的影響，預熱光源30 min[13]后對光譜數(shù)據(jù)進行黑白校準[14]。在上述條件下，獲取標準白板的高光譜圖像數(shù)據(jù)記為W，蓋上鏡頭蓋測得暗電流記為B，原始高光譜圖像校正公式為

(1)

式中I——原始辣椒葉片光譜數(shù)據(jù)

R——校正后的辣椒葉片光譜數(shù)據(jù)

1.3 葉綠素熒光數(shù)據(jù)采集

葉綠素熒光成像設備采用捷克PSI公司的FC800，圖像分辨率設置為520像素×696像素，調(diào)節(jié)焦距直至葉片清晰，在正式試驗前使用健康葉片確定最佳參數(shù)[15]，設定參數(shù)為Act1 100% 、Super 40%、Act2 20%、Shutter 20 μs、Sensitivity 40%。為降低環(huán)境光影響，熒光數(shù)據(jù)于每日18：00開始采集，測量時關(guān)閉室內(nèi)其他光源，將測量設備用黑布遮蔽。經(jīng)過30 min暗適應后，摘下葉片離體測量Fv/Fm圖像，完成測量后保存Fv/Fm的灰度圖像。

1.4 高光譜圖像與Fv/Fm圖像匹配

如圖2所示，在高光譜圖像與Fv/Fm圖像中各手動選擇兩個區(qū)域。在每個區(qū)域內(nèi)的邊緣上尋找使葉片全部邊緣匹配誤差最小的2組特征點，將其像素坐標分別記為O1=(x1,y1)、O2=(x2,y2)(高光譜圖像坐標系下)，O′1=(x′1,y′1)、O′2=(x′2,y′2)(Fv/Fm圖像坐標系下)，由高光譜圖像坐標系向Fv/Fm圖像坐標系的坐標轉(zhuǎn)換計算過程為

圖2 圖像匹配方式示意圖Fig.2 Schematic of image matching

O′i=m(Oi-O1)Rot+O′1

(2)

(3)

(4)

(5)

式中m——縮放系數(shù)Rot——旋轉(zhuǎn)矩陣

θ——旋轉(zhuǎn)角

Oi——高光譜圖像中葉片除邊緣外的任意像素點向量

O′i——Fv/Fm圖像中葉片除邊緣外的任意像素點向量

由于高光譜圖像分辨率高于Fv/Fm圖像分辨率，匹配后高光譜像素坐標會出現(xiàn)小數(shù)，為降低噪聲影響，以Fv/Fm像素坐標為基準，將相對坐標距離小于0.5的多個高光譜像素點計算均值后對應一個Fv/Fm圖像像素位置。

1.5 基于SPA的特征波長提取及模型構(gòu)建

由于高光譜數(shù)據(jù)維度很高，且存在大量無關(guān)數(shù)據(jù)，因此需要進行特征波段提取[16-17]，以每個對應像素點的光譜數(shù)據(jù)為輸入，F(xiàn)v/Fm值為輸出，使用連續(xù)投影算法(SPA)提取特征波長。該算法是一種前向特征波長提取算法，可以分析向量的投影，其選出的特征波長具有共線性最小、冗余信息最少等特征[18-19]。在提取特征波長后通過偏最小二乘回歸(PLSR)、分析誤差反向傳播(BP)神經(jīng)網(wǎng)絡、徑向基函數(shù)(RBF)神經(jīng)網(wǎng)絡不同算法構(gòu)建模型，以決定系數(shù)R2、均方根誤差(RMSE)兩個參數(shù)作為模型的評價指標，對比建模效果來確定最優(yōu)的建模算法。

2 研究方法與驗證

2.1 試驗

本次試驗共進行6 d，每天每組辣椒幼苗的生理狀態(tài)均有差異，在第6天時重度脅迫組所有葉片已經(jīng)褶皺且邊緣卷曲，故停止試驗。本研究分別選取不同脅迫組下的葉片樣本各6片，獲得了24組Fv/Fm圖像和高光譜圖像，將各Fv/Fm圖像中葉片區(qū)域的全部像素點作為建模樣本，共有96 096個像素點，統(tǒng)計每片葉片的Fv/Fm最大值和最小值，得出Fv/Fm范圍為0.38～0.86。將Fv/Fm圖像中的全部像素點按照含量梯度法[20]以4∶1劃分出訓練集和測試集，得到訓練集樣本76 887個，測試集樣本19 209個。

2.2 Fv/Fm圖像預處理及圖像匹配

原始Fv/Fm圖像中存在椒鹽噪聲，研究使用中值濾波[21]算法削弱噪聲。由圖3a可見，原始Fv/Fm圖像的椒鹽噪聲像素面積很小，故以3×3、5×5、7×7濾波窗進行降噪，結(jié)果如圖3b～3d所示。

