閔愛萍,許洪梅,馮 欣,羅 曉,梁瓊?cè)A
(樂山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,四川樂山 614000)
胚胎停育是指妊娠早期胚胎因某種原因所致發(fā)育停滯,B 超表現(xiàn)為妊娠囊內(nèi)胎芽或胎兒形狀不整,無胎心搏動(dòng),或表現(xiàn)為枯萎囊。胚胎停育的病因和發(fā)病機(jī)制都與流產(chǎn)相似,臨床稱之謂稽留流產(chǎn)(MAB)又稱過期流產(chǎn),指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出[1],約占臨床的15%~20%,導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的風(fēng)險(xiǎn)增加,可發(fā)生多次成為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA),嚴(yán)重影響孕婦身心健康。常見病因有胚胎染色體異常、解剖異常、內(nèi)分泌異常、感染因素、自身免疫因素等[2]。目前檢測(cè)胚胎染色體異常的方法眾多,染色體微陣列(CMA)是一種先進(jìn)的遺傳學(xué)檢測(cè)方法,已被國際細(xì)胞遺傳協(xié)作組推薦為檢測(cè)先天性發(fā)育障礙以及先天畸形的首選方法。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)(NGS)檢測(cè)稽留流產(chǎn)胚胎及絨毛組織染色體DNA拷貝數(shù),同時(shí)收集患者的一般資料和相關(guān)原因,旨對(duì)再次妊娠者采取針對(duì)性的孕前優(yōu)生指導(dǎo)[3]。
收集2015 年12 月-2020 年1 月在我院稽留流產(chǎn)患者流產(chǎn)組織樣本100 例,其中1 次稽留流產(chǎn)者37例,≥2次者63例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)流產(chǎn)或引產(chǎn)前B超檢查提示胚胎或胎兒停止發(fā)育;(2)超聲提示無胎心搏動(dòng);(3)孕周<37周;(4)經(jīng)醫(yī)院科技委員會(huì)(No.[2016]11號(hào))和倫理委員會(huì)(No.[2016]38號(hào))通過;(5)患者知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)已知有家族性基因遺傳疾病;(2)計(jì)劃不再生育者;(3)樣本不合格;(4)患者及家屬放棄檢測(cè)?;颊吣挲g為20~42 歲,平均年齡(29.0±4.84)歲,胚胎停育孕周為孕6+5~36+5周。收集夫妻雙方一般資料,包括婚育史、孕產(chǎn)史、不良妊娠史、月經(jīng)情況、孕期保胎藥物使用情況、有毒有害物質(zhì)接觸情況、周圍環(huán)境情況、孕期心理情緒等。
胚胎或胎兒NGS 染色體結(jié)果,患者口腔黏膜細(xì)胞葉酸代謝關(guān)鍵酶基因[5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T位點(diǎn)和A1298C位點(diǎn),甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)基因A66G 位點(diǎn)]、血清同型半胱氨酸(HCY)、凝血與纖溶指標(biāo)、甲狀腺功能、性激素、免疫相關(guān)抗體、TROCH[幾種病原微生物的英文名稱縮寫,其中T(Toxoplasma)是弓形蟲,O(Others)是其他病原微生物,如梅毒螺旋體、帶狀皰疹病毒、細(xì)小病毒B19、柯薩奇病毒等,R(Rubella.Virus)是風(fēng)疹病毒,C(Cytomegalo.Virus)是巨細(xì)胞病毒,H(Herpes.Virus)即是單純皰疹Ⅰ/Ⅱ型]。夫妻外周血G顯帶核型分析結(jié)果,丈夫精液檢查等相關(guān)指標(biāo)。
使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
有效樣本100 例?;颊吣挲g:20~25 歲25 例,26~30歲40例,31~35歲26例,≥36歲9例;孕周:<12周94例,12~28 周5 例,>28 周1 例;流產(chǎn)次數(shù):1 次53 例,2次40例,≥3次7例。
將孕期胚胎停育流產(chǎn)組織樣本依年齡分為4 組,其中20~25 歲13 例,26~30 歲21 例,31~35 歲13 例,≥36 歲7 例,4 組染色體異常發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.292,P>0.05)。
稽留流產(chǎn)1次者37例,其中胚胎染色體異常20例(54.1%);稽留流產(chǎn)≥2次患者63例,其中胚胎染色體異常34例(54.0%),兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
