閔愛萍，許洪梅，馮 欣，羅 曉，梁瓊?cè)A

（樂山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川樂山 614000）

胚胎停育是指妊娠早期胚胎因某種原因所致發(fā)育停滯，B 超表現(xiàn)為妊娠囊內(nèi)胎芽或胎兒形狀不整，無胎心搏動(dòng)，或表現(xiàn)為枯萎囊。胚胎停育的病因和發(fā)病機(jī)制都與流產(chǎn)相似，臨床稱之謂稽留流產(chǎn)（MAB）又稱過期流產(chǎn)，指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出[1]，約占臨床的15%～20%，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）的風(fēng)險(xiǎn)增加，可發(fā)生多次成為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA），嚴(yán)重影響孕婦身心健康。常見病因有胚胎染色體異常、解剖異常、內(nèi)分泌異常、感染因素、自身免疫因素等[2]。目前檢測胚胎染色體異常的方法眾多，染色體微陣列（CMA）是一種先進(jìn)的遺傳學(xué)檢測方法，已被國際細(xì)胞遺傳協(xié)作組推薦為檢測先天性發(fā)育障礙以及先天畸形的首選方法。本研究采用高通量測序技術(shù)（NGS）檢測稽留流產(chǎn)胚胎及絨毛組織染色體DNA拷貝數(shù)，同時(shí)收集患者的一般資料和相關(guān)原因，旨對再次妊娠者采取針對性的孕前優(yōu)生指導(dǎo)[3]。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2015 年12 月－2020 年1 月在我院稽留流產(chǎn)患者流產(chǎn)組織樣本100 例，其中1 次稽留流產(chǎn)者37例，≥2次者63例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)流產(chǎn)或引產(chǎn)前B超檢查提示胚胎或胎兒停止發(fā)育；(2)超聲提示無胎心搏動(dòng)；(3)孕周＜37周；(4)經(jīng)醫(yī)院科技委員會(huì)（No.[2016]11號）和倫理委員會(huì)（No.[2016]38號）通過；(5)患者知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)已知有家族性基因遺傳疾病；(2)計(jì)劃不再生育者；(3)樣本不合格；(4)患者及家屬放棄檢測?；颊吣挲g為20～42 歲，平均年齡（29.0±4.84）歲，胚胎停育孕周為孕6+5～36+5周。收集夫妻雙方一般資料，包括婚育史、孕產(chǎn)史、不良妊娠史、月經(jīng)情況、孕期保胎藥物使用情況、有毒有害物質(zhì)接觸情況、周圍環(huán)境情況、孕期心理情緒等。

1.2 收集指標(biāo)

胚胎或胎兒NGS 染色體結(jié)果，患者口腔黏膜細(xì)胞葉酸代謝關(guān)鍵酶基因[5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T位點(diǎn)和A1298C位點(diǎn)，甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）基因A66G 位點(diǎn)]、血清同型半胱氨酸（HCY）、凝血與纖溶指標(biāo)、甲狀腺功能、性激素、免疫相關(guān)抗體、TROCH[幾種病原微生物的英文名稱縮寫，其中T(Toxoplasma)是弓形蟲，O(Others)是其他病原微生物，如梅毒螺旋體、帶狀皰疹病毒、細(xì)小病毒B19、柯薩奇病毒等，R(Rubella.Virus)是風(fēng)疹病毒，C(Cytomegalo.Virus)是巨細(xì)胞病毒，H(Herpes.Virus)即是單純皰疹Ⅰ/Ⅱ型]。夫妻外周血G顯帶核型分析結(jié)果，丈夫精液檢查等相關(guān)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流產(chǎn)樣本特征

有效樣本100 例?；颊吣挲g：20～25 歲25 例，26～30歲40例，31～35歲26例，≥36歲9例；孕周：＜12周94例，12～28 周5 例，＞28 周1 例；流產(chǎn)次數(shù)：1 次53 例，2次40例，≥3次7例。

2.2 年齡與染色體異常發(fā)生率的關(guān)系

將孕期胚胎停育流產(chǎn)組織樣本依年齡分為4 組，其中20～25 歲13 例，26～30 歲21 例，31～35 歲13 例，≥36 歲7 例，4 組染色體異常發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.292，P＞0.05）。

2.3 流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常發(fā)生率的關(guān)系

稽留流產(chǎn)1次者37例，其中胚胎染色體異常20例（54.1%）；稽留流產(chǎn)≥2次患者63例，其中胚胎染色體異常34例（54.0%），兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 流產(chǎn)組織NGS檢測結(jié)果

100 例送檢樣本染色體數(shù)目異常52 例（52.0%），結(jié)構(gòu)異常2 例（2.0%）；染色體非整倍體率為96.3%（52/54）。常染色體三體37例，以16、4、22、13、X號染色體高發(fā)。13-三體并21-三體并22-三體1 例，8-單體并22-三體1 例，1-單體并3-三體1 例。性染色體數(shù)目異常6例，結(jié)構(gòu)異常1例，常染色體合并性染色體異常2 例，嵌合體5 例，三倍體5 例，其中1 例72，XXX 三倍體，無染色體數(shù)目異常，僅有結(jié)構(gòu)異常。1 例92XXXX四倍體除外其余均檢測出非整倍體，染色體片段≤5 Mb 的結(jié)構(gòu)異常發(fā)生率占陽性標(biāo)本比例為3.7%（2/54），其中以染色體結(jié)構(gòu)重復(fù)為主，缺失次之。