圖3 不同濾波窗濾波結(jié)果Fig.3 Filter results of different filter windows

由圖3b可知，3×3濾波窗即可完全濾除背景椒鹽噪聲，而5×5、7×7濾波窗丟失大量葉片圖像細節(jié)信息，因此本文選擇3×3濾波窗對所有Fv/Fm圖像進行中值濾波。

提取高光譜圖像中紅(634 nm)、綠(557 nm)和藍(458 nm)3個波段組成RGB圖像，用大津法(Otsu法)分割(閾值0.107)獲取葉片區(qū)域，而后基于prewitt算子提取葉片邊緣[22]，得到高光譜圖像中的葉片邊緣。由此計算2個坐標轉(zhuǎn)換參數(shù)：縮放系數(shù)(m)和旋轉(zhuǎn)矩陣(Rot)。由式(2)將高光譜圖像像素坐標映射至Fv/Fm圖像，并以高光譜邊緣各點到Fv/Fm圖像葉片邊緣各點的最短距離為匹配誤差。為了直觀顯示葉片邊緣匹配效果，將匹配誤差點用紅色線描繪在表示Fv/Fm圖像邊緣的藍線上，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 高光譜圖像與Fv/Fm圖像匹配結(jié)果Fig.4 Spectral image and chlorophyll fluorescence image matching result

統(tǒng)計各幅圖像的匹配誤差，其中最大匹配誤差為2像素點，最小為0像素點，最大RMSE為0.58像素點，最小RMSE為0.46像素點。表明其葉片邊緣匹配較為準確，可滿足后續(xù)的建模需求。

2.3 數(shù)據(jù)預處理及基于SPA的特征波長選取

高光譜原始數(shù)據(jù)存在隨機噪聲[23]，導致原始高光譜圖像存在無關(guān)信息，會影響Fv/Fm預測模型的精度，所以需要對原始光譜圖像進行預處理。本文分別使用標準正態(tài)變換(SNV)、多元散射校正(MSC)和Savitzky-Golay卷積平滑(SG)3種預處理方法對原始光譜數(shù)據(jù)進行預處理，以實現(xiàn)消除隨機噪聲和表面散射并保留光譜有效信息的目的[24]。在此基礎上以SPA算法篩選特征波長，通過對比特征波長數(shù)量、決定系數(shù)和均方根誤差3個參數(shù)確定最優(yōu)預處理算法，結(jié)果如表1所示。

表1 3種預處理算法結(jié)果Tab.1 Three preprocessing algorithm results

在3種預處理算法中，篩選出的特征波長數(shù)量近似，但是使用不同算法的精度相差較大。其中，SG算法平滑濾波效果相對較好，訓練集和測試集的R2均為0.819，而RMSE均為0.018，其測試集R2比SNV算法和MSC算法分別提高了8.5%和8.3%，RMSE分別降低了21.7%和14.3%。相比之下，SVN與MSC算法的效果較差，兩者的R2略高于0.750，而RMSE在0.020以上。主要原因可能是這兩種算法沒有很好地降低光譜中的隨機噪聲。綜合比較3種預處理算法后，選取SG算法對所有原始高光譜數(shù)據(jù)進行預處理。在通過SG-SPA篩選特征波長過程中篩選到第23個特征波長時預測集RMSE為0.018。SPA的特征波長提取結(jié)果如圖5所示。

圖5 SPA算法尋找特征波長結(jié)果Fig.5 Results of characteristic wavelengths selected by SPA algorithm

由圖5a可見，SPA算法共提取出特征波長23個，可見光區(qū)域(400～780 nm)內(nèi)11個，近紅外區(qū)域(780 nm以上)內(nèi)12個，而392～500 nm與900～1 009 nm波段范圍內(nèi)分別有7個和9個特征波長且分布較集中。本文中SPA算法最先提取出的3個特征波長分別為737、692、672 nm，均處于葉綠素熒光光譜的波長范圍(640～850 nm)，葉綠素熒光光譜在690 nm和740 nm附近有兩個波峰[25]，同時這3個特征波長還位于紅邊區(qū)域，而紅邊位置包含豐富的生理信息(如葉綠素含量、含水率等[26])。本文在400～500 nm和600～700 nm之間共存在9個特征波長，而影響植物光合作用的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等光合色素在這個范圍內(nèi)存在多個吸收峰[27]，同時Fv/Fm值與相同環(huán)境下光合速率存在正相關(guān)性[28]，在水分脅迫下葉片的光合作用會被抑制，進而篩選出在這個范圍內(nèi)的特征波長也很可能與此相關(guān)。