100 例送檢樣本染色體數(shù)目異常52 例(52.0%),結(jié)構(gòu)異常2 例(2.0%);染色體非整倍體率為96.3%(52/54)。常染色體三體37例,以16、4、22、13、X號(hào)染色體高發(fā)。13-三體并21-三體并22-三體1 例,8-單體并22-三體1 例,1-單體并3-三體1 例。性染色體數(shù)目異常6例,結(jié)構(gòu)異常1例,常染色體合并性染色體異常2 例,嵌合體5 例,三倍體5 例,其中1 例72,XXX 三倍體,無染色體數(shù)目異常,僅有結(jié)構(gòu)異常。1 例92XXXX四倍體除外其余均檢測(cè)出非整倍體,染色體片段≤5 Mb 的結(jié)構(gòu)異常發(fā)生率占陽性標(biāo)本比例為3.7%(2/54),其中以染色體結(jié)構(gòu)重復(fù)為主,缺失次之。
100 例稽留流產(chǎn)樣本中54 例胚胎染色體異常,其中42 對(duì)夫妻進(jìn)行染色體核型檢查,顯示染色體核型異常的妻子有6例、丈夫有3例,夫妻雙方染色體核型均異常的有1 例,由夫妻染色體異常導(dǎo)致的胚胎染色體異常比例低,僅為18.5%(10/54)。見表1。
表1 胚胎染色體異常與夫妻染色體異常情況
檢索染色體變異已知綜合征和病例數(shù)據(jù)庫(ClinGen、Decipher 數(shù)據(jù)庫)、遺傳病、性狀和基因的數(shù)據(jù)庫(OMIM 數(shù)據(jù)庫)、正常人染色體拷貝數(shù)數(shù)據(jù)庫(DGV 數(shù)據(jù)庫)。共檢出微重復(fù)(<10 Mb)9 例,占16.7%(9/54)??截悢?shù)變異(CNV)84例,致病CNV 有65個(gè)(占77.4%)。
收集100 例孕婦的相關(guān)病史和資料,其他影響因素有:不良環(huán)境因素82例,丈夫精液異常12例占60%(僅有20例男性精液檢測(cè)),TROCH43例,纖維蛋白原增高32 例,HCY>8 的31 例,葉酸代謝關(guān)鍵酶基因異常27 例,甲狀腺功能異常12 例,自身免疫異常10 例,解剖因素9 例,葡萄糖耐量異常8 例,鐵蛋白低下7例,內(nèi)科合并癥4例,多囊卵巢綜合征3例,內(nèi)異癥、地中海貧血與卵巢功能減退均為2例,腮腺炎1例。
胚胎染色體異常是稽留流產(chǎn)最常見的原因,是生殖細(xì)胞受到干擾導(dǎo)致染色體不分離或突變引起的[4],不一定是垂直遺傳。胚胎死亡和自然流產(chǎn)是優(yōu)勝劣汰的自然選擇,80%以上發(fā)生在妊娠12 周前,流產(chǎn)發(fā)生越早,其胚胎染色體異常的發(fā)生率越高[5],大多數(shù)為染色體數(shù)目異常,少部分為染色體結(jié)構(gòu)異常[6]。目前沒有任何一種染色體檢測(cè)方法是完美的。近年來NGS 技術(shù)用于檢測(cè)流產(chǎn)組織的非整倍體和CNV,能發(fā)現(xiàn)未知改變,為臨床精準(zhǔn)診療提供了新的思路和方法[7],被廣泛推崇,但不能發(fā)現(xiàn)染色體平衡易位、倒位或點(diǎn)突變及染色體整倍體。
本研究運(yùn)用NGS 技術(shù)對(duì)100 例稽留流產(chǎn)患者的流產(chǎn)組織進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示≤30 歲稽留流產(chǎn)發(fā)生率占65%,發(fā)生在孕12 周前自然流產(chǎn)發(fā)生率占94%,從本組數(shù)據(jù)得出首次稽留流產(chǎn)與≥2 次稽留流產(chǎn)患者胚胎染色體異常比例相當(dāng)(54.1%vs54.0%)(P>0.05)。本研究三體型與單體型發(fā)生率與既往文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[7],最常見的三倍體主要發(fā)生在16、4、22、X、13號(hào)染色體上,首次稽留流產(chǎn)胚胎X染色體單體和三倍體占比相等,與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8]。組織樣本中檢測(cè)出1 號(hào)與19 號(hào)染色體非整倍體異常,檢測(cè)出此兩種染色體異常的文獻(xiàn)報(bào)道尚少[9]。在染色體異常造成的異常流產(chǎn)性疾病中,主要以染色體結(jié)構(gòu)重復(fù)為主,結(jié)構(gòu)缺失次之,與文獻(xiàn)報(bào)告不一致[10]。由夫妻雙方染色體異常導(dǎo)致的胚胎染色體異常比例低,僅為18.5%(10/54)。檢索文庫得出84 個(gè)致病CNV,可明顯提高異常檢出率[11]。檢測(cè)出樣本微重復(fù)(<10 Mb)9 例,檢索數(shù)據(jù)庫了解相關(guān)的致病基因和可能導(dǎo)致的疾病,這在常規(guī)染色體核型分析中很難或不能被發(fā)現(xiàn),具有重大臨床意義。
