王晨璽，鄧 霞，趙志聰，蔡珍生，張盼盼，李 蓮，李昊翔，趙 麗，王 東，楊 玲，袁國躍

PTG隸屬于蛋白質(zhì)磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)家族，編碼調(diào)節(jié)亞單位3C。PP1全酶由一個催化亞基和一個調(diào)節(jié)亞基組成[1]，通過催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子去磷酸化而發(fā)揮作用[2]。GenBank顯示，PTG在人類和小鼠中分別定位于10號及19號染色體，cDNA全長1 499 bp，編碼285個氨基酸殘基。PTG在小鼠多種組織器官中均有表達(dá)，參與宮頸癌、腎細(xì)胞癌和前列腺癌[3-5]等腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，并能夠在肝細(xì)胞中顯著增加糖原的合成與儲存[6]，參與全身能量代謝調(diào)控[7]。Lu et al[8]研究發(fā)現(xiàn)，PTG沉默可降低空腹血糖和胰島素水平，改善胰島素敏感性，在糖原和脂質(zhì)能量平衡中起橋梁作用。該研究旨在構(gòu)建并鑒定小鼠 PTG基因重組過表達(dá)腺病毒載體，為深入研究PTG的功能及其在糖脂代謝中作用的具體機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及菌株 本實(shí)驗(yàn)所用的HEK293T細(xì)胞系由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌科實(shí)驗(yàn)室同仁惠贈。

1.1.2工具酶及主要試劑 本課題組從上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司購入質(zhì)粒載體pDC315、GV314 載體體系、pCDNA3.1及BamHⅠ/AgeⅠ內(nèi)切酶。本實(shí)驗(yàn)中所用到的其他限制性內(nèi)切酶從NEB公司購買；1 kp DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物從Fermentas公司購買；250 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物從捷瑞公司購買；In-FusionTMPCR克隆試劑盒由Clontech公司提供；Taq聚合酶由Sino Bio公司提供；dNTP購自TaKaRa公司。本實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)粒抽提試劑盒由Promega公司提供，上海捷瑞生物工程公司合成及提供本實(shí)驗(yàn)所用全部引物。質(zhì)粒的測序工作由美季生物技術(shù)公司完成，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由北京天根生化公司提供。TRIzol 購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量試劑盒購自諾唯贊公司。RIPA、蛋白酶抑制劑以及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司。DMEM及谷氨酰胺購自Gibco公司，胎牛血清及含有Flag標(biāo)簽的一抗購自Sigma公司，二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1含有小鼠PTG基因質(zhì)粒的構(gòu)建 首先，從293T細(xì)胞中提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。根據(jù)基因庫中公布的小鼠PTG基因(NM_016854)全長的mRNA序列，運(yùn)用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)PTG克隆引物，交由生工生物工程有限公司合成，將該引物含有的目的基因5′ 端部分序列用于PCR釣取目的基因，上游序列：5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCTGCACCAGAATG-3′；下游序列：5′-TCCTTGTAGTCCATACCTCGATAGGAGGTCA AGTTC-3′。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到目的基因片段，BamH Ⅰ/Age Ⅰ 酶切后，將其連接至質(zhì)粒載體p CDNA3.1(-)。反應(yīng)條件：5 μl 10×緩沖液，0.5 μl 100×BSA，2 μl純化的DNA質(zhì)粒(濃度為1 g/L)，1 μl BamH Ⅰ(濃度為20 U/μl)，1 μl AgeⅠ(濃度為20 U/μl)，最后加雙蒸水40.5 μl將總體系補(bǔ)足至50 μl。此后將按以上步驟混合得到的反應(yīng)物放置于37 ℃環(huán)境中，時間為2 h。