2.4 建模結(jié)果與分析

以上述24片葉片非邊緣區(qū)域全部像素點的23個特征波長光譜反射率為輸入，以Fv/Fm值為輸出，分別使用偏最小二乘法回歸、徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡和BP神經(jīng)網(wǎng)絡建立預測模型，選擇以運行10次的決定系數(shù)和均方根誤差來評價模型精度，結(jié)果如表2所示。

表2 不同算法建模結(jié)果Tab.2 Three algorithm modelling results

由表2可知，3個模型中PLSR精度最低，RBF網(wǎng)絡精度略低于BP神經(jīng)網(wǎng)絡，BP神經(jīng)網(wǎng)絡精度最高，其訓練集R2為0.919，RMSE為0.010，測試集R2為0.918，RMSE為0.011。從建模結(jié)果上看使用機器學習模型的訓練集與測試集的精度都得到了明顯提升，這是由于機器學習對于非線性數(shù)據(jù)的擬合效果更佳。

2.5 預測成像結(jié)果

利用全部特征波長建立SG-SPA-BP模型預測辣椒葉片每個像素點的Fv/Fm值，運用偽彩圖渲染生成Fv/Fm分布圖，不同顏色代表其Fv/Fm值，為確定模型在不同F(xiàn)v/Fm范圍內(nèi)的適用性，按照葉片表型分為4組：健康葉片(Fv/Fm均值0.80)、萎蔫葉片(Fv/Fm均值0.76)、萎縮葉片(Fv/Fm均值0.73)和邊緣卷曲葉片(Fv/Fm均值0.67)。每組選擇一片典型葉片進行分析，其Fv/Fm均值分別為0.79、0.75、0.71和0.65。將熒光圖像與高光譜預測圖像進行對比，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 預測結(jié)果Fig.6 Prediction results

圖6中每組中從左至右為葉片RGB圖像、Fv/Fm圖像、高光譜預測圖像和誤差圖像。圖6a顯示健康葉片RGB圖像，葉片舒展無異常，圖6b顯示萎蔫葉片RGB圖像，葉片邊緣完整清晰可見，圖6c顯示萎縮葉片的RGB圖像，邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則形狀內(nèi)部有褶皺，圖6d顯示邊緣卷曲葉片的RGB圖像，邊緣不可見且被葉背遮擋。圖6a、6b為舒展葉片預測結(jié)果，在葉片邊緣區(qū)域預測誤差較大，剔除邊緣像素點后預測結(jié)果較為準確，最大誤差為0.073，最小誤差為0.008，RMSE為0.009。圖6c中由于萎縮葉片上出現(xiàn)起伏，造成了整體誤差偏大，最大誤差為0.045，最小誤差為0.008，RMSE為0.010。圖6d中由于邊緣卷曲葉片大部分葉片邊緣被葉背遮擋，所以預測結(jié)果有較大的誤差，其最大誤差為0.138，而其他區(qū)域可以準確預測，最小誤差為0.008，RMSE為0.012。統(tǒng)計全部24片葉片，在去除邊緣后其預測誤差的RMSE為0.010，由此實現(xiàn)了高光譜圖像對Fv/Fm圖像的準確預測。

3 結(jié)論

(1)通過尋找邊緣特征點和坐標變換的方式實現(xiàn)了高光譜圖像與Fv/Fm圖像的匹配，最大匹配誤差為2像素點，最小為0像素點，所有圖像中最大均方根誤差為0.58像素點，最小均方根誤差為0.46像素點。

(2)對比了MSC、SNV、SG 3種不同光譜預處理算法，并使用SPA算法篩選特征波段。其結(jié)果表明SG算法的預處理效果最好，其測試集R2比SNV算法和MSC算法分別提高了8.5%和8.3%，RMSE分別降低了21.7%和14.3%。

(3)分別使用PLSR、RBF和BP算法對比建模精度，發(fā)現(xiàn)以BP神經(jīng)網(wǎng)絡算法建立的模型預測效果相對較好，其測試集R2為0.918、RMSE為0.011。相較PLSR算法R2提高了12.1%，RMSE降低了38.9%。上述結(jié)果表明使用機器學習算法可明顯提高模型的預測精度。

(4)通過4組不同F(xiàn)v/Fm均值的葉片，分析了水分脅迫下葉片表型明顯變化時的預測誤差。在受到嚴重干旱脅迫時，葉片明顯卷曲狀態(tài)下的預測誤差最大，為0.138。但在葉片非邊緣區(qū)域預測誤差相對較小，全部24幅圖像在去除邊緣后的預測誤差的RMSE為0.010。