2.5 胚胎與夫妻染色體異常情況

100 例稽留流產(chǎn)樣本中54 例胚胎染色體異常，其中42 對夫妻進(jìn)行染色體核型檢查，顯示染色體核型異常的妻子有6例、丈夫有3例，夫妻雙方染色體核型均異常的有1 例，由夫妻染色體異常導(dǎo)致的胚胎染色體異常比例低，僅為18.5%（10/54）。見表1。

表1 胚胎染色體異常與夫妻染色體異常情況

2.6 拷貝數(shù)變異（CNV）與致病性情況

檢索染色體變異已知綜合征和病例數(shù)據(jù)庫（ClinGen、Decipher 數(shù)據(jù)庫）、遺傳病、性狀和基因的數(shù)據(jù)庫（OMIM 數(shù)據(jù)庫）、正常人染色體拷貝數(shù)數(shù)據(jù)庫（DGV 數(shù)據(jù)庫）。共檢出微重復(fù)（＜10 Mb）9 例，占16.7%（9/54）。拷貝數(shù)變異（CNV）84例，致病CNV 有65個(gè)(占77.4%)。

2.7 其他影響因素

收集100 例孕婦的相關(guān)病史和資料，其他影響因素有：不良環(huán)境因素82例，丈夫精液異常12例占60%(僅有20例男性精液檢測)，TROCH43例，纖維蛋白原增高32 例，HCY＞8 的31 例，葉酸代謝關(guān)鍵酶基因異常27 例，甲狀腺功能異常12 例，自身免疫異常10 例，解剖因素9 例，葡萄糖耐量異常8 例，鐵蛋白低下7例，內(nèi)科合并癥4例，多囊卵巢綜合征3例，內(nèi)異癥、地中海貧血與卵巢功能減退均為2例，腮腺炎1例。

3 討論

3.1 染色體因素

胚胎染色體異常是稽留流產(chǎn)最常見的原因，是生殖細(xì)胞受到干擾導(dǎo)致染色體不分離或突變引起的[4]，不一定是垂直遺傳。胚胎死亡和自然流產(chǎn)是優(yōu)勝劣汰的自然選擇，80%以上發(fā)生在妊娠12 周前，流產(chǎn)發(fā)生越早，其胚胎染色體異常的發(fā)生率越高[5]，大多數(shù)為染色體數(shù)目異常，少部分為染色體結(jié)構(gòu)異常[6]。目前沒有任何一種染色體檢測方法是完美的。近年來NGS 技術(shù)用于檢測流產(chǎn)組織的非整倍體和CNV，能發(fā)現(xiàn)未知改變，為臨床精準(zhǔn)診療提供了新的思路和方法[7]，被廣泛推崇，但不能發(fā)現(xiàn)染色體平衡易位、倒位或點(diǎn)突變及染色體整倍體。

本研究運(yùn)用NGS 技術(shù)對100 例稽留流產(chǎn)患者的流產(chǎn)組織進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示≤30 歲稽留流產(chǎn)發(fā)生率占65%，發(fā)生在孕12 周前自然流產(chǎn)發(fā)生率占94%，從本組數(shù)據(jù)得出首次稽留流產(chǎn)與≥2 次稽留流產(chǎn)患者胚胎染色體異常比例相當(dāng)(54.1%vs54.0%)(P＞0.05)。本研究三體型與單體型發(fā)生率與既往文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[7]，最常見的三倍體主要發(fā)生在16、4、22、X、13號染色體上，首次稽留流產(chǎn)胚胎X染色體單體和三倍體占比相等，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8]。組織樣本中檢測出1 號與19 號染色體非整倍體異常，檢測出此兩種染色體異常的文獻(xiàn)報(bào)道尚少[9]。在染色體異常造成的異常流產(chǎn)性疾病中，主要以染色體結(jié)構(gòu)重復(fù)為主，結(jié)構(gòu)缺失次之，與文獻(xiàn)報(bào)告不一致[10]。由夫妻雙方染色體異常導(dǎo)致的胚胎染色體異常比例低，僅為18.5%（10/54）。檢索文庫得出84 個(gè)致病CNV，可明顯提高異常檢出率[11]。檢測出樣本微重復(fù)（＜10 Mb）9 例，檢索數(shù)據(jù)庫了解相關(guān)的致病基因和可能導(dǎo)致的疾病，這在常規(guī)染色體核型分析中很難或不能被發(fā)現(xiàn)，具有重大臨床意義。