1.2.2重組穿梭質(zhì)粒pGV314-PTG的構(gòu)建 將酶切后的產(chǎn)物交換入線性化表達(dá)載體GV314中得到重組穿梭質(zhì)粒pGV314-PTG。BamH Ⅰ/Age Ⅰ 酶切載體GV314進(jìn)行線性化，之后將酶切得到的產(chǎn)物與目的基因產(chǎn)物片段進(jìn)行交換，反應(yīng)體系如下：2 μl線性化載體DNA(濃度為100 mg/L)，2 μl目的基因產(chǎn)物(濃度為100 mg/L)，0.5 μl In-Fusion交換酶，2 μl 10×交換酶緩沖液，13.5 μl雙蒸水。于25 ℃條件下反應(yīng)30 min，42 ℃條件下反應(yīng)15 min。轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，隨后將其轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板上倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37 ℃，計(jì)時16 h。對長出的菌落用PCR法進(jìn)行鑒定，將空載設(shè)置為陰性對照組，將純化的GAPDH基因的PCR產(chǎn)物設(shè)置為陽性對照組。GV314載體PCR引物序列如下，上游序列為5′-AGCTTTGAGAAGAAGGTTCAGG-3′，下游序列為5′- CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。反應(yīng)體系：1 μl模板，上游和下游引物(濃度為10 μmol/L)各0.4 μl，4 μl 5×Taq緩沖液，1.6 μl d NTPs(濃度為2.5 mmol/L)，0.2 μl Taq聚合酶，12.4 μl雙蒸水。反應(yīng)條件：在94 ℃條件下預(yù)變性3 min，94 ℃條件下變性30 s，60 ℃條件下退火30 s，72 ℃條件下延長40 s，再次穩(wěn)定延伸5 min，將此過程循環(huán)30次。隨后將PCR后得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， PCR產(chǎn)物約為481 bp，之后進(jìn)行陽性菌接種，放置于37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)16 h。隨后利用甘油菌對其進(jìn)行保存，并分裝200 μl以待進(jìn)行后續(xù)的測序和比對分析。

1.2.3腺病毒質(zhì)粒同源重組及鑒定 用含有EDTA的0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的HEK293T細(xì)胞，以得到細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)為4×105個/孔。置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。待細(xì)胞的融合度達(dá)到50%～60%時，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將pGV314-PTG與輔助包裝質(zhì)粒pDC315共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染之前的2 h換液，將原先的舊培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，細(xì)胞換液2 h后開始轉(zhuǎn)染。將DNA 溶液與不含血清的培養(yǎng)基混合均勻，二者混合液總體積為50 μl，其中DNA溶液包含5 μg穿梭質(zhì)粒及5 μg輔助質(zhì)粒，混合后置于室溫條件下溫育5 min。將上述混合后的50 μl培養(yǎng)基與10 μl LipofectamineTM2000混合，再次置于室溫條件下溫育5 min。將前述稀釋后得到的DNA溶液與LipofectamineTM2000混合均勻，注意動作輕柔，避免振蕩，隨后放置于室溫條件下溫育20 min，以便形成DNA/Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)液中緩慢滴加前述轉(zhuǎn)染復(fù)合物并將其混合均勻，隨后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后將含有轉(zhuǎn)染混和物的原有舊培養(yǎng)基棄去，向其中加入PBS溶液2 ml，輕柔晃動，洗去殘余的轉(zhuǎn)染混合物后將溶液倒棄，再向其中緩慢加入5 ml含有10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，注意每天定期觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長狀況，如果發(fā)現(xiàn)有培養(yǎng)基明顯發(fā)黃的情況，需酌情向其中補(bǔ)加適量的新鮮培養(yǎng)液。最后，利用Cre/Lox P重組酶系統(tǒng)的作用以產(chǎn)生重組過表達(dá)腺病毒，并將該重組過表達(dá)腺病毒命名為Ad-PTG。成功轉(zhuǎn)染之后24 h可通過熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染之后36 h收集細(xì)胞并用相應(yīng)試劑提取總蛋白，以待后續(xù)進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.4重組過表達(dá)腺病毒的包裝、擴(kuò)增與純化 用PacⅠ 酶切線性化Ad-PTG質(zhì)粒，并進(jìn)行抽提以及乙醇沉淀回收等步驟后測定其含量與純度，將其轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，此后每日觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的狀態(tài)及生長情況。持續(xù)觀察約10～15 d，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變圓、壞死等典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，且有約50%的細(xì)胞脫壁現(xiàn)象出現(xiàn)時，提示腺病毒包裝成功。用低速離心方法收集細(xì)胞，吸取2 ml的 DMEM并將收集的細(xì)胞重懸于其中，在液氮和37 ℃水浴的條件下將此前制成的細(xì)胞懸液反復(fù)凍融4次后，于4 ℃以7 900 r/min低溫離心5 min，離心后產(chǎn)物有明顯的分層，收集離心后的病毒上清液，將其放置于-80 ℃冰箱中保存。用上述方法反復(fù)感染和收集之后，取病毒上清液再一次感染HEK293T細(xì)胞，從而可以實(shí)現(xiàn)數(shù)輪擴(kuò)增的目的。

用Adeno-XTM病毒純化試劑盒按照步驟將最終收集到的PBS重懸病毒上清液純化重組過表達(dá)腺病毒，分裝已純化的重組過表達(dá)腺病毒，放置于 -70 ℃ 冰箱中保存以備后續(xù)使用。