葉酸是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)素,可降低自發(fā)性流產(chǎn)。葉酸缺乏將會(huì)導(dǎo)致染色體的損傷、斷裂、姐妹染色體交換頻率增加,脆性位點(diǎn)表達(dá),可致突變和癌變,導(dǎo)致出生缺陷和影響婦女生殖健康。多種酶參與了葉酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,這些酶基因位點(diǎn)突變可引起酶活性的改變,造成葉酸代謝異常,使活性葉酸水平及同型半胱氨酸升高。高同型半胱氨酸血癥可引起血管內(nèi)皮損傷,影響胎盤部位的血管網(wǎng)絡(luò)形成,導(dǎo)致胚胎停育;同時(shí)血液處于高凝狀態(tài),與RSA 的發(fā)生密切相關(guān)[12]。葉酸代謝障礙還可形成甲硫氨酸血癥,抑制DNA 甲基化,造成染色體不分離引起胎兒畸形[13]和各種染色體缺陷病。國內(nèi)外研究表明,葉酸代謝障礙和高同型半胱氨酸血癥的婦女RSA 的發(fā)生率較高[14]。
本研究對(duì)患者口腔黏膜細(xì)胞進(jìn)行葉酸代謝關(guān)鍵酶基因[5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T 位點(diǎn)和A1298C 位點(diǎn),甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)基因A66G 位點(diǎn)]進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)查血清同型半胱氨酸(HCY),發(fā)現(xiàn)27%患者存在以上基因異常,31%患者存在HCY>8,證實(shí)葉酸缺乏和葉酸代謝關(guān)鍵酶基因異常是導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的因素之一。
目前人們還是按照傳統(tǒng)方式補(bǔ)充葉酸,且依從性差。對(duì)于有葉酸代謝障礙的個(gè)體在每天400 μg 葉酸制劑的基礎(chǔ)上增加劑量或許可以彌補(bǔ)該代謝障礙帶來的危害,如目前有探索對(duì)于MTHFR 基因和MTRR基因高風(fēng)險(xiǎn)人群建議葉酸的補(bǔ)充從孕前3 個(gè)月開始服用800 μg/d,并補(bǔ)充維生素B12 2.6 μg/d,持續(xù)至妊娠結(jié)束,對(duì)于曾經(jīng)妊娠過神經(jīng)管畸形的患者葉酸服用需4~5 mg/d。
目前血栓前狀態(tài)引起自然流產(chǎn)越來越受到重視。普遍認(rèn)為,妊娠期高凝狀態(tài)使子宮胎盤部位血流狀態(tài)改變,易形成局部微血栓甚至引起胎盤梗死,血液供應(yīng)下降,胚胎和胎兒缺血缺氧,導(dǎo)致流產(chǎn)。遺憾的是,存在血栓前狀態(tài)的婦女并沒有明顯的臨床表現(xiàn),目前尚缺乏充足的數(shù)據(jù)支撐血栓前狀態(tài)血液指標(biāo)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)有32 例(32.0%)患者存在纖維蛋白原增高的現(xiàn)象,為今后對(duì)該領(lǐng)域的研究提供方向和參考。
內(nèi)分泌因素也是導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)12%患者合并甲狀腺功能異常,以甲狀腺功能低下為主;其他內(nèi)分泌因素包括葡萄糖耐量異常(8.0%)、多囊卵巢綜合征(3.0%)、內(nèi)異癥(2.0%)、卵巢功能減退(2.0%)等。本研究常規(guī)檢查患者的內(nèi)分泌情況,進(jìn)一步明確導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的病因,更好指導(dǎo)治療。
生殖道各種病原體感染以及TROCH 感染與流產(chǎn)的發(fā)生雖有一定的相關(guān)性,但不一定存在因果關(guān)系。本研究顯示43.0%患者存在TROCH抗體異常。
生殖免疫研究表明,流產(chǎn)與免疫功能紊亂有關(guān)。不同因素導(dǎo)致流產(chǎn)的免疫病理變化不盡相同。目前,對(duì)同種免疫型導(dǎo)致的流產(chǎn)仍處于研究階段。鄭玫等[15]研究顯示稽留流產(chǎn)患者血清中IL-6、HIF-1α 和VEGF 水平明顯低于對(duì)照組,而TNF-α 水平明顯高于對(duì)照組,他們認(rèn)為血清IL-6、HIF-1α、VEGF、TNF-α水平可能作為監(jiān)測(cè)稽留流產(chǎn)的潛在標(biāo)志。本研究顯示有10%患者存在自身免疫異常。
不良相關(guān)因素,包括環(huán)境因素和心理因素,如電腦、粉塵、寵物、手機(jī)輻射、辦公電子設(shè)備、煙酒、放射線、甲醛、不良情緒等,甚至孕婦的年齡及肥胖也是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的高危因素。本研究詳細(xì)采集患者的基本信息,發(fā)現(xiàn)82%孕婦存有不良環(huán)境因素,患者再次妊娠時(shí)應(yīng)指導(dǎo)其盡量避免不良因素的干擾。