3.2 葉酸代謝關(guān)鍵酶基因和HCY

葉酸是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)素，可降低自發(fā)性流產(chǎn)。葉酸缺乏將會(huì)導(dǎo)致染色體的損傷、斷裂、姐妹染色體交換頻率增加，脆性位點(diǎn)表達(dá)，可致突變和癌變，導(dǎo)致出生缺陷和影響婦女生殖健康。多種酶參與了葉酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，這些酶基因位點(diǎn)突變可引起酶活性的改變，造成葉酸代謝異常，使活性葉酸水平及同型半胱氨酸升高。高同型半胱氨酸血癥可引起血管內(nèi)皮損傷，影響胎盤部位的血管網(wǎng)絡(luò)形成，導(dǎo)致胚胎停育；同時(shí)血液處于高凝狀態(tài)，與RSA 的發(fā)生密切相關(guān)[12]。葉酸代謝障礙還可形成甲硫氨酸血癥，抑制DNA 甲基化，造成染色體不分離引起胎兒畸形[13]和各種染色體缺陷病。國內(nèi)外研究表明，葉酸代謝障礙和高同型半胱氨酸血癥的婦女RSA 的發(fā)生率較高[14]。

本研究對患者口腔黏膜細(xì)胞進(jìn)行葉酸代謝關(guān)鍵酶基因[5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T 位點(diǎn)和A1298C 位點(diǎn)，甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）基因A66G 位點(diǎn)]進(jìn)行檢測，同時(shí)查血清同型半胱氨酸（HCY），發(fā)現(xiàn)27%患者存在以上基因異常，31%患者存在HCY＞8，證實(shí)葉酸缺乏和葉酸代謝關(guān)鍵酶基因異常是導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的因素之一。

目前人們還是按照傳統(tǒng)方式補(bǔ)充葉酸，且依從性差。對于有葉酸代謝障礙的個(gè)體在每天400 μg 葉酸制劑的基礎(chǔ)上增加劑量或許可以彌補(bǔ)該代謝障礙帶來的危害，如目前有探索對于MTHFR 基因和MTRR基因高風(fēng)險(xiǎn)人群建議葉酸的補(bǔ)充從孕前3 個(gè)月開始服用800 μg/d，并補(bǔ)充維生素B12 2.6 μg/d，持續(xù)至妊娠結(jié)束，對于曾經(jīng)妊娠過神經(jīng)管畸形的患者葉酸服用需4～5 mg/d。

3.3 血栓前狀態(tài)

目前血栓前狀態(tài)引起自然流產(chǎn)越來越受到重視。普遍認(rèn)為，妊娠期高凝狀態(tài)使子宮胎盤部位血流狀態(tài)改變，易形成局部微血栓甚至引起胎盤梗死，血液供應(yīng)下降，胚胎和胎兒缺血缺氧，導(dǎo)致流產(chǎn)。遺憾的是，存在血栓前狀態(tài)的婦女并沒有明顯的臨床表現(xiàn)，目前尚缺乏充足的數(shù)據(jù)支撐血栓前狀態(tài)血液指標(biāo)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)有32 例（32.0%）患者存在纖維蛋白原增高的現(xiàn)象，為今后對該領(lǐng)域的研究提供方向和參考。

3.4 內(nèi)分泌因素

內(nèi)分泌因素也是導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)12%患者合并甲狀腺功能異常，以甲狀腺功能低下為主；其他內(nèi)分泌因素包括葡萄糖耐量異常（8.0%）、多囊卵巢綜合征（3.0%）、內(nèi)異癥（2.0%）、卵巢功能減退（2.0%）等。本研究常規(guī)檢查患者的內(nèi)分泌情況，進(jìn)一步明確導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的病因，更好指導(dǎo)治療。

3.5 TROCH

生殖道各種病原體感染以及TROCH 感染與流產(chǎn)的發(fā)生雖有一定的相關(guān)性，但不一定存在因果關(guān)系。本研究顯示43.0%患者存在TROCH抗體異常。

3.6 免疫因素

生殖免疫研究表明，流產(chǎn)與免疫功能紊亂有關(guān)。不同因素導(dǎo)致流產(chǎn)的免疫病理變化不盡相同。目前，對同種免疫型導(dǎo)致的流產(chǎn)仍處于研究階段。鄭玫等[15]研究顯示稽留流產(chǎn)患者血清中IL-6、HIF-1α 和VEGF 水平明顯低于對照組，而TNF-α 水平明顯高于對照組，他們認(rèn)為血清IL-6、HIF-1α、VEGF、TNF-α水平可能作為監(jiān)測稽留流產(chǎn)的潛在標(biāo)志。本研究顯示有10%患者存在自身免疫異常。

3.7 其他

不良相關(guān)因素，包括環(huán)境因素和心理因素，如電腦、粉塵、寵物、手機(jī)輻射、辦公電子設(shè)備、煙酒、放射線、甲醛、不良情緒等，甚至孕婦的年齡及肥胖也是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的高危因素。本研究詳細(xì)采集患者的基本信息，發(fā)現(xiàn)82%孕婦存有不良環(huán)境因素，患者再次妊娠時(shí)應(yīng)指導(dǎo)其盡量避免不良因素的干擾。