1.2.5終點(diǎn)稀釋法測定腺病毒滴度 對已獲得的純化重組過表達(dá)腺病毒進(jìn)行滴度測定，具體采用的方法為終點(diǎn)稀釋法，在實(shí)驗(yàn)開始前24 h于96孔板中接種HEK293T細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)每孔約1×103個)。倍比稀釋重組過表達(dá)腺病毒液至10-6～10-13，并用其感染HEK293T細(xì)胞，隨后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間持續(xù)觀察細(xì)胞CPE病變的情況，并對細(xì)胞CPE病變孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出每一行的陽性率。用Spearman-Karber Method計(jì)算所測樣本的病毒顆粒滴度，公式如下：病毒樣品的滴度=10(x+0.8) (PFU/ml)，其中x為10-1～10-13中所有稀釋度下細(xì)胞CPE病變陽性率的總和。

1.2.6熒光定量PCR 將成功構(gòu)建的Ad-PTG轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，并使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA, 后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到相應(yīng)cDNA并進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。用GraphPad 8.0.1分析結(jié)果。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 將成功構(gòu)建的Ad-PTG轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，提取蛋白并測定其濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，將之前所提取的蛋白樣品及蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照物按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的順序依次在相應(yīng)泳道上樣。首先設(shè)定電壓為90 V，20～25 min待樣品跑至下層膠后，調(diào)整電壓至120 V，繼續(xù)恒定電壓電泳1 h左右待樣品跑至底部。將PVDF膜置于甲醇中激活約1 min，隨后把PVDF膜、濾紙和電泳后的凝膠按照裝配要求組裝成三明治結(jié)構(gòu)，固定放置于轉(zhuǎn)膜裝置內(nèi)，并于4 ℃恒定電流120 mA轉(zhuǎn)膜4 h。轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜完全浸沒于5%脫脂奶粉封閉液中，在搖床上于室溫條件下低速封閉1 h。封閉結(jié)束后裁剪至合適大小，浸沒于一抗(1 ∶1 000)稀釋液中，于4 ℃環(huán)境中搖床低速孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后用1×TBST緩沖液洗滌，將PVDF膜浸沒于二抗(1 ∶5 000)稀釋液中搖床室溫下孵育1 h。1×TBST緩沖液中洗滌后用ECL發(fā)光液曝光以待后續(xù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0及GraphPad 8.0.1統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增PTG目的片段酶切連接目的基因的p CDNA3.1質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，結(jié)果顯示：在995 bp附近處有亮帶，與目的基因片段長度一致，表明帶有PTG基因的p CDNA3.1 質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 PTG目的片段電泳圖1：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；2：PCR產(chǎn)物

2.2 重組穿梭質(zhì)粒p GV314-PTG的PCR鑒定運(yùn)用In-Fusion克隆技術(shù)得到p GV314-PTG的重組穿梭質(zhì)粒，采用隨機(jī)的方法從中挑選出8個陽性單克隆菌，并用菌斑PCR技術(shù)對其進(jìn)行鑒定及驗(yàn)證(圖2)。

圖2 PCR鑒定p GV 314-PTG重組穿梭質(zhì)粒8個陽性克隆1：陰性對照(雙蒸水)；2：陰性對照(空載自連對照組)；3：GAPDH；4：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；5～12：1～8號轉(zhuǎn)化子

2.3 重組質(zhì)粒Ad-PTG的測序鑒定將鑒定出的陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基中，放于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)12～16 h，取適量菌液送至上海生工生物工程有限公司，由其進(jìn)行測序鑒定，經(jīng)比對后證實(shí)與GenBank上的目標(biāo)序列完全一致(圖3)。

圖3 部分重組穿梭質(zhì)粒序列對比結(jié)果

2.4 重組質(zhì)粒Ad-PTG的蛋白表達(dá)將p GV314-PTG與質(zhì)粒p DC315轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后出現(xiàn)EGFP表達(dá)(圖4)，轉(zhuǎn)染36 h后用Western blot法檢測到在37 ku處有特征性條帶(圖5)。其大小與目的蛋白大小一致，說明重組蛋白融合表達(dá)正確。

圖5 蛋白質(zhì)印跡鑒定重組質(zhì)粒Ad-PTG轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞PTG的表達(dá)1：陽性對照組；2：SURVIVIN-3FLAG-GFP蛋白表達(dá)組；3：Ad-PTG轉(zhuǎn)染組

2.5 重組獲得過表達(dá)腺病毒Ad-PTG及滴度測定重組過表達(dá)腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞10～15 d時，細(xì)胞部分出現(xiàn)CPE細(xì)胞病態(tài)反應(yīng)，細(xì)胞病變范圍漸漸增大，部分細(xì)胞逐漸從培養(yǎng)皿上脫落，提示已經(jīng)成功包裝重組過表達(dá)腺病毒。反復(fù)感染，收集細(xì)胞并凍融數(shù)次后，收集到大量的病毒上清液，純化重組過表達(dá)腺病毒，經(jīng)終點(diǎn)稀釋法計(jì)算得到病毒滴度值為4×1010PFU / ml。

2.6 重組過表達(dá)腺病毒上調(diào)肝細(xì)胞中PTG的表達(dá)將成功構(gòu)建的Ad-PTG轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組相比，Ad-PTG組PTG的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖6)。

圖6 PTG重組過表達(dá)腺病毒的驗(yàn)證與Ad-GFP組比較：****P<0.000 1

3 討論

糖尿病是一種由多種原因引起的慢性高血糖為特征的代謝性疾病，其中90%為2型糖尿病。迄今為止，2型糖尿病已經(jīng)發(fā)展成為以高血糖為主要特征的全球性公共衛(wèi)生問題。肝臟胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)[9]，胰島素抵抗是指細(xì)胞不能有效利用胰島素，即施以正常劑量的胰島素之后僅能產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種異常生理狀態(tài)，包括胰島素的靶器官對胰島素的敏感性和(或)反應(yīng)性下降。胰島素抵抗最明顯的病理生理特點(diǎn)包括糖原分解功能、糖異生以及脂代謝環(huán)節(jié)發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致肝糖輸出增多和肝臟脂肪的積聚。因此，有效地抑制肝臟葡萄糖的產(chǎn)生與輸出以及減少肝臟脂肪的積聚，是治療胰島素抵抗與2型糖尿病的重要靶標(biāo)之一，深入探求肝臟糖代謝與脂代謝調(diào)控的分子機(jī)制已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

在本課題組前期進(jìn)行的芯片篩選中，PTG引起了本課題組的注意。眾所周知，蛋白質(zhì)磷酸化在調(diào)節(jié)肝臟糖異生中起著關(guān)鍵作用。PP1是在真核細(xì)胞中豐富表達(dá)的一種磷酸酶，其可通過催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化而發(fā)揮作用[2]。在調(diào)節(jié)糖原代謝中，催化亞基PP1C通過一組糖原靶向調(diào)節(jié)亞基(G亞基)錨定于糖原顆粒，通過PP1介導(dǎo)的去磷酸化調(diào)節(jié)糖原代謝酶的活性[1, 10-11]。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，有7個編碼G亞基的基因，PTG基因是其中的一種，編碼蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞單位3C，其在糖代謝與脂代謝中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。PTG不僅可將PP1定位于糖原顆粒，還可直接與糖原合酶和磷酸化酶結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)糖原代謝的有效調(diào)控[12]。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，PTG基因雜合缺失的小鼠，這些小鼠的脂肪組織、肝臟、心臟和骨骼肌中的糖原儲存減少，相應(yīng)的糖原合酶活性以及糖原合成率降低[7]。此外，PTG沉默小鼠可以防止高脂誘導(dǎo)的肝糖原積聚，降低空腹血糖和胰島素水平，從而改善胰島素敏感性；而哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)及膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)可作用于PTG啟動子，調(diào)節(jié)PTG的轉(zhuǎn)錄影響糖原的代謝，而糖原的積聚可通過反饋調(diào)節(jié)SREBP1，從而影響脂肪代謝，建立了肝臟糖代謝與脂代謝之間的相互對話，調(diào)節(jié)了能量的平衡。以上研究結(jié)果表明，PTG在糖代謝與脂代謝中起著關(guān)鍵作用，并且對于維持糖原和脂質(zhì)之間燃料底物分配的代謝平衡是必要的[8]。

為了深入地探索PTG的功能及其參與糖代謝與脂代謝中具體的作用機(jī)制，本課題組成功構(gòu)建出PTG的重組過表達(dá)腺病毒載體。采用能夠表達(dá)較大的外源基因片段的腺病毒穿梭載體GV314，該載體具有廣泛的宿主范圍，分裂以及非分裂細(xì)胞均可被其感染。且該載體還具有病毒滴度高和方便濃縮儲存等優(yōu)點(diǎn)，同時還具有較高的安全性，是將外源性基因?qū)胨拗骷?xì)胞時所采用的重要載體之一。本研究將攜帶腺病毒基因組與外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，通過Cre/lox P重組酶系統(tǒng)得到重組過表達(dá)腺病毒，并進(jìn)一步通過Western blot、熒光定量PCR以及測序等方法驗(yàn)證，表明PTG重組過表達(dá)腺病毒構(gòu)建成功。